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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

Published: January 3, 2019 doi: 10.3791/58697
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

RNA/Proteinkomplexe gereinigt mit Botin Streptavidin-Strategie sind Lösung unter denaturierenden Bedingungen in einer Form ungeeignet für die weitere Reinigung und Funktionsanalyse eluiert. Hier beschreiben wir eine Änderung dieser Strategie, die einen Foto-spaltbaren Linker in RNA und einem sanften UV-Elution Schritt nachgeben native und voll funktionsfähige RNA/Proteinkomplexe nutzt.

Abstract

Seit vielen Jahren ist die außergewöhnlich starke und rasch gebildete Interaktion zwischen Biotin und Streptavidin erfolgreich für die partielle Reinigung der biologisch wichtigen RNA/Proteinkomplexe verwendet worden. Diese Strategie leidet jedoch einen großen Nachteil, die die breitere Nutzung begrenzt: die Biotin/Streptavidin-Interaktion kann gebrochen werden, nur unter denaturierenden Bedingungen, die die Integrität der eluierten komplexe, so dass auch stören ihre anschließenden Funktionsanalyse und/oder weitere Reinigung durch andere Methoden. Darüber hinaus sind die eluierten Proben häufig mit Hintergrund-Proteine verunreinigt, die nonspecifically mit Streptavidin-Perlen, erschwert die Analyse der gereinigten komplexe durch silberne Färbung und Massenspektrometrie zuordnen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir eine Variante der Biotin/Streptavidin-Strategie in dem Biotin ist eine RNA-Substrat über einen Foto-spaltbaren Linker angebracht und die komplexe an Streptavidin Perlen immobilisiert sind selektiv eluiert Lösung in einer nativen Form durch langwellige UV, so dass die Hintergrund-Proteine auf die Perlen. Kürzere RNA bindenden Substraten können chemisch mit Biotin und der Foto-spaltbaren Linker kovalent an das 5'-Ende der RNA angeschlossen synthetisiert werden, während längeren RNA Substrate mit den beiden Gruppen von komplementären Oligonukleotids bereitgestellt werden können. Diese beiden Varianten der UV-Elution Methode zur Reinigung der U7 SnRNP-abhängige Verarbeitung komplexe, die Histone Pre-mRNAs am 3'-Ende cleave getestet wurden und beide bewiesen, günstig im Vergleich zu anderen zuvor Reinigungsverfahren entwickelt. Die UV-eluiert Proben enthalten leicht nachweisbare Mengen an der U7-SnRNP, die frei von großen Protein Verunreinigungen und geeignet für die direkte Analyse von Massenspektrometrie und funktionelle Assays wurde. Das beschriebene Verfahren kann leicht für die Reinigung der andere RNA-bindende komplexe angepasst und verwendet in Verbindung mit Einzel- und Doppelstrang-DNA-Bindungsstellen zur Reinigung von DNA-spezifische Proteine und makromolekulare komplexe.

Introduction

In den Eukaryotes unterzogen RNA-Polymerase II-generierte mRNA Vorstufen (Pre-mRNAs) mehrere Reifung Ereignissen im Zellkern vor immer voll funktionsfähige mRNA-Vorlagen für die Proteinsynthese im Zytoplasma. Eines dieser Ereignisse ist 3' End-Verarbeitung. Für die überwiegende Mehrheit der Pre-mRNAs umfasst 3' Ende Verarbeitung Spaltung an Polyadenylation gekoppelt. Diese zweistufige Reaktion ist katalysiert durch ein relativ reichlich Komplex bestehend aus mehr als 15 Proteine1. Tier-Replikation-abhängige Histon Pre-mRNAs werden am 3'-Ende durch einen anderen Mechanismus verarbeitet in denen die Schlüsselrolle von U7 SnRNP, eine niedrige Fülle Komplex bestehend aus U7 SnRNA ~ 60 Nukleotide und mehrere Proteine2,3 gespielt wird . Die U7 SnRNA Basenpaare mit einer bestimmten Reihenfolge in Histon Pre-mRNA und eine der Untereinheiten der U7 SnRNP katalysiert die Spaltung Reaktion, Generierung von Reifen Histon mRNA ohne eine poly(A) tail. 3' End-Verarbeitung von Histon Pre-mRNA erfordert auch Stem-Loop Binding Protein (SLBP), die eine erhaltene Stamm-Schleife befindet sich bindet die Spaltstelle stromaufwärts und fördert die Einstellung von der U7 SnRNP Substrat2,3. Studien zur Identifizierung einzelner Komponenten der U7-SnRNP wurden durch die geringe Konzentration von U7-SnRNP in tierischen Zellen und die Tendenz des Komplexes zu distanzieren oder teilweise Proteolyse zu unterziehen, während der Reinigung durch den Einsatz von anspruchsvoll Feinwaschmittel4,5,6, hohe Salz wäscht und/oder mehrere chromatographische Schritte7,8,9.

Vor kurzem, um die Zusammensetzung der U7-abhängige Verarbeitungsmaschinen zu ermitteln, wurde ein kurzes Fragment von Histon Pre-mRNA enthält Biotin auf 3' oder 5' mit einem nuklearen Extrakt inkubiert und die montierten Anlagen wurden gefangen genommen, auf Streptavidin beschichteten Agarose Korne5,6,10. Aufgrund der außergewöhnlich starken Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin Proteine auf Streptavidin Perlen immobilisiert eluiert unter denaturierenden Bedingungen durch Kochen in SDS und durch silberne Färbung und Massenspektrometrie analysiert. Während diesem einfache Ansatz eine Reihe von Komponenten der U7 SnRNP identifiziert, ergab es relativ primitiven Proben, oft mit einer großen Anzahl von Hintergrund-Proteinen nonspecifically verpflichtet Streptavidin Perlen, möglicherweise einige Komponenten der Maskierung kontaminiert die Verarbeitungsmaschinen und verhindern, dass ihre Erkennung auf Silber gefärbt Gele5,6,10. Wichtig ist, diesen Ansatz ausgeschlossen auch funktionellen Studien mit dem isolierten Material und dessen weitere Reinigung zur Homogenität durch zusätzliche Methoden.

Eine Reihe von Änderungen wurden vorgeschlagen, im Laufe der Zeit an die praktisch Unumkehrbarkeit Biotin/Streptavidin-Interaktion, die meisten davon entwerfend, entweder die Interaktion zu schwächen oder zu einem chemisch spaltbaren Abstandhalter Arm in die Biotin-haltigen Reagenzien11,12. Der Nachteil dieser Änderungen war, dass sie deutlich die Effizienz der Methode bzw. oft nicht physiologischen Bedingungen während der Elution Schritt, gefährden die Integrität oder die Aktivität der gereinigten Proteine reduzieren.

Hier beschreiben wir einen anderen Ansatz zur Lösung des inhärenten Problems der Biotin/Streptavidin-Strategie mittels RNA Substrate, in denen Biotin ist kovalent an das 5' Ende über eine Foto-spaltbaren 1-(2-Nitrophenyl) Ethyl-Verbindungsgruppe, die empfindlich gegen UV13,14lange Welle. Wir testeten diese Vorgehensweise für die Reinigung der begrenzende U7-abhängige Verarbeitungsmaschinen von Drosophila und Säugetieren nuklearen extrahiert15. Nach einer kurzen Inkubation von Histon Pre-mRNA enthalten Biotin und der Foto-spaltbaren Linker mit einem nuklearen Extrakt die versammelten Verarbeitung komplexe auf Streptavidin Perlen immobilisiert, gründlich gewaschen und sanft in eine Native Lösung veröffentlicht Form durch die Einwirkung von ~ 360 nm UV-Licht. Die UV-Elution Methode ist sehr effizient, schnell und unkompliziert, mit ausreichenden Mengen an der U7-SnRNP, seine Komponenten durch Splitter von weniger als 100 µL der Extrakt15Färbung zu visualisieren. Das UV-eluiert Material ist frei von Hintergrund-Proteine und für direkte Massenspektrometrie Analyse, zusätzliche Reinigungsschritte und enzymatische Assays geeignet. Die gleiche Methode kann zur Reinigung von anderen RNA/Proteinkomplexe angenommen werden, die relativ kurze RNA-Bindungsstellen erfordern. Biotin und der Foto-spaltbaren Linker können auch kovalent, Einzel - und doppelsträngige DNA, potenziell Verlängerung der UV-Elution Methode zur Reinigung von verschiedenen DNA/Protein-komplexe befestigt werden.

Chemische Synthese von RNA-Substrate mit kovalent angebracht Biotin und der Foto-spaltbaren Linker ist praktisch nur mit den Sequenzen, die nicht mehr als ~ 65 Nukleotide, teuer und ineffizient für deutlich längere Sequenzen. Um dieses Problem zu beheben, entwickelten wir auch einen alternativen Ansatz, der für viel länger RNA-bindende Ziele geeignet ist. Bei diesem Ansatz RNA von beliebiger Länge und Nukleotid-Reihenfolge ist generierten in Vitro durch T7 oder SP6 Transkription und geglüht, eine kurze ergänzende Oligonukleotid enthält Biotin und der Foto-spaltbaren Linker am 5'-Ende (trans (Konfiguration). Resultierende Duplex wird anschließend verwendet, um einzelne bindende Proteine oder makromolekulare komplexe auf Streptavidin-Perlen, die nach dem gleichen Protokoll beschrieben für die RNA-Substrate mit Foto-spaltbaren Biotin kovalent verbunden zu reinigen (GUS Konfiguration). Mit dieser Änderung kann die Foto-spaltbaren Biotin in Verbindung mit in Vitro generierten Protokolle mit Hunderten von Nukleotiden, Erweiterung der UV-Elution Methode zur Reinigung von einer breiten Palette RNS/Protein verwendet werden.

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Protocol

(1) Substrataufbereitung

Hinweis: RNA Substrate kürzer als ~ 65 Nukleotide mit Biotin (B) und der Foto-spaltbaren (pc)-Linker (zusammen bezeichnet als Foto-spaltbaren Biotin oder pcB) kovalent an die RNA 5'-Ende (Cis -Konfiguration) befestigt chemisch synthetisiert werden können. RNA-Substrate, enthält deutlich mehr Bindungsstellen generierten in Vitro durch T7 (oder SP6) Transkription sein müssen und anschließend geglüht, eine kurze ergänzende Adapter Oligonukleotid mit pcB glyko-am 5'-Ende (trans -Konfiguration) (Abbildung 1).

  1. Für Bindungsstellen bestehend aus weniger als 65 ~ Nukleotide, verwenden Sie einen kommerzielle Hersteller (Table of Materials), um chemisch RNS von Interesse zu synthetisieren mit pcB kovalent befestigt an die RNA 5'-Ende (Abbildung 1A und Abbildung 2A). Lösen sich in sterilem Wasser die gewünschte Konzentration zu erreichen und Speicherung in kleinen Aliquote bei-80 ° C.
  2. Für Bindungsstellen erzeugt deutlich mehr als ~ 65 Nukleotide, Form eine teilweise Maisonette einer in-vitro- RNA von Interesse und eine ergänzende Adapter Oligonukleotid mit pcB glyko-am 5'-Ende (Abbildung 3A).
    1. Führen Sie T7 Transkription auf entweder eine linearisierte Plasmid-DNA oder ein entsprechendes Template PCR-RNA mit der Bindungsstelle des Interesses verlängert durch eine willkürliche ~ 20-Nukleotid-Sequenz am 3'-Ende zu erzeugen.
    2. Verwenden Sie einen kommerzielle Hersteller (Table of Materials), um chemisch ein Adapter Oligonukleotid zu synthetisieren, das an die 3'-Erweiterung in der T7 erzeugten RNA komplementär und enthält pcB am 5'-Ende (Abbildung 3A).
      Hinweis: Zwei 18-Atom Abstandhalter und 2-3-ergänzende Nukleotide können am 5'-Ende des Oligonukleotids zur Verringerung möglicher sterische Behinderung zwischen dem gebundenen komplex und Streptavidin Perlen platziert werden. Es ist auch wünschenswert, dass das Oligonukleotid gleichmäßig mit einer 2' O-Methyl Gruppe, zu der Stärke des Duplex zu erhöhen und zur Resistenz gegen verschiedene Nukleasen geändert wird.
    3. Tempern Sie die T7-generierte RNA zu pcB-Adapter Oligonukleotid.
      1. Mix 20 Pmol der RNA und 100 Pmol des Adapter pcB Oligonukleotids (molares Verhältnis 1:5) in einer 1,5 mL tube mit 100 µL Bindung Puffer mit folgender Zusammensetzung: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15 % Glycerin, 10 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA).
        Hinweis: Es ist wichtig, eine minimale Menge des Oligonukleotids Adapter verwenden, die ausreicht, um ein Duplex mit den meisten (wenn nicht sogar alle) Pre-mRNA-Substrat in das Glühen Reaktion verwendet zu bilden. Dies konnte bequem bestimmt werden durch RNA-Substrat am 5'-Ende mit 32P, Glühen die beschriftete Substrat mit steigenden Mengen der Adapter Oligonukleotid mit Kennzeichnung verschiedene Puffer-Bedingungen und die Beibehaltung der Überwachung der radioaktive Signal Streptavidin Perlen nach mehreren Wäschen der Perlen mit der Bindung Puffer.
      2. Platzieren Sie das Rohr in kochendem Wasser für 5 Minuten.
      3. Lassen Sie das Wasser auf Zimmertemperatur abkühlen lassen.

2. komplexe Montage

  1. Ergänzung 1 mL einer Maus nuklearen Extrakt (oder eine andere Wahl-Extrakt) mit 80 mM EDTA pH 8, eine Endkonzentration von 10 mM, unspezifische Metall-abhängige Nukleasen zu blockieren, die in dem Extrakt vorhanden sind.
    Hinweis: Dadurch wird bei der Anpassung der Puffer in der Extrakt für die gleiche Zusammensetzung wie die in der Bindung Puffer (siehe Schritt 1.2.3.1). EDTA hat keinen Einfluss auf in-vitro- Verarbeitung von Histon Pre-mRNAs aber möglicherweise schädlich bei der Reinigung, Proteine oder Proteinkomplexe, die in einem Magnesium-abhängigen Weise montieren. In diesen Fällen sollte EDTA vermieden werden.
  2. Hinzufügen von 5-10 Pmol von der RNA-Substrat mit dem Stichwort pcB glyko-in GUS-Staaten (siehe Schritt 1.1) oder Trans (siehe Schritt 1.2.3.3) zu 1 mL des Extrakts mit 10 mM EDTA.
    Hinweis: Die Menge an RNA muss sorgfältig in einer Versuchsreihe Studie ausgewertet werden. Verwenden zu viel RNA-Substrat für die Reinigung eines begrenzenden komplexes vielleicht kontraproduktiv, den Hintergrund der unspezifischen RNA-bindende Proteine deutlich zu erhöhen, ohne jede Wirkung auf die Ausbeute an spezifische Proteine.
  3. Inkubieren Sie die RNA-Substrat mit dem Extrakt für 5 min auf Eis, gelegentlich mischen der Probenmaterials.
    Hinweis: Sowohl die Zeit und die Temperatur der Inkubation müssen empirisch festgelegt und variieren erheblich, je nach den Besonderheiten der RNS/Protein-Komplex.
  4. Drehen Sie die Inkubation Mischung in einem vorgekühlten Microcentrifuge für 10 min bei 10.000 x g entfernen jede möglichen Ausscheidungen und sorgfältig zu sammeln, den Überstand zu vermeiden Übertragung der Pellets.

(3) Immobilisierung von RNA/Proteinkomplexe an Streptavidin Perlen.

  1. Ein 1,5 mL-Tube übermitteln Sie ~ 100 µL Streptavidin Agarose Bead Aussetzung von einem kommerziellen Anbieter (Table of Materials) und erhöhen Sie die Lautstärke mit dem verbindlichen Puffer (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15 % Glycerin, 10 mM EDTA).
    Hinweis: Dieser Puffer sollte die gleiche Zusammensetzung wie das Glühen Mischung und der Extrakt für komplexe Montage (Schritt 2.1) verwendet haben.
  2. Sammeln Sie die Perlen an der Unterseite des Rohres durch Spinnen für 2-3 min bei 25 X g und aspirieren Sie überstand.
  3. Wiederholen Sie den Vorgang waschen/Spinnerei 2-bis 3-Mal um die Perlen mit dem verbindlichen Puffer equilibrate.
    Hinweis: Am Ende dieses Schrittes das Pellet der Perlen sollte haben ein Volumen von ~ 30 µL.
  4. Laden Sie den Überstand mit der montierten Anlage (Schritt 2.4) über äquilibriert Streptavidin Agarose Korne.
  5. Drehen Sie 1 h bei 4 ° C, RNA und die gebundene komplexe an den Perlen zu immobilisieren.
  6. Sammeln Sie die Perlen an der Unterseite des Rohres durch Spinnen für 2-3 min bei 25 X g.
    Hinweis: Verwenden Sie eine Schaukel, Rotor um zu erheblichen Verlust der Perlen zu vermeiden, wenn sie neigen dazu, an der Seite des Rohres in eckige Rotoren halten.
  7. Aspirieren Sie überstand und spülen Sie die Perlen zweimal mit 1 mL des Puffers Bindung, mit den gleichen Bedingungen der Zentrifugation.
  8. Fügen Sie 1 mL des Puffers Bindung und drehen Sie die Probe 1 h bei 4 ° C.
    Hinweis: Dieser Schritt kann verkürzt werden, wenn die Anlage auf dem Substrat gebildet neigt zu distanzieren.
  9. Spin-down die Perlen für 2 – 3 min. 25 X g, fügen Sie 1 mL des Puffers und die Aussetzung zu einem neuen Schlauch übertragen.
  10. Für weitere 1 h kürzer, wenn die Anlage nicht stabil ist oder zu drehen, spin-down für 2-3 min bei 25 X g und die Perlen auf einem 500 µL Rohr in 200 µL Bindung Puffer übertragen.

4. UV-Elution.

  1. Schalten Sie eine hochintensive UV-Licht emittierende 365 nm UV-Licht für 5-10 min vor vollem Glanz zu erreichen.
    Hinweis: Dies ist wichtig, die maximalen Energie der UV-Emission zu Beginn der Bestrahlung zu erreichen.
  2. Füllen Sie den Boden einer Petrischale (100 x 15 mm) mit dicht gepackten Eis und legen Sie es über die Schüssel Deckel.
  3. Kurz Wirbel das Röhrchen mit der immobilisierten Komplex, platzieren Sie es horizontal auf Eis und Abdeckung mit der vorgewärmten Lampe, um sicherzustellen, dass die Probe im Abstand von 2-3 cm von der Oberfläche des Kolbens befindet.
    Hinweis: Wenn der Abstand zu groß ist, verwenden Sie zusätzliche Petrischalen oder andere geeignete Objekte, die Birne des Beispiels näher bringen.
  4. Bestrahlen Sie für insgesamt 30 min, häufig invertieren und vortexen das Rohr um gleichmäßige UV-Exposition des Fahrwerks sicherzustellen und um eine Überhitzung zu verhindern.
    Hinweis: Um zusätzliche Kühlung zu gewährleisten, kann der UV-Elution Schritt in einem kalten Raum durchgeführt werden. Wechseln Sie in eine Petrischale mit frischem Eis bei übermäßigen Eis schmilzt.
  5. Spin-down die Perlen für 2 – 3 min. 25 X g und den Überstand zu sammeln.
  6. Re-spin des Überstands mit den gleichen Bedingungen und den Überstand zu sammeln.
    Hinweis: Lassen Sie eine kleine Menge Überstand an der Unterseite zu vermeiden Übertragung der restliche Perlen.

5. Probe Analyse durch silberne Färbung gefolgt von Massenspektrometrie.

  1. Verwendung SDS/Polyacrylamid-Gelelektrophorese, einen Bruchteil des Überstands UV eluiert und den gleichen Anteil des Materials auf die Perlen UV Elution nach links zu trennen.
    Hinweis: Die Analyse gehören auch ein Aliquot der Perlen aus der Probe vor UV-Elution zurückgezogen.
  2. Färben Sie das Gel, die getrennten Proteine mit einem handelsüblichen Silber Färbung Kit enthalten.
  3. Bewerten Sie die Effizienz des UV-Elution durch den Vergleich der Intensitäten von Proteinen in der UV-eluiert überstand und die Links auf die Perlen nach UV-Bestrahlung.
  4. Verbrauchsteuern Sie die Protein-Bands von Interesse und bestimmen Sie ihre Identität durch Massenspektrometrie mit Standardprotokollen10,15.

6. globale Analyse der UV-eluiert Probe durch Massenspektrometrie.

  1. Analysieren Sie direkt einen Bruchteil der UV-eluiert Überstand durch Massenspektrometrie das gesamte Proteom des gereinigten Materials unvoreingenommen zu bestimmen.
    Hinweis: Dies kann durch in-Lösung Behandlung der gereinigten Proben mit Trypsin gefolgt von standard-Massenspektrometrie Protokolle zur Ermittlung der Identität der generieren Peptide10,15erfolgen.

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Representative Results

Die UV-Elution Methode wurde getestet mit zwei chemisch synthetisierte RNA-Substraten kovalent befestigt am 5'-Ende der Platine glyko-(Cis -Konfiguration): pcB-SL (Abbildung 1) und pcB-dH3/5 m RNAs (Abbildung 2). 31-Nukleotid-pcB-SL-RNA enthält eine Haarnadelstruktur, gefolgt von einen 5-Nukleotid einzelne gestrandeten Schweif und seiner Sequenz ist identisch mit dem 3' Ende der Reife Histon mRNA (i.e., nach der Spaltung der Histon Pre-mRNA von U7 SnRNP). Diese einzigartige Sequenz ist eine bekannte Bindungsstelle für zwei Proteine in den Säugetieren zytoplasmatischen Bruchteil präsent: SLBP und 3' hExo16,17,18. pcB-dH3 / 5m ist ein 63-Nukleotid-Fragment von Drosophila H3 Histon Pre-mRNA und neben der Stamm-Schleife enthält eine Sequenz, die Drosophila U7 SnRNP (Abbildung 2) bindet.

dH3 Ext (125 Nukleotide) ist ein Beispiel für längere RNA-Substrate, die durch T7 Transkription generiert und mit Biotin und ein Foto-spaltbaren Abstandhalter in Trans durch Tempern, pcB/22mer, ein chemisch synthetisierten Adapter Oligonukleotid ( zur Verfügung gestellt werden können Trans Konfiguration). pcB/22mer enthält die beiden Gruppen am 5'-Ende und besteht aus 22 2' O-Methyl-modifizierte Nukleotide (Abb. 3A). 19 Nukleotide am 3' Ende der Platine/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) sind komplementär zu den letzten 19 Nukleotiden der dH3 Ext Pre-mRNA. Diese Pre-mRNA, abgesehen davon, dass längere unterscheidet sich nicht wesentlich von den synthetischen pcB-dH3 / 5m, mit gleich zwei wichtige Verarbeitung Signale: Stem-Loop und U7-Bindungsstelle.

pcB-SL RNA wurde inkubiert mit 1 mL S100 Extrakt vorbereitet durch Ultrazentrifugation (100.000 x g 1 h) von Sekundenbruchteilen zytoplasmatischen gewonnenen Maus-Myelom-Zellen-19 und die Wirkung und Effizienz der UV-Elution analysiert wurden zuerst durch silberne Färbung. Eine Reihe von Proteinen wurden auf Streptavidin Perlen vor UV-Elution (Abbildung 1 b, Spur 1) entdeckt. Bestrahlung mit langwelligen UV veröffentlicht nur einige dieser Proteine der Überstand (Abbildung 1 b, Bahn 3) überlässt einen unspezifischen Hintergrund an den Perlen (Abbildung 1 b, Spur 2), daher betonend, wie wichtig der UV-Elution Schritt. Großen UV-eluiert Proteine wurden durch Massenspektrometrie als 3' hochbrisante und SLBP mit SLBP von voller Länge Protein (FL) und eine Reihe von kürzeren Abbauprodukte (DP) vertreten. Kleinere Mengen anderer Proteine, als verschiedene RNA-bindende Proteine (RBPs), wurden auch selektiv zur Lösung von UV-Bestrahlung (Abbildung 1 b, Bahn 3) veröffentlicht.

pcB-dH3 / 5m Pre-mRNA (Abbildung 2) oder dH3 Ext Pre-mRNA geglüht, pcB/22mer (Abbildung 3) wurden mit 1 mL einer nuklearen Auszug aus Drosophila Kc inkubiert Zellen zur Formularverarbeitung komplexe20,21. Um besser bewerten die Spezifität der Proteine, die an jedem Histon Pre-mRNA binden, war eine Negativkontrolle parallel vorbereitet, indem man zwei Konkurrenten, die Kernenergie zu extrahieren: SL-RNA, die SLBP Sequester und eine kurze antisense-Oligonukleotid, die Paare mit stützen die U7-SnRNA und verhindert, dass das Zusammenspiel von U7-SnRNP mit seinem Standort auf die Pre-mRNA.

Der UV-Elution Schritt der immobilisierten pcB-dH3 / 5m Pre-mRNA führte eine selektive Freigabe nur einer kleinen Anzahl von Proteinen zu den überstand (Abbildung 2 b, Spur 1), mit einem intensiven Hintergrund der unspezifischen Proteine noch auf die Perlen (Abbildung 2 b , Bahn 3). Diese Proteine mit der Bezeichnung A-Ich habe, durch Massenspektrometrie als Komponenten der U7 SnRNP15identifiziert wurden. Die Probe enthielt auch teilweise abgebaut SLBP, die bei 10 kDa migriert und kann nur auf höhere Konzentration, die, den SDS/Polyacrylamid-Gele, sichtbar sein. Diese Proteine wurden nicht in Anwesenheit der beiden Verarbeitung Konkurrenten erkannt, die Bindung der U7 SnRNP, Histon Pre-mRNA (Abbildung 2 b, Spur 2) blockieren.

Die gleichen Komponenten von Drosophila U7 SnRNP wurden zur Lösung von UV-Bestrahlung von einem immobilisierten Duplex bestehend aus dH3 Ext Pre-mRNA und pcB/22mer (Abb. 3 b, Spur 1) veröffentlicht. In diesem Beispiel enthalten zusätzlich mehrere RNA-bindende Proteine, die mit der Platine/22mer Oligonukleotid im Überschuss eingesetzt, um ein Duplex mit dH3 Ext Pre-mRNA bilden interagiert. Im Gegensatz zu den Untereinheiten der U7 SnRNP, diese kontaminierende Proteine sowie alle Hintergrund-Proteine, die an den Perlen blieb im Beisein der Verarbeitung Konkurrenten beibehalten (Abbildung 3 b, vergleichen Sie die Bahnen 1 und 2 und Bahnen 3 und 4).

Ein kleiner Bruchteil der UV-überstand enthaltenden Verarbeitung komplexe und den gleichen Anteil des UV-Überstands von eine Negativkontrolle (in Anwesenheit der beiden Konkurrenten Oligonukleotide vorbereitet und daher fehlt Verarbeitung komplexe) können direkt sein durch Massenspektrometrie ohne eine vorherige Trennung der eluierten Proteine analysiert durch Gel-Elektrophorese15. Diese Methode ist sehr empfindlich bei der Aufdeckung von allen eluierten Proteine unabhängig von ihrer Größe und Fülle und in Verbindung mit dem negativen Beispiel enthält eine vollständige und objektive Liste der Proteine, die spezifisch Histon Pre-mRNA, 3' Ende durchzuführen zuordnen Verarbeitung von Reaktion.

Figure 1
Abbildung 1: Reinigung der Maus zytoplasmatischen Proteine an pcB-SL RNA gebunden. (A) A Diagramm von chemisch synthetisierten pcB-SL RNA (31-Nukleotide). Biotin (Biot) am 5'-Ende ist gefolgt von einer Foto-spaltbaren glyko-(pc) empfindlich auf UV lange Welle (366 nm), zwei 18 Atom Abstandhalter und 31 Nukleotide, die die erhaltenen Haarnadelstruktur am 3' Ende der Reife Histon mRNAs zu bilden. (B) pcB-SL RNA wurde mit S100 zytoplasmatischen Auszug aus Maus-Myelom-Zellen inkubiert. Die RNA und gebundene Proteine wurden auf Streptavidin Perlen, ausgiebig gewaschen, UV eluiert und analysiert von Silber-Färbung (Bahn 3) gereinigt. Proteine an Streptavidin Perlen vor UV Elution immobilisiert und links auf die Perlen nach UV Elution in Bahnen 1 und 2, bzw. angezeigt. Position des Proteins Größe Marker (in kDa) ist auf der linken Seite angezeigt.

Figure 2
Abbildung 2: Reinigung von Drosophila Verarbeitung komplexe montiert auf pcB-dH3/5 m Pre-mRNA. (A) ein Diagramm der chemisch synthetisiert Drosophila-spezifische pcB-dH3/5 m Pre-mRNA (63-Nukleotide). Biotin (Biot) am 5'-Ende ist gefolgt von einer Foto-spaltbaren glyko-(pc), zwei 18-Atom Abstandshalter und 63 Nukleotide, die die beiden Sequenz Elemente wesentlich Verarbeitung enthalten: Haarnadelstruktur und U7-Bindungsstelle. Fünf Nukleotide rund um den großen Spaltstelle befindet sich zwischen den beiden Elementen werden mit einer 2' O-Methyl-Gruppe um die Spaltung durch die U7-SnRNP bei der komplexen Montage zu blockieren (Linien gekreuzt) geändert. (B) pcB-dH3/5 m wurde mit einem Drosophila nuklearen Extrakt Verarbeitung komplexe Montage inkubiert. In der negativen Kontrolle enthält der nuklearen Extrakt zwei Verarbeitung Konkurrenten um die Bindung von SLBP und U7 SnRNP, Histon Pre-mRNA blockieren. Die montierten Anlagen wurden auf Streptavidin Perlen immobilisiert, ausgiebig gewaschen und veröffentlicht Lösung durch die Belastung der Probe durch langwellige UV. Die gleichen Bruchteile von UV-eluiert Material (UV-SUP) und die Perlen nach UV-Elution (UV-Perlen) wurden durch silberne Färbung analysiert. Position des Proteins Größe Marker (in kDa) und Streptavidin (SA) ist auf der rechten Seite angezeigt.

Figure 3
Abbildung 3: Reinigung von Drosophila Verarbeitung komplexe montiert auf dH3 Ext Pre-mRNA zur Foto-spaltbaren Gruppe in Transbefestigt. (A) A Diagramm des dH3 Ext Duplex durch Tempern T7-generierte dH3 Ext Pre-mRNA und chemisch synthetisierten pcB/22mer Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz generiert: 5' Biot/pc/18/18/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. In der Oligonukleotid Biotin (Biot) befindet sich am 5'-Ende und ist gefolgt von der Foto-spaltbaren (pc)-Linker. Die letzten 19 Nukleotide (unterstrichen in der Sequenz oben) sind komplementär zu den 3' Erweiterung hinzugefügt, um die dH3 Ext Pre-mRNA. Das Vorhandensein von 2' O-Methyl-Modifikationen (nicht in der Abbildung angegeben) dient zwei Zwecken: es stabilisiert den Oligonukleotid gegen Extrakt Nukleasen und erhöht die Festigkeit des Duplex mit dH3 Ext Pre-mRNA gebildet. (B) dH3 Ext duplex mit einem Drosophila Kc nuklearen inkubiert wurde extrahieren in Abwesenheit oder im Beisein von Verarbeitung von Konkurrenten, immobilisiert auf Streptavidin Perlen, ausgiebig gewaschen und zusammen mit den gebundenen Proteine UV eluiert. Die gleichen Bruchteile von UV-eluiert Material (UV-SUP, Bahnen 1 und 2) und die Perlen nach UV-Elution (UV-Perlen, die Bahnen 3 und 4) wurden durch silberne Färbung analysiert. Spezifische Componenst der Verarbeitung komplexe (diejenigen, die durch die Verarbeitung von Wettbewerbern eliminiert werden) werden mit A bis F Buchstaben angegeben. Wichtige unspezifische RNA Bindeproteine (diejenigen, die UV-eluiert, sondern bestehen in Anwesenheit der beiden Verarbeitung Konkurrenten) sind mit Sternchen gekennzeichnet. Position des Proteins Größe Marker (in kDa) ist auf der rechten Seite angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die hier beschriebene Methode ist unkompliziert und neben der Einbeziehung eines Foto-spaltbaren Linkers und der UV-Elution Schritt unterscheidet sich nicht von den gängigen Methoden, die die extrem starke Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin nutzen. Der UV-Elution Schritt ist sehr effizient, in der Regel die Freigabe mehr als 75 % der immobilisierten RNA und Proteine aus Streptavidin Perlen, hinterlässt einen hohen Hintergrund von Proteinen, die unspezifisch an die Perlen zu binden verbunden. Durch den Wegfall dieser Hintergrund, ergibt der UV-Elution Schritt bemerkenswert reine Proben geeignet für die direkte Analyse von Silber Färbung, Massenspektrometrie und funktionelle Assays.

Durch Einbindung von relativ wenigen und einfachen Schritten, die UV-Elution Methode ist hoch reproduzierbare, vorsieht, dass ausreichende Mengen an der U7-SnRNP silberne Färbung von weniger als 100 µL der Maus und Drosophila nuklearen extrahiert15. Die Methode ist eine attraktive Alternative zu anderen experimentellen Strategien früher RNA/Protein-komplexe, einschließlich tagging RNA Substrate mit einer MS2-Bindungsstelle und Immobilisierung verknüpft komplexe an Amylose Perlen über eine MS2-MBP-Fusion zu reinigen Protein. Die MS2-Strategie, während erfolgreich bei der Isolierung relativ reichlich Spliceosomes und kanonische 3' End-Verarbeitung komplexe22,23, nicht ausreichende Mengen an komplexe mit U7 SnRNP (ZD, unveröffentlichte Verarbeitung ergeben Ergebnisse), die etwa 100 mal weniger konzentriert sich in tierischen Zellen als die großen U1 Spliceosomal SnRNP.

Viele Aspekte des Protokolls müssen geändert werden, um verschiedene Einzelforschung Ziele zu erreichen und zu optimalen Ergebnissen mit anderen RNA/Protein-komplexe. Erstens ist es wichtig, entsprechend der Menge an RNA-Substrat verwendet für die aufwendige Montage mit der Menge des Komplexes, die im Extrakt vorhanden ist. Für die Begrenzung der komplexe, einschließlich U7 SnRNP, ist es kontraproduktiv, erhöht nur den Hintergrund der unspezifischen RNA-bindende Proteine im UV-überstand, mit zuviel Substrat. Zweitens ist es auch wichtig, die Länge und die Temperatur der Inkubation, kräftige Montage des Komplexes, verhindert gleichzeitig die Dissoziation aufgrund möglicher Proteolyse oder übermäßige RNA-Abbau zu fördern zu optimieren.

Eine Schwierigkeit im Umgang mit der U7-abhängige Verarbeitung komplexe und ähnliche RNA/Protein-komplexe, die enzymatische Aktivitäten tragen ist, dass nach wird komplett montiert sie durch Katalyse distanzieren können. Spaltung von Histon Pre-mRNAs tritt schnell auch bei niedrigen Temperaturen erheblich reduzieren den Ertrag der gereinigten Verarbeitung komplexe. Um diesen unerwünschten Effekt zu vermeiden, wurden die wichtigsten Spaltstelle und vier nahe gelegenen Nukleotide in pcB-dH3/5 m Pre-mRNA während der chemischen Synthese mit 2' O-Methyl Gruppen (5 m)10geändert. Diese Pre-mRNA ist fast völlig resistent gegen die Spaltung von U7 SnRNP und kann ohne erkennbare komplexe Störungen mit einem nuklearen Extrakt bei Raumtemperatur für 60 min inkubiert werden. Die T7-generierte dH3,, Ext, pcB/22mer geglüht, fehlt diese Änderungen und die Inkubation mit einem nuklearen Extrakt erfolgt auf Eis für 5 Minuten oder kürzer, Katalyse zu begrenzen. pcB-SL RNA enthält Reife 3' Ende Histon mRNA und zytoplasmatischen auszugsweise nicht unterziehen jede Zusatz-Verarbeitung. 3' hExo, die Magnesium-abhängige 3' - 5' Exonuclease ist ist in der Lage, Entfernung ca. 2-3 Nukleotide der einzelnen gestrandeten Schweif in Vivo24,25 aber in Vitro , die ihre Tätigkeit durch die Anwesenheit von EDTA16gehemmt wird. Infolgedessen kann pcB-SL RNA zytoplasmatischen auszugsweise bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum ohne Nebenwirkungen, inkubiert werden, obwohl in der Regel eine kurze Inkubation auf Eis zu einem ternären Komplex der RNA mit SLBP und 3' hExo ausreicht.

Der beiden alternativen Varianten der Methode UV-Elution mit RNA Substrate mit Biotin und der Foto-spaltbaren Linker in Cis (kovalent verbunden mit 5'-Ende der RNA) ist insgesamt einfacher und relativ reine Proben ergibt. Eine wichtige Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass die beiden Gruppen kovalent an RNA Substrate nicht mehr als ~ 65 Nukleotide angehängt werden können. Längere RNA verbindliche Ziele können pcB glyko-in Trans über einen Adapter Oligonukleotid beizufügen. Dieser Ansatz kann jedoch höher Hintergrund von unspezifischen Proteinen produzieren, die neigen dazu, überschüssige des Oligonukleotids Adapter binden. Es ist daher wichtig, nur eine minimale Molaren Überschuss des Oligonukleotids ausreichen, um das Pre-mRNA Substrat verwendet im Experiment zu binden zu verwenden.

Die Sequenz, Länge und chemische Natur der Adapter Oligonukleotide kann variiert werden, um ihre Fähigkeit, paar mit den komplementären Sequenzen in der RNA-Substraten zu stützen, und gleichzeitig ihre Fähigkeit zur Interaktion mit nicht-spezifische RNA-bindende Proteine zu verbessern. Zu guter Letzt können länger Pre-mRNA-Substrate mit Adapter Oligonukleotiden Duplexverfahren auf Streptavidin Perlen vor zur Komplexbildung verwendeten immobilisiert werden. Ein Vorteil dieser Vorauswahl-Ansatzes ist, dass es aus der Probe RNA-Moleküle, die nicht zu den Oligonukleotid Tempern beseitigt. Diese Moleküle behalten eine normale Fähigkeit, in einem Komplex in dem Extrakt montieren aber sind nicht in der Lage, Streptavidin Perlen, teilweise reduziert den Ertrag der Läuterung zu binden.

Zusätzlich zu reinigende komplexe auf einsträngige RNA Substrate montiert, kann UV-Elution Methode in einer ähnlichen Weise zu reinigen Proteine oder Proteinkomplexe, die Einzel- und Doppelstrang-DNA-Sequenzen binden verwendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben

Acknowledgments

Wir danken unseren Kollegen und Mitarbeitern für ihren Beitrag zu unserer Arbeit. Diese Studie wurde unterstützt durch das NIH GM 29832 zu gewähren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin-Agarose Sigma S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp Cole-Parmer UX-97600-00
Replacement bulb Cole-Parmer UX-97600-19 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) Promega P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) Promega P1280
Pierce Silver Stain Kit ThermoFisher Scientific 24612

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References

  1. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
  3. Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
  4. Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
  5. Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
  6. Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
  7. Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
  8. Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
  9. Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
  10. Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
  11. Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
  12. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  13. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
  14. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
  15. Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
  16. Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
  17. Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
  18. Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
  19. Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
  20. Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
  21. Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
  22. Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
  23. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
  24. Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
  25. Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).

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Biochemie Ausgabe 143 Affinitätsreinigung RNA/Proteinkomplexe Biotin Streptavidin Foto-spaltbaren Linker UV-Elution U7 SnRNP 3' Ende Verarbeitung
Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt
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