Summary
采用肉毒分蛋白策略纯化的 rna* 蛋白复合物在变性条件下被洗脱, 以不适合进一步纯化和功能分析的形式进行溶液处理。在这里, 我们描述了这种策略的修改, 利用光裂解链接器在 rna 和温和的紫外线洗脱步骤, 产生本地和全功能的 rna 蛋白复合物。
Abstract
多年来, 生物素与链霉素之间异常强烈和快速形成的相互作用已被成功地用于生物重要 rna 蛋白复合物的部分纯化。然而, 这一战略有一个主要的缺点, 限制了其更广泛的利用: 生物素/链霉素相互作用只能在变性的条件下打破, 这也会破坏洗脱的复合物的完整性, 从而排除了它们的随后的功能分析和/或其他方法的进一步纯化。此外, 洗脱的样品经常被背景蛋白污染, 这些蛋白质与链霉素珠没有特别的联系, 使银染色和质谱分析对纯化的配合物的分析复杂化。为了克服这些限制, 我们开发了一种生物素/链霉素策略的变种, 在这种策略中, 生物素通过光裂解链接器附着在 rna 基板上, 而固定在链霉素微珠上的配合物被选择性地洗脱, 以溶液。原生形式由长波 uv, 留下的背景蛋白上的珠子。较短的 rna 结合底物可以用生物素和光裂解链剂共价地合成到 rna 的 5 ' 端, 而较长的 rna 底物可以通过互补的寡核苷酸与这两组一起提供。这两个变种的 uv 洗脱法的纯化纯化 u7 snnp 依赖的加工复合物, 在 3 ' 端切割组蛋白前 mrna, 他们都证明与其他以前开发的纯化方法相比是有利的。uv 洗脱样品含有易于检测的 u7 snrnp, 该样本不含主要蛋白质污染物, 适合通过质谱和功能分析进行直接分析。所述方法可很容易地用于纯化其他 rna 结合物, 并与单链和双链 dna 结合位点结合使用, 以纯化 dna 特异性蛋白质和大分子复合物。
Introduction
在真核生物中, rna 聚合酶 ii 生成的 mrna 前体 (预 mrna) 在成为细胞质中蛋白质合成的全功能 mrna 模板之前, 在细胞核中经历了几次成熟事件。其中一个事件是 3 ' 结束处理。对于绝大多数的前 mrna, 3 ' 的端部处理涉及裂解结合到多腺苷酸化。这种两步反应是由一个相对丰富的复合体催化的, 该复合物由15个以上的蛋白质1组成。动物复制依赖性组蛋白前 mrna 在 3 ' 端由 u7 snrnp 发挥关键作用的不同机制进行处理, u7 snrnp 是一种低丰度复合体, 由 ~ 60 核苷酸的 u7 snRNP 和多个蛋白质2,3组成。.u7 snrna 碱基对具有组蛋白前 mrna 中的特定序列, u7 snrnp 的一个亚基催化裂解反应, 在没有聚 (a) 尾的情况下产生成熟的组蛋白 mrna。3 ' 组蛋白前 mrna 的最终处理还需要 stem-loop 结合蛋白 (slbp), 它结合位于裂解部位上游的保守茎环, 并增强了 u7 snRNP 在基板 2,3中的招募。旨在确定 u7 snrnp 的各个成分的研究一直具有挑战性, 因为 u7 snrnp 在动物细胞中的浓度较低, 而且该复合体在纯化过程中倾向于分离或接受部分蛋白溶解, 因为使用温和的洗涤剂4,5,6, 高盐洗涤和/或多个色谱步骤7,8,9。
最近, 为了确定 u7 依赖加工机械的组成, 用核提取物孵育了含有 3 ' 或 5 ' 的含有生物素的组蛋白前 mrna 的短片段, 并在链球菌包层上捕获了组装的配合物琼脂糖珠5,6,10。由于生物素与链霉素之间的相互作用特别强, 在致密条件下, 通过在 sds 中沸腾, 将固定在链霉素上的蛋白质洗脱, 并进行银染色和质谱分析。虽然这种简单的方法确定了 u7 snrnp 的一些组成部分, 但它产生了相对粗糙的样本, 往往被大量与链霉素珠无关的背景蛋白污染, 有可能掩盖一些成分。加工机械, 防止其检测银染凝胶5,6,10.重要的是, 这种方法也排除了任何功能研究与分离的材料, 并进一步净化其均匀性的额外方法。
随着时间的推移, 提出了一些修改, 以解决生物素/链霉素相互作用几乎不可逆转的性质, 其中大多数是为了削弱相互作用, 或者在生物技术上提供可化学裂解的间隔臂。含有生物素的试剂11,12。所有这些修饰的缺点是, 它们显著降低了方法的效率, 或者在洗脱步骤中经常需要非生理条件, 从而危及纯化蛋白质的完整性或活性。
在这里, 我们描述了一种不同的方法来解决生物素/链霉素策略的固有问题, 使用 rna 底物,其中生物素通过光裂解 1-(2-硝基苯) 乙基体共价连接到 5 ' 端。对长波 uv13,14敏感。我们测试了这种方法, 以净化限制 u7依赖加工机械从果蝇和哺乳动物核提取物15。在对含有生物素的组蛋白前 mrna 和含有核提取物的光裂解链接剂进行短暂的培养后, 将组装好的加工配合物固定在链霉素珠上, 彻底清洗后, 轻轻释放到本地的溶液中通过暴露在 ~ 360 纳米紫外线照射下形成。uv 洗脱法是非常有效, 快速和直接, 产生足够数量的 u7 snrnp 可视化其成分的滑块染色从只有100μl 的提取物15。uv 洗脱材料不含背景蛋白, 适用于直接质谱分析、额外的纯化步骤和酶检测。同样的方法也可以用于纯化需要相对较短的 rna 结合位点的其他 rna·蛋白复合物。生物素和光裂解链接剂也可以共价地附着在单链和双链 dna 上, 有可能扩展紫外洗脱法, 用于纯化各种 dna/蛋白复合物。
含有共价附着生物素和光裂解链接剂的 rna 底物的化学合成, 只有在序列不超过 ~ 65 核苷酸的情况下才是可行的, 对于明显较长的序列来说, 这种合成变得昂贵且效率低下。为了解决这个问题, 我们还开发了一种替代方法, 适用于更长的 rna 结合目标。在这种方法中, 任何长度和核苷酸序列的 rna 都是由 t7 或 sp6 转录在体外生成的, 并在 5 ' 端退火为含有生物素和光裂解链接剂的短的互补寡核苷酸 (trans)配置)。由此产生的双相化随后被用来纯化链状粘胶珠上的单个结合蛋白或大分子复合物, 其方法与含有光裂解生物素的 rna 底物共价的 rna 底物相同的协议相同 (cis)。配置)。通过这种修饰, 可光斑裂解生物素可与含有数百核苷酸的体外生成的转录结合使用, 从而扩展了用于纯化范围广泛的 rn·蛋白的 uv 洗脱方法。
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Protocol
1. 基板准备
注: 短于 ~ 65 核苷酸的 rna 基板可以用生物素 (b) 和光裂解 (pc) 文色剂 (统称为光裂解生物素或 pcb) 共价地合成到 rna 5 ' 端 (cis配置)。含有明显较长结合位点的 rna 底物需要通过 t7 (或 sp6) 转录在体外生成, 然后在 5 ' 端退火含有 pcb 的短补充适应剂寡核苷酸 (反式(图 1)。
- 对于含有少于65个核苷酸的结合位点, 请使用商业制造商 (材料表) 以化学方式合成感兴趣的 rna, pcb 共价连接到 rna 5 的末端 (图 1 a和图 2 a)。溶解在无菌水中, 以达到所需的浓度, 并在-80°c 下储存在小的脂肪中。
- 对于结合位点明显长于 ~ 65个核苷酸, 形成一个具有意义的体外生成 rna 的部分双工和一个含有 5 ' 端 pcb 基团的互补适应剂寡核苷酸 (图 3 a)。
- 在线性化质粒 dna 或适当的 pcr 模板上进行 t7 转录, 以生成在 3 ' 端通过 ~ 20 核苷酸任意序列延伸到感兴趣的结合位点的 rna。
- 使用商业制造商 (材料表) 以化学方式合成一个适配器寡核苷酸, 该寡核苷酸是 t7 生成的 rna 中 3 ' 延伸的补充, 在 5 ' 端含有 pcb (图 3 a)。
注: 两个18原子的间隔和2-3 个非互补核苷酸可以放置在寡核苷酸的 5 ' 端, 以减少潜在的位阻之间的结合复合物和链霉素珠。还需要用 2 ' o-甲基基团均匀地修改寡核苷酸, 以增强双相的强度, 并提供对各种核酸酶的抗性。 - 将 t7 生成的 rna 退火到 pcb 适应剂寡核苷酸上。
- 将 20 pmol 的 rna 和 100 pmol 的适配器 pmol 寡核苷酸 (1:5 摩尔比) 混合在含有100μl 结合缓冲液的 1.5 ml 管中, 其成分如下:75 mm pcB, 15 mm hepes ph 值 7.9, 15% 甘油, 10 mm 乙二胺四乙酸 (edta)。
注: 重要的是要使用最小数量的适配器寡核苷酸, 这足以形成一个双工与大多数 (如果不是全部) 前 mrna 基板用于退火反应。这可以方便地确定在 5 ' 端标记 rna 基板与32p, 退火标记基板与增加数量的适配器寡核苷酸使用各种缓冲条件, 并监测保留条纹微珠上的放射性信号, 几次用结合缓冲液清洗珠子后。 - 将管子放入沸水中5分钟。
- 让水冷却到室温。
- 将 20 pmol 的 rna 和 100 pmol 的适配器 pmol 寡核苷酸 (1:5 摩尔比) 混合在含有100μl 结合缓冲液的 1.5 ml 管中, 其成分如下:75 mm pcB, 15 mm hepes ph 值 7.9, 15% 甘油, 10 mm 乙二胺四乙酸 (edta)。
2. 复杂装配
- 补充小鼠核提取物的1毫升 (或另一种选择的提取物) 与 80 mm edta ph 8 到最后浓度为 10 mm, 以阻止在提取物中存在的非特异性金属依赖性核酸酶。
注: 这将导致将提取中的缓冲区调整为与绑定缓冲区中的组合相同的组合 (请参阅步骤 1.2.3.1)。edta 不影响组蛋白前 mrna 的体外加工, 但在纯化蛋白质或蛋白质复合物方面可能是有害的, 而蛋白质或蛋白质复合物以与镁相关的方式组装。在这些情况下, 应避免 edta。 - 在含有 10 mm edta 的提取物中添加 5-10 pmol 标记为cis (步骤 1.1) 或反式(步骤 1.2.3.3) 的 rna 基板。
注: rna 的数量需要在一系列的试验实验中仔细评估。使用过多的 rna 基板纯化一个有限的复杂可能适得其反, 显著增加了非特异性 rna 结合蛋白的背景, 而不会对特定蛋白质的产量产生任何影响。 - 用提取物在冰上培养 rna 底物 5分钟, 偶尔将样品混合。
注: 孵育的时间和温度都需要根据经验确定, 并可能会有很大差异, 具体取决于 rna\ 蛋白复合物的具体性质。 - 将孵育混合物在预冷微型离心机中旋转 10分钟, 在 10, 000 x g 处去除任何潜在的沉淀物, 并小心地收集上清液, 避免转移颗粒。
3. 在链球菌珠上固定化 rnan 蛋白配合物。
- 从商业供应商 (材料表) 转移 ~ 100μl 链霉素珠悬浮液到 1.5 ml 管, 并增加体积与结合缓冲液 (75 mL kcl, 15 mL hepes ph 值 7.9, 15% 甘油, 10 mL edta)。
注: 此缓冲液的成分应与退火混合物和用于复杂装配的萃取物中的组合相同 (步骤 2.1)。 - 在管的底部收集珠子, 在 25 x 克旋转 2-3分钟, 并吸气上清液。
- 重复相同的洗涤/纺纱过程2-3 次, 使珠子与结合缓冲液平衡。
注: 在此步骤结束时, 珠子的颗粒体积应为 ~ 30μl。 - 将包含组装复合物 (步骤 2.4) 的上清液装上平衡的链霉素琼脂糖珠。
- 在4°c 下旋转 1小时, 使 rna 和结合复合物固定在珠子上。
- 在 25 x 克的情况下, 通过旋转2-3分钟收集管底部的珠子。
注: 使用摆动转子, 以避免大量损失的珠子, 如果他们倾向于坚持在角转子的管的一侧。 - 使用相同的离心条件, 用1毫升的结合缓冲液对珠子进行吸干和两次冲洗。
- 加入1毫升的绑定缓冲区, 并在4°c 下旋转样品1小时。
注: 如果在基板上形成的复合物趋于离解, 则此步骤可以缩短。 - 在 25 x g 处向下旋转珠子 2-3分钟, 添加1毫升的缓冲器, 并将悬浮液转移到新的管中。
- 旋转1小时或更短, 如果复合物不稳定, 在 25 x g 处向下旋转 2-3分钟, 并在200μl 的结合缓冲液中将珠子转移到500μl 管中。
4. 紫外线--------------------
- 打开高强度紫外线灯, 发出365纳米紫外线, 5-10, 然后达到完全的亮度。
注: 这对于在辐照开始时实现最大的紫外线发射能量至关重要。 - 用紧密包装的冰填充培养皿 (100 毫米 x15 毫米), 并将其堆放在盘子的盖子上。
- 将含有固定化复合物的管短暂旋转, 将其水平放置在冰上, 并与预热灯覆盖, 确保样品位于灯泡表面2-3 厘米的距离内。
注: 如果距离太大, 请使用额外的 petri 培养皿或其他合适的对象, 使样品更接近灯泡。 - 辐射共 30分钟, 经常反转和涡旋管, 以确保悬架均匀暴露于紫外线, 并防止过热。
注: 为了提供额外的冷却, uv 洗脱步骤可以在冷藏室中进行。切换到一个培养皿与新鲜的冰, 以防过度融化冰。 - 在 25 x 克的情况下将珠子向下旋转 2-3分钟, 并收集上清液。
- 用相同的条件重新旋转上清液, 收集上清液。
注: 在底部留少量上清液, 以避免转移残留的珠子。
5. 银染色样品分析, 然后进行质谱分析。
- 使用 sdsp 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离一小部分紫外线洗脱的上清液和在 uv 洗脱后留在珠子上的相同比例的材料。
注: 分析还可能包括在紫外线洗脱之前从样品中提取的珠子的一个小块。 - 使用市售的银染色试剂盒, 对含有分离蛋白质的凝胶进行染色。
- 通过比较 uv 洗脱上清液中存在的蛋白质强度和紫外线照射后留在珠子上的蛋白质强度来评价紫外线洗脱的效率。
- 利用标准协议 10, 15, 通过质谱测定感兴趣的蛋白质带并确定其身份。
6. 用质谱法对紫外光洗脱样品进行全局分析。
- 用质谱法直接分析了一小部分紫外光洗脱的上清液, 以无偏的方式测定纯化材料的整个蛋白质组。
注: 这可以通过用胰蛋白酶对纯化样品进行溶液处理, 然后采用标准质谱协议,以确定产生多肽 10,15的身份。
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Representative Results
uv 洗脱法在 pcb (cis配置) 的 5 ' 端共价连接在 pcb mi众 (cis 配置) 上, 用两种化学合成 rna 基板进行了测试: pcb-sl (图 1) 和 pcb-dh 5 型 rna (图 2)。31核苷酸 pcb-sl rna 包含一个茎环结构, 其次是5核苷酸单链尾, 其序列与成熟组蛋白 mrna 的 3 ' 端相同 (即, 在 u7 snRNP 的组蛋白前 mrna 裂解后)。这个独特的序列是哺乳动物细胞质分数中存在的两种蛋白质的已知结合位点: slbp 和 3 ' hexo16,17,18。pcb-dh 5 是德索菲拉h3 组蛋白的63核苷酸片段, 除了茎环之外, 还含有一个结合五合五代菌 u7 snRNP 的序列 (图 2)。
dh3 ext (125 核苷酸) 是一个较长的 rna 底物的例子, 可通过 t7 转录生成, 并通过退火到 pcb/22mer ( 配置)。pcb/2 22mer 包含 5 ' 末端的两个组, 由 22 2 ' o ' o ' 甲基修饰核苷酸组成 (图 3 a)。图 3a 中序列中 pcB/22mer(underlined 3 ' 端的19个核苷酸是 dh3 ext 前 mrna 最后19个核苷酸的互补。这种前 mrna 除了更长的时间没有明显的区别, 与合成的 pbb-dh搜救/5, 包含相同的两个关键处理信号: 茎环和 u7 结合位点。
以 19. 小鼠骨髓瘤细胞细胞细胞质组分为 s100 提取物1毫升 (100, 000 x x g, 1 h) 孵育, 首先用银染色法分析 uv 洗脱的效果和效率。在 uv 洗脱术前, 在链霉素珠子上检测到了许多蛋白质 (图 1b, 第1车道)。长波紫外线照射只将其中的一些蛋白质释放到上清液 (图 1b, 车道 3), 在珠子上留下一个非特异性的背景 (图 1b, 车道 2), 因此强调了紫外线洗脱步骤的重要性。主要的 uv 洗脱蛋白被质谱法确定为 3 ' hexo 和 slbp, slbp 由全长蛋白 (fl) 和一些较短的降解产物 (dp) 表示。被确定为各种 rna 结合蛋白 (rbp) 的少量其他蛋白质也通过紫外线照射选择性地释放到溶液中 (图 1b, 车道 3)。
pcb-dhn/5 米前 mrna (图 2) 或 dh3 ext 前 mrna 退火后 mrna (图 3) 用1毫升的核素从灵气 kc 细胞中提取, 形成加工复合物20,21。为了更好地评估与每个组蛋白前 mrna 结合的蛋白质的特异性, 在核提取物中添加了两个竞争对手, 同时制备了负对照: 隔离 slbp 的 sl rna 和与对对的短反义寡核苷酸u7 snrna, 并防止 u7 snrnp 与其在 mrna 前的位点相互作用。
固定化的 pcb-dh5/5 米前 mrna 的紫外线洗脱步骤导致只有少量蛋白质被选择性释放到上清液 (图 2b, 车道 1), 珠子上还有非常强烈的非特异性蛋白质背景 (图 2b), 车道 3)。这些标记为 a-i 的蛋白质被质谱法鉴定为 u7 snRNP15的成分。该样品还含有部分降解的 slbp, 在 10 kda 迁移, 只能在浓度较高的 sdss/聚丙烯酰胺凝胶上可见。所有这些蛋白质都没有在两个处理竞争对手的存在下检测到, 这两个竞争对手阻止 u7 snrnp 与组蛋白前 mrna 的结合 (图 2b, 车道 2)。
通过对由 dh3 ext prnna 和 pcb/2 聚物 (图 3b, 车道 1) 组成的固定化双面光的紫外线照射, 将d赛菲拉u7 snrnp 的相同成分释放到溶液中。该样本还含有多个 rna 结合蛋白, 与 pcB/22mer 寡核苷酸相互作用, 用于与 dh3 ext 预 mrna 形成双相。与 u7 snrnp 的亚基不同, 这些污染蛋白以及留在珠子上的所有背景蛋白都存在于加工竞争对手的存在中 (图 3b, 比较车道1和 2, 以及车道3和 4)。
含有加工配合物的紫外线上清液的一小部分和负对照中的 uv 上清液的相同部分 (在两个竞争对手寡核苷酸的存在下制备, 因此缺乏加工配合物) 可以直接得到用质谱分析, 不事先分离洗脱的蛋白质, 用凝胶电泳15。这种方法是非常敏感的检测所有洗脱的蛋白质, 无论其大小和丰度, 并与阴性样本一起提供了一个完整和无偏见的蛋白质列表, 特别是与组蛋白前 mrna 进行 3 ' 结束加工反应。
图 1: 与 pcb-sl rna 结合的小鼠细胞质蛋白的纯化.(a) 化学合成的 pcb-sl rna (31 核苷酸) 图。生物素 (biot) 在 5 ' 端之后是对长波 uv (366 nm)、两个18个原子间隔和31个核苷酸敏感的光裂解 (pc), 这些材料形成了在成熟组蛋白 mrna 的 3 ' 端发现的保守茎环结构。(b) pcb-sl rna 采用小鼠骨髓瘤细胞的 s100 细胞质提取物孵育。对 rna 和结合蛋白进行纯化, 广泛清洗, uv 洗脱, 并通过银染色 (第3车道) 进行分析。在紫外线洗脱前固定在链霉素上的蛋白质, 在紫外线洗脱后留在珠子上, 分别显示在1号车道和2号车道上。蛋白质大小标记的位置 (以 kda) 显示在左侧。
图 2: 在 pcb-dhh5 5 米前 mrna 上组装的嗜酸性粒细胞加工复合物的纯化。化学合成的 食子体特异性 pcb-dh 5 米前 mrna (63 核苷酸) 图。5 ' 端的生物素 (biot) 之后是光裂解 (pc)、两个18原子间隔和63个核苷酸, 其中包含两个基本处理的序列元素: 茎环结构和 u7 结合位点。在复杂的组装过程中, 位于两个元素之间的主要裂解位点周围的五个核苷酸被修改为 2 ' o-甲基基团, 以阻止 u7 snrnp 的裂解 (交叉线)。(b) pcb-dhn 5 与五合体核提取物一起孵育, 组装加工复合物。在负对照中, 核提取物包含两个处理竞争者, 以阻断 slbp 和 u7 snrnp 与组蛋白前 mrna 的结合。组装的配合物固定在链霉素珠上, 通过样品暴露在长波紫外线下进行广泛清洗并释放到溶液中。用银染色分析了 uv 洗脱材料 (uv-suv) 和 uv 洗脱后的珠子的相同组分。右侧显示了蛋白质大小标记 (kda) 和链霉素 (sa) 的位置。
图 3: 在 dh3 ext 预 mrna 上组装的嗜油菌加工复合物的纯化, 这些复合物以反式连接到光裂解基团上。(a) 退火 t7 生成的 dh3 ext 前 mrna 和化学合成的 pcB/22mer 寡核苷酸所产生的 dh3 ext 双工图, 其顺序如下: 5 ' biot/pcc1. 18s1/amgmumumumumumumumummcmcmmmmmcmcmumumc。在寡核苷酸中, 生物素 (biot) 被放置在 5 ' 端, 其次是光裂解 (pc) 链接器。最后19个核苷酸 (在上述序列中下划线) 是对添加到 dh3 ext 前 mrna 的3个扩展的补充。2 ' o-甲基修饰的存在 (未在图中注明) 有两个用途: 它稳定寡核苷酸对提取核酸酶, 并增加由 dh3 ext 预 mrna 形成的双相的强度。(b) dh3 ext 双工是在没有或在加工竞争者在场的情况下用dhofra kc 核提取物孵育的, 固定在链霉素珠上, 广泛清洗, 并与结合蛋白一起洗脱紫外线。用银染色分析了 uv 洗脱材料 (uv 抑制, 1 和2道) 和 uv 洗脱后的珠子 (uv 珠子, 3号和4号通道) 的相同成分。加工配合物的特定成分 (那些被加工竞争对手淘汰的) 用 a 到 f 字母表示。主要的非特异性 rna 结合蛋白 (那些是紫外线洗脱, 但在两个加工竞争对手的存在中持续存在的) 用星号表示。右侧显示了蛋白质大小标记的位置 (以 kda 为)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这里描述的方法很简单, 除了纳入光裂解链接器和 uv 洗脱步骤没有区别于常用的方法, 利用生物素和链霉素之间的极强的相互作用。uv 洗脱步骤是非常有效的, 通常释放75% 以上的固定化 rna 和相关的蛋白质从链霉素珠, 留下了一个高背景的蛋白质, 非专门结合到珠子。通过消除这种背景, uv 洗脱步骤产生了非常纯净的样品, 适用于银染色、质谱和功能分析的直接分析。
由于涉及相对较少和简单的步骤, uv 洗脱方法是高度可重复的, 提供足够数量的 u7 snrnp 银染色从只有100μl 的小鼠和果蝇核提取物 15.该方法是以前用于纯化 rn·蛋白复合物的其他实验策略的一个有吸引力的替代方法, 包括用 ms2 结合位点标记 rna 底物, 并通过 ms2-mbp 融合在直链淀粉珠上固定相关复合物蛋白。ms2 策略虽然成功地分离出相对丰富的分裂体和规范 3 ' 的末端处理复合物22,23, 但未能产生足够数量的含有 u7 snrnp (zd, 未公布) 的加工配合物结果), 其在动物细胞中的浓度约为主要 u1 分离体 snrnp 的100倍。
该协议的许多方面需要修改, 以满足各种单独的研究目标, 并产生最佳的结果与其他 rna\ 蛋白复合物。首先, 重要的是要将用于复杂组件的 rna 基板的数量与提取物中存在的这种复合体的数量相匹配。对于限制复合物, 包括 u7 snrnp, 使用过多的底物会适得其反, 只会增加 uv 上清液中非特异性 rna 结合蛋白的背景。其次, 优化孵育的长度和温度也很重要, 以促进复合物的剧烈组装, 同时防止其由于潜在的蛋白溶解或 rna 过度降解而离解。
在与 u7 依赖的加工配合物和类似的 rna1-蛋白复合物进行酶活性的工作中, 一个关键的困难是, 在完全组装后, 它们可能会由于催化而分离。组蛋白预 mrna 的裂解即使在低温下也能迅速发生, 显著降低了纯化加工复合物的产量。为防止这种不良影响, 在化学合成过程中, 用 2 ' o ' mb 基团 (5 米) 10 对 pcb-dhh 5-5 年前 mrna 中的主要裂解位点和附近的四个核苷酸进行了改性。这种前 mrna 几乎完全抵抗 u7 snrnp 的裂解, 可以在室温下用核萃取物孵育 60分钟, 而不会造成可检测到的复杂干扰。t7 生成的 dh3 出口退火到 pcB/22mer 缺乏这些修改, 它与核提取物的孵育在冰上进行5分钟或更短, 以限制催化。pcb-sl rna 含有成熟的 3 ' 端的组蛋白 mrna, 在细胞质提取物中不进行任何加法处理。3 ' hexo, 这是镁依赖 3 '-5 ' 出口酶能够去除2-3 核苷酸的单链尾巴在体内24,25, 但在体外, 其活性受到 edta16的存在抑制。因此, pcb-sl rna 可以在室温下长时间在细胞质提取物中孵育, 而不会产生任何不利影响, 尽管通常在冰上进行短孵育就足以形成带有 slbp 和 3 ' hexo 的 rna 三元复合体。
在 uv 洗脱法的两个替代变种中, 使用含有生物素的 rna 底物和 cis 中的光裂解链接器 (共价连接到 rna 的 5 ' 端) 总体上比较简单, 并产生相对纯的样品。这种方法的一个重要限制是, 这两个组可以共价地附着在 rna 基板上, 不超过 ~ 65个核苷酸。较长的 rna 结合靶点可以通过自适应剂寡核苷酸附着在反式的 pcb 位上。然而, 这种方法可能会产生更高的背景非特异性蛋白质, 往往结合多余的适应寡核苷酸。因此, 重要的是只使用最小的摩尔过量的寡核苷酸足以结合实验中使用的所有前 mrna 底物。
适配器寡核苷酸的序列、长度和化学性质可以改变, 以提高其与 rna 基板中互补序列配对的能力, 同时降低其与非特定 rna 结合蛋白相互作用的能力。最后, 在用于复杂形成之前, 可将与适配器寡核苷酸重复的较长的前 mrna 基板固定在链霉素上。这种预选方法的一个优点是, 它消除了样品 rna 分子, 未能退火到寡核苷酸。这些分子保持了在萃取物中组装成复合物的正常能力, 但无法将链霉素珠结合起来, 从而部分降低了纯化的产量。
除了净化组装在单链 rna 基板上的复合物外, 以类似方式的 uv 洗脱方法还可用于纯化结合单链和双链 dna 序列的蛋白质或蛋白质复合物。
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Disclosures
作者们没有什么可以透露的
Acknowledgments
我们感谢我们的同事和合作者对我们工作的贡献。这项研究得到了国家卫生研究院 gm 29832 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
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