Summary
מתחמי RNA/חלבון מטוהרים באמצעות אסטרטגיה botin-streptavidin הם eluted פתרון תחת תנאים denaturing בטופס אינו מתאים עוד טיהור, אנליזה פונקציונלית. כאן, אנו מתארים שינוי של אסטרטגיה זו אשר מנצל מקשר צילום-cleavable RNA, צעד • UV-תנאי עדין, מניב את מתחמי ה-RNA/חלבון המקורי והמלא.
Abstract
במשך שנים רבות, חזק במיוחד, במהירות בנוי האינטראקציה בין ביוטין streptavidin יש כבר בהצלחה מנוצל לשם טיהור חלקי של מתחמי RNA/חלבון חשוב מבחינה ביולוגית. עם זאת, אסטרטגיה זו סובלת חיסרון מרכזי אחד המגביל את ניצול רחב יותר: האינטראקציה של ביוטין/streptavidin יכול להיות שבור רק תחת תנאים גם לשבש את תקינות מתחמי eluted, ומכאן מסלק denaturing שלהם אנליזה פונקציונלית עוקבות ו/או נוספות טיהור באמצעות שיטות אחרות. בנוסף, הדגימות eluted נגועים תכופות עם החלבונים רקע המשייכים nonspecifically streptavidin חרוזים, שמסבך הניתוח של מתחמי מטוהרת על ידי צביעת כסף ספקטרומטר מסה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו משתנה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin בו ביוטין מצורף של המצע RNA באמצעות מקשר צילום-cleavable, מתחמי ותשמרו על חרוזים streptavidin הם eluted באופן סלקטיבי על פתרון טופס מקורי על-ידי גלי ארוך UV, עוזב את החלבונים רקע על החרוזים. סובסטרטים איגוד ה-RNA קצר יותר יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין והמקשר צילום-cleavable covalently מצורף לסוף 5' RNA, ואילו עוד מצעים RNA יכול להתבצע עם שתי הקבוצות באמצעות oligonucleotide משלימים. אלה שתי גרסאות של השיטה • UV-תנאי נבדקו עבור טיהור של מתחמי עיבוד snRNP תלוית U7 זה קליב היסטון pre-mRNAs בקצה 3' והוכיח שניהם להשוות לשני בחיוב בעבר פיתחו שיטות טיהור. הדגימות UV eluted הכיל כמויות לזיהוי בקלות snRNP U7 שהיה ללא מזהמים חלבון גדול ומתאים לניתוח ישיר באמצעות ספקטרומטר מסה מבחני פונקציונלי. השיטה המתוארת ניתן להיות ברצון הותאם עבור טיהור של מתחמי מחייב אחרים RNA, הפועל בשיתוף עם אתרי קישור יחיד, כפול-גדילי DNA לטהר חלבונים ספציפיים הדנ א ואת מתחמי macromolecular.
Introduction
ב פרוקריוטים, מבשרי RNA פולימראז II-שנוצרו mRNA (pre-mRNAs) עוברים מספר אירועים ההבשלה בגרעין לפני שהפך תקינים mRNA תבניות עבור סינתזת החלבון בציטופלסמה. אחד האירועים הללו הוא עיבוד קצה 3'. עבור הרוב המכריע של טרום-mRNAs, עיבוד קצה 3' כרוך המחשוף מצמידים פוליאדנילציה. תגובה דו-שלבית זה מזורז על ידי קומפלקס יחסית שופע בהיקף של יותר מ-15 חלבונים1. בעלי חיים תלויי-שכפול היסטון pre-mRNAs מעבד בקצה 3' מנגנון שונה שבו הוא שיחק תפקיד מפתח על ידי U7 snRNP, שפע נמוך מורכבים בהיקף של snRNA U7 של נוקלאוטידים ~ 60 וחלבונים מספר2,3 . U7 snRNA בסיסי זוגות עם רצף מסוים היסטון pre-mRNA, לאחד subunits של snRNP U7 מזרז את התגובה המחשוף, יצירת היסטון בוגרת mRNA ללא poly(A) זנב. 3' עיבוד קצה של היסטון pre-mRNA דורש גם גזע לופ מחייב חלבון (SLBP), אשר נקשר שנשמרת גזע-לולאה ממוקם במעלה הזרם של אתר המחשוף ומגבירה את גיוס snRNP U7 המצע2,3. מחקרים שמטרתם זיהוי רכיבים בודדים של snRNP U7 היה מאתגר בשל ריכוז נמוך snRNP U7 בתאים בעלי חיים ואת הנטייה של המתחם מביצועם או עוברים proteolysis חלקית במהלך טיהור כתוצאה מהשימוש דטרגנטים קלים-4,-5,-6, שוטף מלח גבוהה ו/או מספר צעדים כרומטוגרפי7,8,9.
לאחרונה, כדי לקבוע את ההרכב של מכונות עיבוד U7 תלוית, נדגרה קטע קצר של ביוטין המכילים pre-mRNA היסטון 3' או 5' עם תמצית גרעיני, מתחמי שהורכב נתפסו על מצופים streptavidin agarose חרוזים5,6,10. בעקבות האינטראקציה בין ביוטין streptavidin חזק במיוחד, חלבונים ותשמרו על חרוזים streptavidin היו eluted תחת denaturing תנאים על ידי הרתחה ב מרחביות, נותחו על ידי צביעת כסף, ספקטרומטר מסה. בעת גישה פשוטה זו זוהו מספר מרכיבי snRNP U7, זה הניב דגימות גסה יחסית, לעיתים קרובות מזוהם עם מספר רב של חלבונים רקע מאוגדים nonspecifically streptavidin חרוזים, שעשוי להיות מיסוך רכיבים מסוימים של את מכונות עיבוד ומניעת אצלם הזיהוי על כסף מוכתם ג'לים5,6,10. חשוב, גישה זו גם מנעה כל מחקרים תפקודית ועם החומר המבודד שלו טיהור נוספת כדי הומוגניות על ידי שיטות נוספות.
הוצעו מספר שינויים לאורך זמן לפנות את אופי האינטראקציה ביוטין/streptavidin, עם רובם תוכננה גם להחליש את האינטראקציה או לספק זרוע מרווח מבחינה כימית cleavable ב כמעט בלתי הפיך ביוטין המכילות ריאגנטים11,12. החיסרון של כל השינויים האלה היה כי הם להפחית באופן משמעותי את יעילות השיטה ו/או נדרש לעיתים קרובות תנאים שאינם-פיזיולוגיים במהלך השלב • תנאי, לסכן את תקינות או פעילות של החלבונים מטוהרים.
כאן, אנו מתארים גישה שונה כדי לפתור את הבעיה הטבועה של האסטרטגיה ביוטין/streptavidin באמצעות ה-RNA סובסטרטים שבו ביוטין covalently מחובר 5' סוף דרך 1 צילום-cleavable-(2-nitrophenyl) moiety אתיל זה רגיש זמן לנופף UV13,14. בדקנו גישה זו לטיהור של מכונות עיבוד U7 תלוית המגביל מ דרוזופילה ותמצית מידע יונקים גרעיני15. בעקבות של דגירה קצרה של ה-pre-mRNA היסטון ביוטין המכיל את מקשר צילום-cleavable עם תמצית גרעיני, מתחמי עיבוד שהורכב ותשמרו על streptavidin חרוזים, ביסודיות שטופים בעדינות פרסמה פתרון ביליד טופס על-ידי חשיפה לאור nm UV ~ 360. השיטה • UV-תנאי היא מאוד יעילה, מהירה וישירה, מניב כמויות מספיקות של snRNP U7 להמחיש מרכיביו מאת נכספת מכתים מ קטנה כמו 100 µL של תמצית15. החומר UV-eluted היא חינם של חלבונים רקע מתאים ניתוח ישירה ספקטרומטר מסה, צעדים נוספים טיהור מבחני אנזימטיות. יכול להיות מאומץ באותה השיטה לטיהור של אחרים מתחמי RNA/חלבון שדורשים אתרי קישור RNA קצר יחסית. ביוטין והמקשר צילום-cleavable יכול גם להיות covalently מצורף אל יחיד, כפול-גדילי ה-DNA, פוטנציאל הרחבת בשיטת UV-• תנאי לטיהור של מתחמי DNA/חלבונים שונים.
סינתזה של סובסטרטים RNA המכיל covalently מצורף ביוטין, מקשר צילום-cleavable היא מעשית רק עם הרצפים עולה על ~ 65 נוקלאוטידים, נהיה יקר ולא יעיל עבור רצפי באופן משמעותי יותר. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו גם גישה חלופית מתאימה יותר מטרות איגוד ה-RNA. בגישה זו, ה-RNA של כל רצף נוקלאוטיד לאורכה שנוצר במבחנה על ידי שעתוק T7 או SP6 ואת annealed כדי oligonucleotide משלימה קצרה שמכיל ביוטין והמקשר צילום-cleavable בקצה 5' (טרנס תצורה). דופלקס תוצאות משתמשים לאחר מכן לטהר את הפרט מחייב חלבונים או קומפלקסים macromolecular על חרוזים streptavidin בעקבות באותו פרוטוקול המתואר לשם סובסטרטים RNA שמכיל ביוטין cleavable-צילום מצורף covalently (חבר העמים תצורה). עם השינוי הזה, ביוטין צילום-cleavable ניתן להשתמש בשילוב עם במבחנה שנוצר תעתיקים המכיל מאות נוקלאוטידים, הרחבת בשיטת UV-• תנאי לטיהור של רחב טווח של RNA/חלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הרקע
הערה: מצעים RNA קצרים יותר מאשר נוקלאוטידים ~ 65 יכול להיות מסונתז כימית עם ביוטין (B) והמקשר צילום-cleavable (pc) (המכונה יחד ביוטין צילום-cleavable או pcB) covalently המצורפת לקצה RNA 5' (תצורתציס ). מצעים RNA המכיל אתרי קישור באופן משמעותי יותר צריך להיות שנוצר במבחנה על ידי שעתוק T7 (או SP6), לאחר מכן annealed כדי oligonucleotide מתאם משלימים קצר המכיל pcB moiety בקצה 5' (טרנס תצורת) (איור 1).
- אתרי קישור בהיקף של פחות מ 65 ~ נוקלאוטידים, להשתמש יצרן מסחרי (טבלה של חומרים) לסנתז כימית RNA עניין עם מעגלים מודפסים covalently המצורפת לקצה RNA 5' (איור 1A ואיור 2A). מתמוססים במים סטריליים כדי להיכנס לריכוז הרצוי ואחסן aliquots קטן ב- 80 ° c
- עבור אתרי קישור באופן משמעותי יותר מ ~ 65 נוקלאוטידים, טופס דופלקס חלקית של של במבחנה נוצר RNA של עניין oligonucleotide מתאם משלימים המכיל את moiety pcB בקצה 5' (איור 3 א).
- מבצע T7 שעתוק הדנ א של פלסמיד ליניארית או תבנית ה-PCR המתאימה ליצירת RNA עם אתר איגוד עניין המורחבת בקצה 3' על ידי רצף ~ 20-נוקלאוטיד שרירותי.
- השתמש יצרן מסחרי (טבלה של חומרים) לסנתז כימית של oligonucleotide מתאם משלים הסיומת 3' ב- RNA שנוצר על-ידי T7 ומכיל pcB בקצה 5' (איור 3 א).
הערה: שני 18-atom מפרידי ו- 2-3 נוקלאוטידים שאינם משלימים ניתן להציב בקצה 5' של oligonucleotide כדי להפחית מכשלה הסטריים פוטנציאלי בין מתחם מאוגד streptavidin חרוזים. רצוי גם oligonucleotide הוא שונה בצורה אחידה עם 2' O-methyl קבוצה כדי לשפר את הכוח של דופלקס וכדי לספק עמידות נגד nucleases שונים. - Anneal של RNA שנוצר על-ידי T7 כדי oligonucleotide מתאם pcB.
- מיקס 20 pmol של RNA ואת pmol 100 של oligonucleotide pcB מתאם (היחס 1:5 טוחנת) ב- mL 1.5 צינור µL 100 המכיל מאגר מחייב עם ההרכב הבא: 75 מ מ אשלגן כלורי, 15 מ מ HEPES pH 7.9, גליצרול 15%, 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA).
הערה: חשוב להשתמש כמות מזערית של oligonucleotide מתאם זה מספיק ליצור דופלקס עם סובסטרט pre-mRNA רוב (אם לא כל) המשמשים את התגובה מחזק. זה יכול בנוחות תיקבע על-ידי תיוג RNA המצע בקצה 5' עם 32P, חישול המצע שכותרתו עם הגדלת כמויות של מתאם oligonucleotide באמצעות שונים מאגר השמירה של תנאים וניטור אות רדיואקטיבי streptavidin חרוזים לאחר מספר שוטף של החרוזים עם המאגר מחייב. - מקם את הצינור במים רותחים במשך 5 דקות.
- לאפשר למים להתקרר לטמפרטורת החדר.
- מיקס 20 pmol של RNA ואת pmol 100 של oligonucleotide pcB מתאם (היחס 1:5 טוחנת) ב- mL 1.5 צינור µL 100 המכיל מאגר מחייב עם ההרכב הבא: 75 מ מ אשלגן כלורי, 15 מ מ HEPES pH 7.9, גליצרול 15%, 10 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA).
2. מתחם הרכבה
- תוספת 1 מ"ל של תמצית גרעיני העכבר (או תמצית אחרת של הבחירה) עם 80 מ מ EDTA pH 8 כדי ריכוז סופי של 10 מ מ כדי לחסום nucleases תלויי-מטאל לא ספציפית הנוכחים התמצית.
הערה: זה יגרום התאמת מאגר של התמצית להרכב אותו עד כדי כך במאגר של איגוד (ראה שלב כ- 1.2.3.1). EDTA אינה משפיעה על עיבוד במבחנה של היסטון pre-mRNAs, אך ייתכן מזיקים לטיהור חלבונים או מתחמים חלבון להרכיב באופן תלוי-מגנזיום. במקרים אלה, יש להימנע EDTA. - להוסיף 5-10 pmol של המצע RNA עם moiety pcB ב- cis התגית (ראה צעד 1.1) או טרנסג'נדרים (ראה שלב 1.2.3.3) עד 1 מ"ל של התמצית המכיל 10 מ מ EDTA.
הערה: הכמות של RNA צריך להיות המוגמרת בסדרה של ניסויים למשפט. באמצעות מדי סובסטרט RNA ולטיהור מתחם המגביל אולי לא מועיל, משמעותי בשיפור הרקע של RNA ספציפי מחייב חלבונים מבלי השפיע על היבול של חלבונים ספציפיים. - דגירה המצע RNA עם תמצית למשך 5 דקות על קרח, מדי פעם לערבב את הדגימה.
הערה: הן הזמן ואת הטמפרטורה של הדגירה צריך שתוקם מדעית והם עשויים להשתנות באופן משמעותי, בהתאם לאופי המתחם RNA/חלבון ספציפי. - לסובב את התערובת הדגירה ב microcentrifuge טרום מקורר במשך 10 דקות ב 10,000 g x כדי להסיר את כל פוטנציאל פוחת משקעים ולאסוף בזהירות הימנעות supernatant העברת בגדר.
3. בטקטיקות של מתחמי ה-RNA/חלבון על חרוזים Streptavidin.
- להעביר ~ 100 µL streptavidin agarose חרוז השעיה מן הספק מסחרי (טבלה של חומרים) צינור 1.5 mL, להגדיל את נפח עם המאגר מחייב (75 מ"מ אשלגן כלורי, 15 מ מ HEPES pH 7.9, גליצרול 15%, 10 מ מ EDTA).
הערה: מאגר זה צריך להיות ההרכב אותו עד כדי כך את התערובת מחזק, תמצית המשמש להרכבה מורכבים (שלב 2.1). - לאסוף את החרוזים בחלק התחתון של הצינור על ידי ספינינג למשך 2-3 דקות ב 25 x g, וארוקן את תגובת שיקוע.
- חזור על הפעולות כביסה/ספינינג אותו 2 - 3 פעמים כדי equilibrate את החרוזים עם המאגר מחייב.
הערה: בסוף שלב זה, בגדר של החרוזים צריך נפח של ~ 30 µL. - לטעון את תגובת שיקוע המכיל המתחם שהורכב (שלב 2.4) מעל החרוזים agarose equilibrated streptavidin.
- סובב h 1 ב 4 ° C כדי לשתק RNA ו את מתחמי המאוגד על החרוזים.
- לאסוף את החרוזים בחלק התחתון של הצינור על ידי ספינינג למשך 2-3 דקות ב 25 x g.
הערה: השתמש חבטה החוצה הרוטור כדי למנוע אובדן משמעותי של החרוזים אם הם נוטים לדבוק הצד של הצינור בהרוטורים זוויתי. - וארוקן את תגובת שיקוע ולשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל מאגר מחייב, באמצעות צנטריפוגה באותם התנאים.
- להוסיף 1 מ"ל של המאגר איגוד ולסובב את הדגימה h 1-4 מעלות צלזיוס.
הערה: שלב זה יכול להתקצר אם המתחם הקימו על המצע נוטה מביצועם. - ספין למטה החרוזים למשך 2-3 דקות ב 25 x g, להוסיף 1 מ"ל של המאגר, להעביר את המתלים צינור חדש.
- סובב עבור h 1 נוספים או קצר יותר, אם המתחם אינה יציבה, ספין למטה למשך 2-3 דקות ב g 25 x, להעביר את החרוזים צינור 500 µL µL 200 איגוד המאגר.
4. UV-• תנאי.
- הפעל בעוצמה גבוהה מנורת UV פולטות אור UV nm 365 למשך 5-10 דקות לפני שהגיע מלא זוהר.
הערה: זה חיוני כדי להשיג אנרגיה מקסימלית של פליטת UV בתחילתו של הקרנה. - למלא את תחתית צלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) עם קרח אציקלוביר, לערום אותו מעל המכסה של המנה.
- בקצרה מערבולת הצינור המכיל המתחם קיבוע, במקום זה בצורה אופקית על קרח ולכסות עם המנורה מראש ומחוממת, המבטיח כי המדגם ממוקם במרחק של 2-3 ס מ של פני השטח של הנורה.
הערה: אם המרחק הוא גדול מדי, להשתמש פטרי נוספים או אובייקטים אחרים מתאימים להביא את הדגימה קרוב יותר אל הנורה. - להאיר עבור סכום כולל של 30 דקות, לעתים קרובות היפוך, vortexing את הצינור כדי להבטיח חשיפה אחידה של ההשעיה UV וכדי למנוע התחממות יתר.
הערה: כדי לספק קירור נוספים, הצעד • UV-תנאי יכול להתבצע בחדר קר. לעבור צלחת פטרי עם קרח טרי במקרה של יתר הקרח נמס. - ספין למטה החרוזים למשך 2-3 דקות ב 25 x g ולאסוף את תגובת שיקוע.
- ספין מחדש את תגובת שיקוע משתמש באותם התנאים ולאסוף את תגובת שיקוע.
הערה: השאר כמות קטנה של תגובת שיקוע בתחתית כדי למנוע העברה של חרוזים שיורית.
5. דגימת על ידי צביעת כסף ואחריו ספקטרומטר מסה.
- שימוש מרחביות/לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה להפרדת שבריר של תגובת שיקוע UV-eluted לבין השבר באותו חומר הותיר את החרוזים הבאים • תנאי UV.
הערה: הניתוח עשוי לכלול גם את aliquot של חרוזים מופנמים מדגם לפני • UV-תנאי. - מכתים את ג'ל המכיל חלבונים מופרדים באמצעות כסף זמין מסחרית מכתים קיט.
- להעריך את היעילות של UV-• תנאי על-ידי השוואת עוצמות של חלבונים נוכח תגובת שיקוע של UV-eluted, אלו שנשארו מאחור החרוזים בעקבות הקרנת UV.
- בלו הלהקות חלבון עניין, לקבוע את זהותם באמצעות ספקטרומטר מסה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים10,15.
6. ניתוח הכללית של UV-eluted מדגם ידי ספקטרומטר מסה.
- ישירות לנתח שבריר תגובת שיקוע UV eluted באמצעות ספקטרומטר מסה כדי לקבוע את פרוטאום כולו של החומר מטוהרים בצורה בלתי לא משוחדת.
הערה: ניתן לבצע זאת על ידי טיפול בבית-פתרון של הדגימות מטוהרים עם טריפסין ואחריו פרוטוקולים סטנדרטיים ספקטרומטר מסה כדי לקבוע את זהותו של צור פפטידים10,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה • UV-תנאי נבדקה יחד עם שני מצעים RNA מסונתז כימית covalently מצורף בקצה 5' pcB moiety (תצורתציס ): pcB-SL (איור 1) ו- pcB-dH3/5 מ' RNAs (איור 2). 31-נוקלאוטיד pcB-SL RNA מכיל מבנה גזע לופ ואחריו זנב תקועים 5-נוקלאוטיד יחיד והוא רצף שלו זהה 3' סוף היסטון בוגרת mRNA (כלומר., לאחר המחשוף של היסטון pre-mRNA מאת U7 snRNP). רצף ייחודי זה הוא אתר איגוד ידוע עבור שני חלבונים נוכח השבר cytoplasmic יונקים: SLBP ו- 3' hExo16,17,18. מעגלים מודפסים-dH3/5 מ' זהו חלק 63-נוקלאוטיד דרוזופילה H3 היסטון pre-mRNA ומכיל בנוסף הלולאה הגזע רצף המאגד דרוזופילה U7 snRNP (איור 2).
dH3 Ext (125 נוקלאוטידים) דוגמה של סובסטרטים RNA יותר זה יכול להיות שנוצר על ידי שעתוק T7 וכוללים ביוטין, כרווח צילום-cleavable טרנס על ידי חישול כדי pcB/22mer, oligonucleotide מתאם מסונתז כימית ( טרנס תצורה). pcB/22mer מכיל שתי הקבוצות בקצה 5' והיא מורכבת 22 2' O-מתיל-modifed נוקלאוטידים (איור 3 א). 19 נוקלאוטידים בקצה 3' של pcB/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) הם משלים נוקלאוטידים אחרונה 19 של dH3 Ext pre-mRNA. זה pre-mRNA חוץ מלהיות עוד אינו שונה באופן משמעותי מן סינתטי pcB-dH3/5 מ', המכיל אותו שני מפתחות עיבוד אותות: גזע לופ ואתר U7 מחייב.
מעגלים מודפסים-SL RNA, נדגרה עם 1 מ"ל של תמצית S100 שהוכנו על ידי ultracentrifugation (100,000 g x עבור 1 h) של השבר cytoplasmic המתקבל תאים מיאלומה העכבר19 ועל ההשפעה, היעילות של UV-• תנאי נותחו לראשונה על ידי צביעת כסף. מספר החלבונים אותרו על חרוזים streptavidin לפני UV-• תנאי (איור 1B, ליין 1). הקרנה עם גלי ארוך UV שוחרר רק חלק חלבונים אלה כדי תגובת שיקוע (איור 1B, ליין 3), עוזב רקע לא ספציפית על החרוזים (איור 1B, ליין 2), ומכאן הדגשת החשיבות של השלב • UV-תנאי. החלבונים העיקריים UV eluted אותרו באמצעות ספקטרומטר מסה כ 3' hExo ו- SLBP, עם SLBP להיות מיוצג על ידי חלבון באורך מלא (פל) ומספר השפלה קצר יותר מוצרים (DP). כמויות קטנות יותר של חלבונים אחרים, מזוהה RNA שונים מחייבים חלבונים (RBPs), שוחררו גם באופן סלקטיבי לפתרון על ידי הקרנת UV (איור 1B, ליין 3).
מעגלים מודפסים-dH3/5 מ' pre-mRNA (איור 2) או dH3 Ext pre-mRNA annealed כדי pcB/22mer (איור 3) היו מודגרות עם 1 מ ל תמצית גרעיני מכל דרוזופילה Kc תאים לטופס עיבוד מתחמי20,21. להעריך טוב יותר יחודיות של חלבונים לאגד כל היסטון pre-mRNA, פקד שלילי הוכן במקביל על-ידי הוספת שני המתחרים כדי הגרעיניות לחלץ: RNA SL מרחיק SLBP, קצר oligonucleotide antisense לבסס זוגות עם snRNA U7 ומונעת את האינטראקציה של snRNP U7 עם האתר שלו ב- pre-mRNA.
השלב • UV-תנאי של pcB-dH3/5 מ' קיבוע pre-mRNA, גרמו שחרור סלקטיבי של כמות קטנה של חלבונים תגובת שיקוע (איור 2B, ליין 1), עם רקע חזק של חלבונים שאינם ספציפיים שנותרו על החרוזים (איור 2B , ליין 3). אלה חלבונים, המסומנות א-אני, זוהו על ידי ספקטרומטר מסה כרכיבים של snRNP U715. המדגם הכיל גם חלקית SLBP שבאמצעותה ניתן-10 kDa ומי יכול להיות גלוי על ריכוז גבוה יותר שמרחביות/לזיהוי ג ' לים. כל החלבונים האלה לא אותרו בנוכחות שני המתחרים עיבוד לחסום עקידת U7 snRNP כדי היסטון pre-mRNA (איור 2B, ליין 2).
מרכיבי דרוזופילה U7 snRNP באותו שוחררו לפתרון על ידי הקרנת UV של דופלקס קיבוע של dH3 Ext pre-mRNA, pcB/22mer (איור 3B, ליין 1). דוגמה זו הכילה בנוסף מרובים RNA מחייב חלבונים זה לבוא במגע עם oligonucleotide pcB/22mer נעשה שימוש עודף כדי ליצור דופלקס עם dH3 Ext pre-mRNA. בניגוד subunits של U7 snRNP, חלבונים מזהמים אלה, כמו גם כל החלבונים רקע שנשארה על החרוזים, שהתמידו בנוכחות המתחרים עיבוד (איור 3B, להשוות מסלולים 1 ו-2, ואת השבילים 3 ו- 4).
חלק קטן של מתחמי עיבוד UV-תגובת שיקוע המכיל את אותו חלק UV-תגובת שיקוע של פקד שלילי (מוכן בנוכחות oligonucleotides שני מתחרים, ולכן חסר מתחמי עיבוד) ניתן ישירות נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה בלי הפרדה מוקדמת של החלבונים eluted על ידי ג'ל אלקטרופורזה15. שיטה זו היא רגישה מאוד באיתור כל החלבונים eluted ללא קשר לגודל שלהם, שפע, בשיתוף עם הדגימה שלילית מספק רשימה מלאה ואני לא משוחדת של חלבונים המשייכים במיוחד היסטון pre-mRNA לנהל את קצה 3' עיבוד התגובה.
איור 1: טיהור החלבונים cytoplasmic העכבר מאוגדים pcB-SL רנ א. (א) A תרשים של pcB מסונתז כימית-RNA (31-נוקלאוטידים) SL. ביוטין (Biot) בקצה 5' ואחריו צילום-cleavable moiety (pc) רגיש זמן לנופף UV (366 nm), מפרידי 18 שני אטום, נוקלאוטידים 31 שיוצרים את מבנה שנשמרת גזע לולאה בקצה 3' של היסטון בוגר mRNAs. (B) pcB-SL RNA, נדגרה עם תמצית cytoplasmic S100 מתאי מיאלומה העכבר. RNA וחלבונים מאוגד היו טהור על חרוזים streptavidin, שטף בהרחבה, UV eluted, נותחו על ידי כסף (ליין 3) מכתים. חלבונים ותשמרו על חרוזים streptavidin לפני • תנאי UV והשאיר על החרוזים, לאחר • תנאי UV מוצגות באיור מסלולים 1 ו- 2, בהתאמה. בעמדה של סמני גודל חלבונים (kDa) מסומן שמאלה.
איור 2: טיהור של מתחמי עיבוד דרוזופילה התאספו על pcB-dH3/5 מ' pre-mRNA. (א) דיאגרמה של מסונתז כימית דרוזופילה-pcB-dH3/5 מ' ספציפי pre-mRNA (63-נוקלאוטידים). ביוטין (Biot) בקצה 5' ואחריו צילום-cleavable moiety (pc), שני 18-atom מפרידי נוקלאוטידים 63 להכיל רצף שני אלמנטים חיוניים עיבוד: גזע לופ ומבנה אתר U7-קישור. 5 נוקלאוטידים סביב האתר מחשוף גדול הממוקם בין שני הרכיבים משתנים עם 2' קבוצת O-מתיל כדי לחסום את המחשוף על ידי snRNP U7 במהלך ההרכבה מורכב (חצה קווים). (B) pcB-dH3/5 מ', נדגרה עם תמצית גרעיני דרוזופילה להרכיב לצלייה. בפקד שלילי, תמצית גרעיני מכיל שני המתחרים עיבוד כדי לחסום את הכריכה של SLBP ו U7 snRNP כדי היסטון pre-mRNA. מתחמי שהורכב היו ותשמרו על streptavidin חרוזים, בהרחבה שטופים לפתרון שפרסם את חשיפת המדגם גלי ארוך UV. שברים זהה של החומר eluted-סגול (UV-sups), את החרוזים הבאים UV-• תנאי (UV-חרוזים) נותחו על ידי צביעת כסף. המיקום של חלבון גודל סמני (kDa) ואת streptavidin (SA) הוא הצביע לימין.
איור 3: טיהור של מתחמי עיבוד דרוזופילה התאספו על dH3 Ext pre-mRNA שמצורפים לקבוצה צילום-cleavable טרנס. (א) A תרשים של דופלקס Ext dH3 שנוצר על ידי חישול dH3 שנוצרו על-ידי T7 Ext pre-mRNA, pcB מסונתז כימית/22mer oligonucleotide עם הרצף הבא: 5' Biot/pc/18S/18S/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. Oligonucleotide, ביוטין (Biot) ממוקמת בקצה 5', ואחריו את מקשר צילום-cleavable (pc). נוקלאוטידים אחרונה 19 (. תחתון לפי הרצף המוזכר לעיל) הם משלימים את הסיומת 3' נוספו dH3 Ext pre-mRNA. הנוכחות של 2' O-methyl שינויים (לא ציינו באיור) משמשת לשתי מטרות: מייצב את oligonucleotide נגד תמצית nucleases וזה מגביר את עוצמת דופלקס הקים עם dH3 Ext pre-mRNA. DH3 (B) Ext דופלקס, נדגרה עם דרוזופילה Kc גרעיני לחלץ העדר או בנוכחות עיבוד מתחרים, ותשמרו על streptavidin חרוזים, בהרחבה שטף ו UV-eluted יחד עם החלבונים מאוגד. שברים זהה של החומר eluted-סגול (UV-sups, מסלולים 1 ו- 2), את החרוזים הבאים UV-• תנאי (UV-חרוזים, מסלולים 3 ו- 4) נותחו על ידי צביעת כסף. Componenst ספציפיים של מתחמי עיבוד (אלה שלא נכללו על-ידי עיבוד המתחרים) מסומנים באות A לאותיות נ. העיקריים שאינם ספציפיים RNA מחייב חלבונים (אלה UV eluted אך מתעקש בנוכחות שני המתחרים עיבוד) מסומנים באמצעות כוכביות. בעמדה של סמני גודל חלבונים (kDa) מסומן בצד ימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן היא פשוטה וחוץ שילוב מקשר צילום-cleavable, השלב • UV-תנאי אינו נבדל מן השיטות הנפוצות לנצל מאוד חזקה האינטראקציה בין ביוטין streptavidin. הצעד • UV-תנאי יעילה מאוד, בדרך כלל שחרור יותר מ-75 אחוזים הרנ א קיבוע ומקושרת מהחלבונים streptavidin חרוזים, כשמאחוריו רקע גבוה של חלבונים הלא ספציפית לאגד החרוזים. על ידי ביטול על רקע זה, הצעד • UV-תנאי התשואות מתאימים לניתוח ישיר להפליא טהור דוגמאות על ידי צביעת כסף, ספקטרומטר מסה מבחני פונקציונלי.
כתוצאה המערבים של שלבים מעטים ופשוטים יחסית, השיטה • UV-תנאי היא מאוד לשחזור, מתן כמויות מספיקות של snRNP U7 צביעת כסף מ קטנה כמו 100 µL של העכבר ותמצית דרוזופילה גרעיני15. השיטה היא חלופה אטרקטיבית אחרים אסטרטגיות ניסיוני השתמשת קודם לכן כדי לטהר את מתחמי ה-RNA/חלבון, לרבות תיוג RNA מצעים עם אתר איגוד MS2 שיתק מתחמי המשויך על חרוזים עמילוז באמצעות היתוך MS2-MBP חלבון. האסטרטגיה MS2, בעוד מצליח לבודד spliceosomes שופע יחסית והסוף הקנוני 3' עיבוד מתחמי22,23, נכשל להניב כמויות מספיקות של עיבוד מתחמי המכיל U7 snRNP (ZD, לא פורסם תוצאות), שזה בערך פי 100 פחות מרוכז בתאים בעלי חיים מאשר snRNP spliceosomal הגדולות U1.
היבטים רבים של הפרוטוקול צריך להיות שונה כדי לעמוד ביעדי מחקר אישיים שונים וכדי לייצר תוצאות מיטביות עם מתחמי RNA/חלבונים אחרים. ראשית, חשוב להתאים את כמות המצע RNA המשמש את מכלול מורכב עם הסכום של מתחם זה קיים בהתמצית. הגבלת מתחמי, כולל U7 snRNP, באמצעות המצע מדי הוא לא מועיל, רק הגדלת את הרקע של שאינם ספציפיים מחייבים RNA חלבונים ב- UV-תגובת שיקוע. שנית, חשוב גם למטב את האורך והטמפרטורה של דגירה כדי לקדם את הרכבה נמרצת של המתחם, מניעת באותו הזמן שלה הדיסוציאציה proteolysis פוטנציאליים או השפלה RNA מוגזמת.
מפתח difficultly בעבודה עם מתחמי עיבוד U7 תלוית ואת מתחמי RNA/חלבון דומה שנושאים פעילויות אנזימטיות הוא כי לאחר הורכב באופן מלא הם עשויים מביצועם כתוצאה זרז. המחשוף של היסטון pre-mRNAs מתרחשת במהירות גם בטמפרטורות נמוכות, מפחיתה משמעותית את התשואה של נייר מתחמי עיבוד מטוהרים. כדי למנוע אפקט לא רצוי זה, אתר מחשוף גדול ואת ארבעה נוקלאוטידים סמוכים ב- pcB-dH3/5 מ' pre-mRNA שונו במהלך סינתזה עם 2' O-methyl קבוצות (5 מ')10. זה pre-mRNA כמעט לחלוטין עמיד בפני המחשוף מאת U7 snRNP ו יכול להיות מודגרות עם תמצית גרעיני בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות מבלי לגרום הפרעה מורכבת לזיהוי. DH3 שנוצרו על-ידי T7 ש-ext annealed כדי pcB/22mer חסר לבצע שינויים אלה, דגירה שלה עם תמצית גרעיני מבוצעת על קרח במשך 5 דקות או קצר יותר להגבלת זרז. מעגלים מודפסים-SL RNA מכיל בוגר 3' סוף היסטון mRNA בתמציות cytoplasmic לא עוברים שום עיבוד תוספת. 3' hExo, אשר הוא תלוי-מגנזיום 3' - 5' אקסונוקלאז היא מסוגלת להסיר 2-3 נוקלאוטידים של הזנב נטושים יחיד ויוו24,25 אבל במבחנה שפעילותה מעוכבת על ידי הנוכחות של EDTA16. כתוצאה מכך, pcB-SL RNA יכול להיות מודגרות בתמציות cytoplasmic בטמפרטורת החדר למשך זמן ממושך ללא תופעות לוואי, אמנם בדרך כלל דגירה קצרה על הקרח מספיקה ליצור מכלול RNA עם SLBP ו- 3' hExo ternary.
של שתי גרסאות חלופיות של השיטה • UV-תנאי, בעזרת RNA סובסטרטים ביוטין והמקשר צילום-cleavable ב- cis (covalently המצורפת לקצה 5' של RNA) בסך הכל קל ותשואות דגימות יחסית טהור. מגבלה חשובה של גישה זו היא כי שתי הקבוצות ניתן covalently לחבר סובסטרטים RNA שלא יעלה על ~ 65 נוקלאוטידים. מטרות האיגוד RNA עוד ניתן לחבר את moiety pcB חוצה דרך oligonucleotide מתאם. עם זאת, גישה זו עשויה לייצר הרקע גבוה של חלבונים שאינם ספציפיים אשר נוטים לכרוך עודף של oligonucleotide מתאם. לכן חשוב להשתמש רק עם עודף טוחנת מינימלי של oligonucleotide מספיק כדי לאגד את כל המצע pre-mRNA המשמשים את הניסוי.
מהות הרצף, האורך וכימיקלים מתאם oligonucleotides יכולים להיות מגוונים כדי לשפר את היכולת שלהם לבסס זוג עם הרצפים משלימים ב מצעים הרנ א, תוך צמצום יכולתם לקיים אינטראקציה עם שאינם ספציפיים RNA מחייב חלבונים. בסופו של דבר, מצעים pre-mRNA עוד מוכפל עם מתאם oligonucleotides יכול להיות מרותק למיטה על חרוזים streptavidin לפני בשימוש עבור היווצרות מורכבות. אחד היתרונות של גישה זו בחירה מראש הוא שהוא מבטל של מולקולות RNA לדוגמה נכשלה anneal כדי oligonucleotide. מולקולות אלה שומרים על על יכולת רגיל להרכיב לתוך מתחם תמצית אך אינם מסוגלים קשרו streptavidin חרוזים, חלקית לצמצם את התשואה של טיהור.
בנוסף לטיהור מכלולים מורכבים על מצעים RNA חד-גדילי, בשיטת UV-• תנאי באופן דומה ניתן לטהר חלבונים או מתחמים חלבון לאגד רצפי DNA בודד ולא כפול-גדילי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
אנו מודים העמיתים שלנו, משתפי פעולה על תרומתם לעבודה שלנו. מחקר זה נתמך על ידי NIH להעניק GM 29832.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L.
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
