एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के साथ फ्लोरोसेंट लेबल माउस ंयूरॉंस मैनुअल छंटाई और डबल इन विट्रो प्रतिलेखन के साथ निरपेक्ष गणना अनुक्रमण (DIVA-Seq)
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन मैनुअल छंटाई प्रक्रिया को अलग करने के लिए एकल फ्लोरोसेंट लेबल इन विट्रो प्रतिलेखन के बाद ंयूरॉंस उच्च गहराई एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए आधारित mRNA प्रवर्धन ।
Abstract
एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) अब जीन अभिव्यक्ति परख के लिए एक व्यापक रूप से कार्यान्वित उपकरण है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एकल-कक्ष आरएनए-अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म सभी इनपुट कक्षों की अंधाधुंध प्रक्रिया करते हैं. कई बार, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग ऊपर की रुचि के विशेष लेबल वाली जनसंख्या को अलग करने के लिए किया जाता है । FACS की एक सीमा काफी लेबल भागों, जो इकट्ठा करने और दुर्लभ या विरल माउस मस्तिष्क से ंयूरॉन आबादी लेबल की रूपरेखा के लिए अव्यावहारिक है के साथ इनपुट कोशिकाओं की उच्च संख्या के लिए की जरूरत है । यहां, हम स्वयं का संग्रह के लिए एक विधि का वर्णन विरल फ्लोरोसेंट एक हौसले से असंबद्ध माउस मस्तिष्क ऊतक से ंयूरॉंस लेबल । यह प्रक्रिया एकल पर कब्जा करने के लिए अनुमति देता है, उच्च शुद्धता और बाद में एक साथ एकीकरण के साथ न्यूरॉन्स लेबल के साथ एक में इन विट्रो परिवर्धन प्रोटोकॉल है कि अंतर्जात प्रतिलिपि अनुपात को बरकरार रखता है. हम एक दोहरे रेखीय प्रवर्धन पद्धति का वर्णन करते है जो व्यक्तिगत mRNA गणना उत्पंन करने के लिए अनंय अणु पहचानकर्ता (UMIs) का उपयोग करती है । एक कोशिका प्रति जीन का पता लगाने के एक उच्च डिग्री में प्रवर्धन परिणामों के दो दौर ।
Introduction
एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) ने transcriptomic अध्ययन बदल दिया है । बड़े पैमाने पर एकल-कक्ष RNAseq, जैसे बूंदों1,2, microfluidics3, nanogrids4, और microwells5के रूप में तकनीकों की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है, अधिकांश विधियाँ निर्धारित कक्ष प्रकार सॉर्ट नहीं कर सकता कि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorophores एक्सप्रेस । किसी कक्ष का चयन करें जनसंख्या को अलग करने के लिए, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) अक्सर लेबल किए गए कक्षों को एकल-कक्ष मोड में सॉर्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, FACS कुछ प्रतिबंध है और सावधानीपूर्वक नमूना संसाधन चरणों की आवश्यकता है । सबसे पहले, इनपुट कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या आम तौर पर (अक्सर कई लाख कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर) की जरूरत है, एक महत्वपूर्ण अंश के साथ (> 15 – 20%) लेबल जनसंख्या युक्त । दूसरा, सेल की तैयारी घनत्व ढाल केंद्रापसारक कदम के कई दौर glial अंश, मलबे को दूर करने की आवश्यकता हो सकती है, और सेल के झुरमुट कि अंयथा नोजल या प्रवाह सेल रोकना हो सकता है । तीसरा, FACS आम तौर पर दाग और जीवित/मृत धुंधला (जैसे, 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium आयोडाइड (PI), और Cytotracker रंजक) है, जो अतिरिक्त समय लेने के लिए कदम दाग को रोजगार । चौथा, दो के लिए अंगूठे का एक नियम के रूप में रंग छँटाई (जैसे DAPI और हरे/लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP/आरएफपी)), आमतौर पर दो नमूने और एक नियंत्रण की जरूरत है, एक unlabeled नमूना वांछित माउस तनाव के अलावा संसाधित किया जा करने की आवश्यकता है । पांचवां, फ़िल्टरिंग अक्सर कई बार किया जाता है पहले और नमूना छंटाई के दौरान लगातार एक FACS मशीन में भरा नमूना लाइनों को रोकने के लिए । छठा, समय सबसे अधिक इस्तेमाल किया FACS setups में शुरू करने और द्रव धारा स्थिर और छोटी बूंद अंशांकन प्रदर्शन करने के लिए आवंटित किया जाना चाहिए । सातवें, नियंत्रण के नमूने आमतौर पर अनुक्रम में वास्तविक नमूना संग्रह करने से पहले चलाने के लिए क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स सेट कर रहे हैं, नक़ल अस्वीकृति, गेट्स की स्थापना, आदि उपयोगकर्ताओं को या तो कदम छह और सात खुद को समय से आगे प्रदर्शन या आवश्यकता समानांतर में एक तकनीशियन की सहायता । अंत में, पोस्ट-FACS, वहां अक्सर यह सुनिश्चित करने के लिए कदम है कि केवल लेबल एकल कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से मौजूद हैं; उदाहरण के लिए, एक उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग सेटअप जैसे एक तेज प्लेट imager में नमूनों की जाँच करके ।
ऊपर उल्लिखित चरणों को दरकिनार और एकल फ्लोरोसेंट लेबल ंयूरॉंस की एक छोटी सी आबादी के एक अपेक्षाकृत त्वरित, लक्षित अनुक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए, हम एक मैनुअल छंटाई प्रक्रिया का वर्णन एक अति संवेदनशील के दो दौर के बाद इन विट्रो में प्रवर्धन प्रोटोकॉल, बुलाया डबल में-इन विट्रो प्रतिलेखन निरपेक्ष गिनती अनुक्रमण (दिवा-Seq) के साथ । आरएनए प्रवर्धन और सीडीएनए पुस्तकालय पीढ़ी Eberwine एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं । 6 और Hashimshony एट अल. 7, कुछ संशोधनों के साथ माउस ंयूरॉंस कि छोटे सेलुलर संस्करणों के अनुरूप है; इसके अलावा, हम यह भी पाया है कि यह उत्तेजक पिरामिड ंयूरॉंस के लिए समान रूप से उपयोगी है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मैनुअल छँटाई प्रोटोकॉल है कि या तो कम चूहों मस्तिष्क में लेबल कर रहे हैं या एक दुर्लभ कोशिका जनसंख्या है कि अन्यथा वर्तमान उच्च प्रवाह सेल का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए संभव नहीं है का प्रतिनिधित्व कर …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH (5R01MH094705-04 और R01MH109665-01 से Z.J.H.), CSHL Robertson तंत्रिका विज्ञान कोष (Z.J.H.) द्वारा, और एक NARSAD पोस्ट डॉक्टरेट फैलोशिप (एपी करने के लिए) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
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