Summary
Botin streptavidin 전략을 사용 하 여 정화 RNA 또는 단백질 복합물은 eluted 더 정화와 기능 분석에 대 한 부적 절 한 형태로 변성 조건에서 솔루션. 여기, 우리가 네이티브 및 완전 한 기능 RNA 또는 단백질 복합물 저조한 RNA와 부드러운 UV 차입 단계 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여이 전략의 설명.
Abstract
많은 년간, biotin와 streptavidin 사이의 매우 강력 하 고 급속 하 게 형성 된 상호 작용은 생물학으로 중요 한 RNA 또는 단백질 복합물의 부분 정화에 대 한 성공적으로 이용 되어. 그러나,이 전략의 광범위 한 사용을 제한 하는 하나의 주요 단점에서 고통: biotin/streptavidin 상호 작용 또한 따라서 제외 eluted 단지의 무결성을 중단 시킬 조건을 변성 시키기의 밑 에서만 깨진 수 있습니다 그들의 이후 기능 분석 및/또는 다른 방법으로 추가 정화. 또한, eluted 샘플 자주 nonspecifically streptavidin 구슬, 순화 된 단지의 분석은 얼룩 및 질량 분석에 의해 복잡 하 게 연관 배경 단백질 오염. 이러한 한계를 극복 하기 위해 우리는 biotin 사진 쪼갤 링커를 통해 RNA 기판에 연결 된와 streptavidin 구슬에 움직일 단지는 선택적으로 eluted 솔루션에 biotin/streptavidin 전략의 변종 개발을 장파 UV, 구슬에 배경 단백질을 떠날에 의해 기본 형태. 짧은 RNA 바인딩 기판 수 수 합성 화학적으로 biotin과 covalently는 RNA의 5' 끝에 첨부 된 사진 쪼갤 링커 반면 긴 RNA 기판 보완 oligonucleotide에 의해 두 그룹으로 제공 될 수 있다. UV-차입 방법의이 2 개의 이체 3' 끝 히스톤 사전-mRNAs를 쪼개 U7 snRNP 종속 처리 단지의 정화에 대 한 테스트 되었습니다 그리고 그들은 둘 다 이전 다른 호의 베 풀 비교 하 정화 방법을 개발 입증. UV eluted 샘플 포함 쉽게 감지 양의 U7 snRNP 주요 단백질 오염 물질의 무료 하 고 질량 분석 및 기능 분석 실험에 의해 직접 분석에 적합 했다. 설명된 메서드를 쉽게 다른 RNA 바인딩 복합물의 정화에 대 한 적응 하 고 DNA 특정 단백질 및 고분자 복합물 정화 단일 및 이중 가닥 DNA 바인딩 사이트와 함께 사용 될 수 있습니다.
Introduction
진핵생물, RNA 중 합 효소 II 생성 mRNA 선구자 (pre-mRNAs) 세포질에서 단백질 합성에 대 한 완전 한 기능 mRNA 템플릿이 되기 전에 핵에서 여러 성숙 이벤트를 받 다. 이러한 이벤트 중 하나는 3' 끝 처리입니다. 사전 mRNAs의 대부분, 3' 끝 처리 polyadenylation 결합 절단을 포함 한다. 상대적으로 풍부한 복잡 하 여이 2 단계 반응 촉매는 15 개 이상의 단백질1의 구성 된. 동물 복제 종속 히스톤 사전 mRNAs 3' 끝에 핵심 역할 U7 snRNP, ~ 60 뉴클레오티드 및 여러 단백질2,3 의 U7 snRNA 구성 된 복잡 한 낮은 풍부에 의해 재생 됩니다. 다른 메커니즘에 의해 처리 됩니다. . 히스톤 사전-mRNA와 U7 snRNP의 소 단위 중에 특정 순서로 U7 snRNA 기본적인 쌍 catalyzes 분열 반응, 성숙한 히스톤 생성 mRNA는 많은 없이 꼬리. 히스톤 사전-mRNA의 3' 끝 처리도 필요 줄기 루프 바인딩 단백질 (SLBP), 보존된 줄기 루프 위치를 바인딩하는 분열 사이트의 업스트림 기판2,3U7 snRNP의 채용을 향상 시킵니다. U7 snRNP의 개별 구성 요소를 식별 하기 위한 연구에 동물 세포에서 U7 snRNP의 낮은 농도와 해리 또는 부분 베이스를 사용 하 여 결과로 정화 동안 받아야 복잡 한 경향이 도전 되었습니다. 온화한 세제4,,56, 높은 소금 세척 및/또는 여러 컬럼에 단계7,,89.
최근, U7 종속 처리 기계의 구성 결정, 3' 또는 5'에서 히스톤 사전 mRNA 포함 biotin의 짧은 조각 핵 추출으로 incubated 했다 및 조립된 단지 streptavidin 입히는에 체포 되었다 agarose 구슬5,,610. Biotin과 streptavidin 사이 매우 강한 상호 작용으로 인해 단백질 streptavidin 구슬에 움직일 SDS에 끓는 조건을 변성 시키기에서 eluted 되었고 실버 얼룩 및 질량 분석에 의해 분석. 이 간단한 접근 U7 snRNP의 구성 요소 번호를 식별 하는 동안 그것은 상대적으로 원유 샘플, 종종 nonspecifically streptavidin 구슬, 잠재적으로 마스크의 일부 구성 요소에 바인딩된 배경 단백질의 많은 오염 나왔고 처리 기계 및 실버에 그들의 탐지를 방지 젤5,,610스테인드. 중요 한 것은,이 방법은 또한 추가 방법으로 격리 된 물자와 동질성을 더 정화의 어떤 기능 연구를 배제.
수정 수 중 상호 작용을 약하게 하거나에 화학적으로 쪼갤 스페이서 팔 제공 하 여 설계 되 고 그들의 대부분과 함께 비타민 b 복합체/streptavidin 상호 작용의 거의 돌이킬 수 없는 자연을 해결 하기 위해 시간이 지남에 제안 합니다 biotin 포함 시 약11,12. 이러한 모든 수정의 단점은 그들은 크게 무결성 또는 순화 된 단백질의 활동을 위태롭게 차입 단계 방법을 자주 필요한 비 생리 적 조건의 효율성 감소 했다.
여기, 우리 고유의 문제를 해결 하려면 다른 방법을 설명 RNA를 사용 하 여 비타민 b 복합체/streptavidin 전략의 기판에 biotin covalently에 연결 5' 를 통해 끝내는 사진 쪼갤 1도-(2-nitrophenyl)은 에틸 moiety 장파 UV13,14에 민감한. 우리는 초파리 에서 제한 U7 종속 처리 기계의 정화에 대 한이 접근을 테스트 하 고 포유류 핵15를 추출 합니다. 히스톤 사전 mRNA 포함 biotin의 짧은 외피와 핵 추출와 사진 쪼갤 링커, 조립된 처리 단지는 streptavidin 구슬에 움직일 수 철저 하 게 세척, 부드럽게 네이티브에서 솔루션 출시 ~ 360 nm UV 빛에 노출에 의해 형태. UV-차입 방법은 매우 효율적, 신속 하 고 간단, 저조한 은색 추출15의 작은 100 µ L에서 얼룩에 의해 그것의 구성 요소를 시각화 하기 위해 U7 snRNP의 충분 한 양을. UV eluted 자료 배경 단백질의 무료 이며 직접 질량 분석 분석, 추가 정화 단계 및 효소 분석 실험에 적합. 동일한 방법은 비교적 짧은 RNA 바인딩 사이트를 필요로 하는 다른 RNA 또는 단백질 복합물의 정화에 대 한 채택 될 수 있습니다. Biotin과 사진 쪼갤 링커 수 또한 covalently 장착할에 단일 및 더블-좌초 DNA, 잠재적으로 다양 한 DNA/단백질 복합물의 정화에 대 한 UV 차입 메서드를 확장.
Covalently 포함 된 RNA 기판의 화학 합성 연결 biotin 이며 사진 쪼갤 링커만 ~ 65 뉴클레오티드를 초과 하지 않는 시퀀스와 실용적인 비싸고 시간이 오래 시퀀스 비효율적 되고있다. 이 문제를 해결 하기 위해 우리는 또한 훨씬 더 긴 RNA 바인딩 대상에 적합 한 대체 접근을 개발 했다. 이 방법에서는, 어떤 길이 뉴클레오티드 순서의 RNA 생성 된 생체 외에서 SP6 또는 T7 전사에 의해 이며 biotin과 5' 끝 (트랜스 에 사진 쪼갤 링커 포함 하 고 하는 짧은 보완 oligonucleotide를 단련 구성)입니다. 결과 이중은 이후 개별 바인딩 단백질 또는 고분자 복합물 streptavidin 구슬 같은 프로토콜 covalently 첨부 사진 쪼갤 biotin 포함 된 RNA 기판에 대 한 설명 다음에 정화 하는 데 사용 됩니다 (cis 구성). 이 수정 사진 쪼갤 biotin에서 생체 외에서 생성 된 성적 정화의 광범위 한 범위의 RNA/단백질을 위한 UV 차입 메서드를 확장 하는 뉴클레오티드의 수백을 포함와 함께에서 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 기판 준비
참고: ~ 65 뉴클레오티드 보다 짧은 RNA 기판 biotin (B)와 사진 쪼갤 (pc) 링커 (통칭 사진 쪼갤 biotin 또는 pcB) covalently RNA 5' 끝 (cis 구성)에 연결 된 화학적으로 합성 될 수 있다. 상당히 긴 바인딩 사이트를 포함 하는 RNA 기판 생성 된 생체 외에서 T7 (SP6) 전사에 의해 있어야 하 고 이후 5' 끝 (트랜스 에 pcB moiety를 포함 하는 짧은 보완 어댑터 oligonucleotide를 단련 구성) (그림 1).
- 미만 ~ 65 뉴클레오티드로 구성 된 바인딩 사이트 사용 상업 제조 업체 (자료 테이블) 화학적 관심의 RNA 합성 pcB와 covalently RNA 5' 끝 (그림 1A 및 그림 2A)에 첨부. 원하는 농도 달성 하 여-80 ° c.에 작은 aliquots에 저장 살 균 물에 용 해
- 바인딩 사이트 크게 이상 ~ 65 뉴클레오티드, 형태는 생체 외에서 의 부분적인 이중 생성 관심과 5' 끝 (그림 3A)에 pcB moiety를 포함 하는 상호 보완적인 어댑터 oligonucleotide의 RNA.
- 선형화 플라스 미드 DNA 또는 적절 한 PCR 템플릿을 관심 ~ 20-뉴클레오티드 임의의 순서에 의해 3' 끝 확장의 바인딩 사이트와 RNA 생성에 T7 전사를 수행 합니다.
- 상업적인 제조 업체 (테이블의 재료)를 사용 하 여 3' 확장 T7 생성 RNA에 무료 이며 5' 끝 (그림 3A)에 pcB를 포함 한 어댑터 oligonucleotide를 화학적으로 합성.
참고: 두 명의 18-원자 스페이서와 2-3 비 보완 뉴클레오티드는 바인딩된 복잡 하 고 streptavidin 구슬 사이 잠재적인 입체 방해를 줄이기 위해 oligonucleotide의 5' 끝에 배치할 수 있습니다. 그것은 또한 바람직한는 oligonucleotide 2' O-메 틸 그룹 이중의 강도 강화 하 고 다양 한 nucleases에 대 한 저항을 제공 하기 위해 수정 균일 하 게 됩니다. - PcB 어댑터 oligonucleotide T7 생성 RNA anneal
- RNA의 믹스 20 pmol 및 어댑터 pcB oligonucleotide (1:5 어 금 니 비율) 1.5 ml에서의 100 pmol 튜브 바인딩 버퍼 다음 구성의 포함 100 µ L: 75 m m KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, 15% 글리세롤 10 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA).
참고: 그것은 어 닐 링 반응에 사용 되는 (만약에 모두 아닙니다) 대부분 사전 mRNA 기판와 쌍 신 회로 형성 하기에 충분 한 어댑터 oligonucleotide의 최소 금액을 사용 하는 것이 중요. 이 편리 하 게 다양 한 버퍼 조건 및 모니터링의 보존 32P, 어 닐 링 사용 하 여 어댑터 oligonucleotide 양의 증가 함께 레이블이 기판 5' 끝에 RNA 기판 라벨에 의해 결정 될 수는 바인딩 버퍼와 구슬의 여러 세척 후 streptavidin 구슬에 방사성 신호. - 끓는 5 분 동안 물에 튜브를 놓습니다.
- 실내 온도에 아래로 냉각 하기 위하여 물을 수 있습니다.
- RNA의 믹스 20 pmol 및 어댑터 pcB oligonucleotide (1:5 어 금 니 비율) 1.5 ml에서의 100 pmol 튜브 바인딩 버퍼 다음 구성의 포함 100 µ L: 75 m m KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, 15% 글리세롤 10 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA).
2. 복잡 한 어셈블리
- 추출 물에 존재 하는 일반적인 금속 종속 nucleases 차단 10 mM의 최종 농도에 80 mM EDTA ph 8 마우스 핵 추출 물 (또는 선택의 다른 추출) 1 mL를 보충.
참고:이 귀 착될 것 이다 바인딩 버퍼에서 것과 같은 구성에 추출에서 버퍼를 조정 (단계 1.2.3.1 참조). EDTA는 생체 외에서 히스톤 사전-mRNAs의 처리에는 영향을 미치지 않습니다 하지만 단백질 또는 단백질 복합물 마그네슘 종속 방식으로 조립 하는 정화에 해로울 수 있습니다. 이러한 경우에 EDTA는 피해 야 한다. - Cis 에서 pcB moiety 태그로 RNA 기판의 5-10 pmol 추가 (단계 1.1 참조) 또는 트랜스 (단계 1.2.3.3 참조) 10 mM EDTA를 포함 하는 추출 물의 1 ml.
참고: RNA의 양을 신중 하 게 일련의 시험 실험에서 평가 될 필요가 있다. 어쩌면 비 생산적, 크게 증가 하는 일반적인 RNA 의무적인 단백질의 배경을 특정 단백질의 수익률에 영향 없이 복잡 한 제한의 정화에 대 한 너무 많은 RNA 기질을 사용 하 여. - 가끔 샘플 혼합 얼음에 5 분 동안 추출 된 RNA 기판 품 어.
참고: 두 시간 및 온도 외피의 경험적으로 설립 될 필요가 RNA 또는 단백질 복합물의 특정 특성에 따라 크게 다를 수 있습니다. - 어떤 잠재적인 침전 제거 하 고 신중 하 게 표면에 뜨는 피하 펠 릿 전송 수집 하 10000 x g에서 10 분에 대 한 사전 냉각된 microcentrifuge에 인큐베이션 혼합물을 회전 합니다.
3. Streptavidin 구슬에 RNA 또는 단백질 복합물의 동원 정지.
- 1.5 mL 튜브에 상업적인 공급자 (자료 테이블)에서 ~ 100 µ L streptavidin agarose 구슬에 서 스 펜 션의 전송 및 바인딩 버퍼 (75 m m KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, 15% 글리세롤, 10 mM EDTA) 볼륨을 증가.
참고:이 버퍼는 어 닐 링 혼합물 및 복잡 한 어셈블리 (단계 2.1) 사용 하는 추출 것과 동일한 구성을 해야 합니다. - 25 x g 2-3 분 동안 회전 하 여 튜브의 하단에 비즈를 수집 하 고는 상쾌한 발음.
- 2-3 번 같은 세척/회전 절차를 반복 바인딩 버퍼와 구슬 equilibrate에.
참고:이 단계의 끝에, 구슬의 펠 릿 있어야의 볼륨 ~ 30 µ L. - 조립된 복잡 (단계 2.4)를 포함 하는 상쾌한 equilibrated streptavidin agarose 구슬에 로드 합니다.
- RNA와 구슬에 바인딩된 단지 무력화 하 4 ° C에서 1 시간 회전할.
- 25 x g 2-3 분 동안 회전 하 여 튜브의 하단에 비즈를 수집 합니다.
참고:로 터 밖으로 스윙을 사용 하 여 손실을 방지 하기 위해 상당한 구슬의 경우 그들은 터의 각도에서 튜브의 측면을 준수 하는 경향이. - 발음은 상쾌한 고 구슬 같은 원심 분리 조건을 사용 하 여 바인딩 버퍼의 1 mL로 두 번 씻어.
- 바인딩 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 샘플 4 ° c.에 1 시간 회전
참고:이 단계는 기판에 형성 하는 복잡 한 해리 경향이 경우 단축 될 수 있습니다. - 25 x g 2-3 분 위한 구슬 아래로 회전 시키십시오, 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 새 튜브를 정지를 전송.
- 추가 1 시간 또는 더 짧은, 복잡 한 경우, 스핀 다운 25 x g 2-3 분 위해를 바인딩 버퍼의 200 µ L에 500 µ L 튜브에 비즈를 전송.
4입니다. UV-차입입니다.
- 고 강도 완전 광채를 도달 하기 전에 5-10 분에 대 한 365 nm 자외선을 방출 하는 자외선 램프를 켭니다.
참고: 이것은 방사선의 시작에서 UV 방출의 최대 에너지를 달성 하 게 근본적 이다. - 단단히 포장 얼음 페 트리 접시 (100 m m x 15 m m)의 하단을를 접시의 뚜껑 위에 스택 수 있습니다.
- 짧게 소용돌이 고정된 복잡 한, 포함 된 튜브 자리 가로에 얼음과 커버 샘플 전구의 표면의 2-3 cm의 거리에서 되도록 미리 예 열된 램프와.
참고: 거리 너무 큰 경우 사용 하 여 추가 접시 또는 다른 적합 한 개체 전구에 가까운 샘플을가지고. - 30 분, 자주 반전 및 vortexing의 총 비추는 튜브 UV 정지의 균일 한 노출을 보장 하 고 과열을 방지 하기 위해.
참고: 추가 냉각을 제공 하기 위해 UV 차입 단계 수행할 수 있습니다 밖으로 추운 방에. 과도 한 얼음 녹는 경우 신선한 얼음 페 트리 접시로 전환. - 25 x g 2-3 분 위한 구슬 아래로 회전 시키십시오 고는 상쾌한을 수집 합니다.
- 다시 동일한 조건을 사용 하 여 상쾌한 회전 하 고는 상쾌한을 수집 합니다.
참고: 잔여 비즈를 전송 하지 않으려면 아래에서 상쾌한의 작은 금액을 남겨 주세요.
5. 샘플 분석은 얼룩이 다음 질량 분석.
- 사용 SDS/polyacrylamide 젤 전기 이동 법 UV eluted 상쾌한의 분수와 UV 차입 다음 구슬에 남은 재료의 동일한 부분을.
참고: 분석 UV 차입 하기 전에 샘플에서 철회 구슬의 약 수를 포함할 수 있습니다. - 상용은 얼룩 키트를 사용 하 여 분리 된 단백질을 포함 하는 젤을 얼룩.
- 단백질에 존재 하는 UV eluted 상쾌한 고 UV 조사에 따라 구슬에 그의 농도 비교 하 여 UV 차입의 효율성을 평가 합니다.
- 관심의 단백질 밴드를 삭제할 고 표준 프로토콜10,15를 사용 하 여 질량 분석에 의해 그들의 정체성을 결정 합니다.
6. 글로벌 질량 분석에 의해 UV eluted 샘플의 분석.
- 직접 질량 분석 편견으로 순화 된 물자의 전체 프로테옴을 결정 하 여 UV eluted 상쾌한의 일부분을 분석 합니다.
참고:이 해질 수 있다 순화 된 샘플의 솔루션에서 처리 하 여 표준 질량 분석 프로토콜 생성 펩 티 드10,15의 id를 확인을 다음 트립 신으로.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UV-차입 메서드 covalently pcB moiety (cis 구성)에 5' 끝에 연결 된 두 개의 화학적 합성된 RNA 기판 테스트 했다: pcB-SL (그림 1) 및 pcB-dH3/5 m RNAs (그림 2). 31-뉴클레오티드 pcB-SL RNA 포함 5 뉴클레오티드 단 하나 좌초 된 꼬리 뒤 줄기 루프 구조와 그 시퀀스는 성숙한 히스톤의 3' 끝 mRNA (즉., 히스톤 사전-U7 snRNP에 의해 mRNA의 분열 후). 이 독특한 시퀀스 두 단백질 현재 포유류 세포질 분수에 대 한 알려진된 바인딩 사이트입니다: SLBP 3' hExo16,,1718. pcB-dH3/5 m 초파리 H3 히스톤 사전-mRNA의 뉴클레오티드 63 조각 이며 줄기 루프 이외에 초파리 U7 snRNP (그림 2)는 시퀀스를 포함 합니다.
dH3 내선 (125 뉴클레오티드) T7 전사에 의해 생성 되 고 트랜스 에 biotin와는 사진 쪼갤 pcB/22mer, 화학적 합성된 어댑터 oligonucleotide ( 에 어 닐 링에 의해 제공 될 수 있는 더 긴 RNA 기판의 예입니다 트랜스 구성). pcB/22mer 5' 끝에 두 그룹을 포함 하 고 이루어져 있다 22 2' O-메 틸-수정 뉴클레오티드 (그림 3A). pcB/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A)의 3' 끝에 19 뉴클레오티드 dH3 Ext pre-mRNA의 마지막 19 뉴클레오티드에 무료입니다. 오래 되 고 게다가이 사전 mRNA 로부터 합성 pcB-dH3/5 m을 크게 다 하지 않습니다, 두 처리 신호를 키 같은 포함: 줄기 루프와 U7 바인딩 사이트.
pcB-SL RNA S100 추출 마우스 myeloma 세포19 와 효과에서 얻은 세포질 분수의 ultracentrifugation (100000 x g h 1에 대 한)에 의해 준비의 1 mL와 함께 알을 품는 그리고 UV 차입의 효율성은 얼룩에 의해 먼저 분석 했다. 단백질의 수는 UV-차입 (그림 1B, 레인 1) 전에 streptavidin 구슬에 감지 했다. 장파 자외선으로 조사 발표이 단백질의 일부에 상쾌한 (그림 1B, 차선 3), 구슬 (그림 1B, 2 차선)에 일반적인 배경 떠나, 따라서 UV 차입 단계의 중요성을 강조. 주요 UV eluted 단백질 3' hExo 및 짧은 저하 제품 (DP)의 수와 전체 길이 단백질 (FL)에 의해 표현 되는 SLBP와 SLBP, 질량 분석에 의해 확인 되었다. 작은 양의 다양 한 RNA 의무적인 단백질 (RBPs)로 식별 하는 다른 단백질, 또한 선택적으로 UV 방사선 (그림 1B, 차선 3)에 의해 솔루션을 발표 했다.
pcB-dH3/5 m 사전-mRNA (그림 2) 또는 dH3 Ext pre-mRNA pcB/22mer (그림 3)를 단련 했다 초파리 Kc에서에서 핵 추출의 1 mL와 함께 알을 품을 단지20,21을 처리 하는 형태로 세포. 더 나은 각 히스톤 사전 mRNA에 묶는 단백질의 특이성 평가, 부정적인 컨트롤 추가 두 경쟁사는 핵을 추출 하 여 동시에 준비 되었다: SLBP, sequesters SL RNA와 쌍 기본 짧은 센스 oligonucleotide U7 snRNA 사전 mRNA에 그 사이트와 U7 snRNP의 상호 작용을 방지 하 고.
고정된 pcB-dH3/5 m 사전-mRNA의 UV 차입 단계 귀착되 었 다 (그림 2B, 레인 1), 상쾌한에 단백질의 적은 수의 선택적 릴리스 구슬 (그림 2B에 남아 있는 비 특정 단백질의 강렬한 배경 , 차선 3). 이 단백질에는 A 라고 표시 된-난, U7 snRNP15의 구성 요소로 서 질량 분석에 의해 확인 되었다. 또한 부분적으로 포함 된 샘플 10 kDa에 마이그레이션합니다 SLBP 저하 고만 SDS/polyacrylamide 젤 높은 농도에 표시 될 수 있습니다. 이 단백질은 히스톤 사전-(그림 2B, 레인 2) mRNA를 U7 snRNP의 바인딩 차단 두 처리 경쟁자의 존재 검색 되지 않습니다.
Drosophila U7 snRNP의 구성 하는 동일한 요소 dH3 Ext pre-mRNA 및 pcB/22mer (그림 3B, 레인 1)으로 구성 된 고정된 이중의 자외선 조사에 의해 솔루션을 발표 했다. 이 샘플은 또한 dH3 Ext pre-mRNA와 듀플렉스를 초과에서 사용 하는 pcB/22mer oligonucleotide 작용할 여러 RNA 의무적인 단백질을 포함. 달리는 U7 subunits snRNP, 구슬에 남아 있었다 모든 배경 단백질 뿐만 아니라 이러한 오염 단백질 처리 경쟁자의 존재 유지 (그림 3B, 차선 1, 2, 및 3, 4 차선 비교).
UV-상쾌한 포함 처리 단지의 작은 분수와 부정적인 컨트롤 (2 명의 경쟁자 oligonucleotides 존재 준비 하 고 따라서 처리 단지 부족)에서 UV 상쾌한 같은 일부 직접 수 있습니다. 젤 전기 이동 법15에 의해 eluted 단백질의 이전 별거 없이 질량 분석으로 분석. 이 방법은 그들의 크기 및 풍부에 관계 없이 모든 eluted 단백질 검출에 매우 민감한 고 부정적인 예제와 함께에서 특히 히스톤 사전-mRNA 3' 끝을 연관 단백질의 완전 하 고 편견 목록을 제공 합니다. 처리 반응입니다.
그림 1: 마우스 세포질 단백질의 정화 pcB-SL RNA에 바인딩된. 화학적 합성된 pcB-SL RNA (31-뉴클레오티드)의 (A) A 도표. 5' 끝에 비오 (비오) 뒤에 UV 장파에 민감한 사진 쪼갤 moiety (pc) (366 nm), 2 개의 18 원자 스페이서 및 성숙한 히스톤 mRNAs의 3' 끝에 발견 하는 보존된 줄기 루프 구조를 형성 하는 31 뉴클레오티드. (B) pcB-SL RNA S100 마우스 골 수 종 세포에서 세포질 추출 물과 알을 품는. RNA와 단백질을 바운드 streptavidin 구슬, 광범위 하 게 세척, UV eluted 및 실버 (3 차선) 얼룩에 의해 분석에 순화 되었다. 단백질 UV 차입 전에 streptavidin 구슬에 움직일 그리고 구슬에 후 UV 차입 레인 1과 2에 각각 표시 됩니다. 위치 단백질 크기 마커 (kDa)는 왼쪽에 표시 됩니다.
그림 2: 초파리 처리 복합물의 정화 pcB-dH3/5 m 사전-mRNA에 조립. (A) 의 다이어그램 화학적 합성 초파리-특정 pcB-dH3/5 m 사전 mRNA (63-뉴클레오티드). 5' 끝에 비오 (비오) 뒤에 사진 쪼갤 moiety (pc), 두 명의 18-원자 스페이서 및 두 시퀀스 요소 필수 처리를 포함 하는 63 뉴클레오티드: 줄기 루프 구조와 U7 바인딩 사이트. 두 요소 사이 있는 주요 분열 사이트 5 뉴클레오티드 (교차 라인) 복잡 한 어셈블리 중 U7 snRNP 하 여 분열을 차단 하 오-메 틸 그룹 2'와 함께 수정 됩니다. (B) pcB-dH3/5 m 초파리 핵 추출 처리 단지를 함께 알을 품는. 부정적인 컨트롤에서 핵 추출 히스톤 사전-mRNA에 SLBP와 U7 snRNP의 바인딩 차단 하 두 처리 경쟁사를 포함 합니다. 조립된 단지 streptavidin 구슬에 움직일, 광범위 하 게 세척 되었고 샘플의 장파 자외선 노출에 의해 솔루션을 발표 했다. UV eluted 재료 (UV-sup)와 UV-차입 (UV-구슬)에 따라 구슬의 같은 분수는 얼룩에 의해 분석 되었다. 단백질 크기 마커 (kDa)와 streptavidin (SA)의 위치는 오른쪽에 표시 됩니다.
그림 3: 초파리 처리 복합물의 정화에 조립 dH3 Ext pre-mRNA 트랜스에 사진 쪼갤 그룹에 연결 된. T7 생성 dH3 Ext pre-mRNA 및 다음 순서와 화학적 합성 pcB/22mer oligonucleotide를 어 닐 링에 의해 생성 된 dH3 내선 이중의 (A) A 다이어그램: 5' 비오/pc/18/18/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. oligonucleotide에 비오 (비오) 5' 끝에 배치 되 고 뒤에 사진 쪼갤 (pc) 링커. (위의 순서에 밑줄이) 마지막 19 뉴클레오티드는 3' 확장 dH3 Ext pre-mRNA에 추가 보완. 2' 오-메 틸 수정 (그림에는 표시 되지 않습니다)의 존재는 두 목적: 추출 nucleases에 대 한 oligonucleotide를 안정화 하 고 이중 dH3 Ext pre-mRNA와 형성의 힘을 증가. (B) dH3 이중 Ext는 초파리 핵 Kc와 알을 품는 부재 또는 streptavidin 구슬, 광범위 하 게 세척 하 고 바인딩된 단백질 함께 UV eluted에 움직일 경쟁자를 처리 하는 면 전에 서 추출 합니다. UV eluted 재료 (UV-sup, 레인 1와 2)와 UV-차입 (UV-구슬, 3, 4 차선)에 따라 구슬의 같은 분수는 얼룩에 의해 분석 되었다. (그 경쟁자를 처리 하 여 제거) 처리 단지의 특정 componenst A F 편지에 표시 됩니다. 주요 비 특정 RNA 의무적인 단백질 (그 UV eluted 하지만 두 처리 경쟁사 존재 유지) 별표 표시 됩니다. 위치 단백질 크기 마커 (kDa)는 오른쪽에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기 설명 하는 방법을 간단 하 고 통합 사진 쪼갤 링커 외 이며 UV 차입 단계 biotin와 streptavidin 사이 매우 강한 상호 작용을 활용 하는 일반적으로 사용 되는 방법에서 다 하지 않습니다. UV 차입 단계 일반적으로 고정된 하는 RNA의 75% 이상 방출 매우 효율적 이며 streptavidin 구슬, 구슬에 비 특히 묶는 단백질의 높은 배경 뒤에 떠나는에서 단백질 관련. 제거 함으로써이 배경, UV 차입 단계 실버 얼룩, 질량 분석 및 기능 분석 실험에 의해 너무나 순수한 샘플 직접 분석에 적합을 생성 합니다.
상대적으로 몇 가지 간단한 단계를 포함, 결과로 UV 차입 방법은 매우 재현성, 마우스의 작은 100 µ L에서 실버 얼룩 U7 snRNP의 충분 한 양을 제공 하 고 초파리 핵 추출15. 방법은 다른 실험 전략 이전 RNA/단백질 복합물, RNA 기판 MS2 바인딩 사이트 태그 등 immobilizing MS2 MBP 융합을 통해 amylose 구슬에 관련된 단지를 정화 하는 데 사용 하는 매력적인 대안 단백질입니다. MS2 전략, 상대적으로 풍부한 spliceosomes 및 정식 3' 끝 처리 단지22,23, 분리에 성공 하는 동안 처리 U7 snRNP (ZD, 미 출판을 포함 하는 복합물의 충분 한 양의 얻을 하는 데 실패 결과), 주요 U1 spliceosomal snRNP 보다 동물 세포에 집중 하는 약 100 배 더 적은.
프로토콜의 여러 측면은 다양 한 개별 연구 목표를 달성 하 고 다른 RNA 또는 단백질 복합물으로 최적의 결과를 수정할 필요가 있다. 첫째, 양의 복잡 한 추출에 있는 복잡 한 어셈블리에 사용 RNA 기판의 양에 중요 하다. 단지, U7 snRNP를 포함 하 여 제한에 대 한 너무 많은 기판을 사용 하 여 비 생산적만 배경 자외선-상쾌한에 일반적인 RNA 의무적인 단백질의 증가 이다. 둘째, 그것은 또한 기간과 동시에 잠재적인 베이스 또는 과도 한 RNA 강 직의 분리를 방지 하는 복합물의 활발 한 어셈블리를 촉진 하는 외피의 온도 최적화 하는 것이 중요.
U7 종속 처리 단지와 효소 활동을 수행 하는 유사한 RNA 또는 단백질 복합물에 성사 키는 완벽 하 게 조립 되 고 후 그들은 촉매의 결과로 분열 수 있습니다. 히스톤 사전 mRNAs의 분열 크게 정화 처리 단지의 수확량 감소, 낮은 온도 에서도 빠르게 발생 합니다. 이 원치 않는 효과 방지 하기 위해 주요 분열 사이트 및 pcB-dH3/5 m 사전-mRNA에 4 개의 인근 뉴클레오티드 2' O-메 틸 그룹 (5 m)10화학 합성 하는 동안 수정 되었습니다. 이 사전-mRNA U7 snRNP에 의해 분열에 거의 완전 하 게 강한 이며 감지 복잡 한 혼란을 야기 하지 않고 60 분 동안 실내 온도에 핵 추출와 알을 품을 수 있다. 과 pcB/22mer을 Ext 단련 T7 생성 dH3 부족 이러한 수정 핵 추출 가진 그것의 외피 얼음 5 분 또는 더 짧은 제한 촉매 하에 수행 됩니다. 성숙한 3' 히스톤의 끝을 포함 하는 pcB-SL RNA mRNA 및 세포질 추출 물에 추가 처리를 받아야 되지 않습니다. 3' hExo, 마그네슘-종속 3'-5' exonuclease는는는 단일 좌초 꼬리 vivo에서24,25 생체 외에서 EDTA16의 존재에 의해 그것의 활동을 저해 하지만 2-3 뉴클레오티드를 제거 수 있습니다. 그 결과, pcB-SL RNA 수 있습니다 알을 품을 어떤 부작용 없이 오랜된 시간 동안 실 온에서 세포질 추출 물에 일반적으로 얼음에 짧은 화 SLBP 고 3' hExo와 RNA의 삼항 복잡 한 형성 충분 하지만.
UV-차입 방법의 2 개의 다른 이체의 RNA 기판 biotin와 cis (covalently RNA의 5' 끝에 연결 된) 사진 쪼갤 링커 사용 하 여은 전반적으로 간단 하 고 비교적 순수한 샘플을 생성 합니다. 이 방법의 중요 한 한계는 두 그룹 covalently ~ 65 뉴클레오티드를 초과 하지 않는 RNA 기판에 붙어 있을 수 이다. 더 긴 RNA 바인딩 대상 어댑터 oligonucleotide 통해 트랜스 에서 pcB moiety 첨부 될 수 있습니다. 그러나,이 방법은 바인딩할 어댑터 oligonucleotide의 초과 하는 경향이 일반적인 단백질의 높은 배경을 생산할 수 있습니다. 그것은 그러므로 충분 한 실험에 사용 하는 모든 이전 mRNA 기판 바인딩할 oligonucleotide의만 최소한의 어 금 니 과잉 사용 하는 것이 중요.
어댑터 oligonucleotides의 순서, 길이 및 화학 특성 일반적인 RNA 의무적인 단백질 상호 작용을 그들의 능력을 감소 시키고 있는 동안 RNA 기질에 보완적인 시퀀스 쌍 기지로 그들의 능력을 개선 하는 다양 한 수 있습니다. 마지막으로, 더 이상 이전 mRNA 기판 어댑터 oligonucleotides와 이중 streptavidin 구슬 복잡 한 형성을 위해 사용 되 고 이전에 움직일 수 수 있습니다. 이 사전 선택 방법의 장점 중 하나는 oligonucleotide anneal 못한 샘플 RNA 분자에서 제거입니다. 이러한 분자 정상 수 추출에서 복잡 한 조합 유지 하지만 streptavidin 구슬, 부분적으로 정화의 수확량 감소를 바인딩할 수 없습니다.
정화 단지 단일 가닥 RNA 기판에 조립, 뿐만 아니라 비슷한 방식으로 UV 차입 메서드 정화 단백질 또는 단백질 복합물을 단일 및 이중 가닥 DNA 시퀀스를 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
우리가 우리의 일을 우리의 동료와 공동 작업자 들 감사합니다. 이 연구는 NIH에 의해 지원 되었다 GM 29832 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
