Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Seule étape Purification des Complexes macromoléculaires utilisant l’ARN attaché à la biotine et un éditeur de liens Photo-clivables

Published: January 3, 2019 doi: 10.3791/58697
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Les complexes ARN/protéines purifiées à l’aide de la stratégie de streptavidine-botin sont éluées à solution dans des conditions dénaturation sous une forme impropre pour davantage de purification et d’analyse fonctionnelle. Nous décrivons ici une modification de cette stratégie qui utilise un linker photo-clivables en ARN et une étape d’élution UV douce, ce qui donne des complexes ARN/protéines natives et pleinement fonctionnels.

Abstract

Pendant de nombreuses années, l’interaction exceptionnellement forte et rapidement formée entre la biotine et la streptavidine a été utilisée avec succès pour la purification partielle de biologiquement importants complexes ARN/protéines. Cependant, cette stratégie souffre d’un inconvénient majeur qui limite son utilisation plus large : l’interaction de la streptavidine/biotine peut être cassée seulement dans des conditions qui perturbent également l’intégrité des complexes éluées, excluant par conséquent dénaturantes leur analyse fonctionnelle et/ou encore de purification par d’autres méthodes. En outre, les échantillons éluées sont fréquemment contaminés avec les protéines de fond qui associent non spécifique avec des perles de streptavidine, ce qui complique l’analyse des complexes purifiées par coloration à l’argent et la spectrométrie de masse. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé une variante de la stratégie de streptavidine/biotine dans lequel biotine est attaché à un substrat ARN via un linker photo-clivables et les complexes immobilisés sur des billes de streptavidine sont élués sélectivement à la solution dans un forme native de grande longueur d’onde UV, laissant les protéines de fond sur les perles. Substrats de liaison RNA plus courtes peuvent être synthétisés chimiquement avec la biotine et l’éditeur de liens photo-clivables covalente à l’extrémité 5' de l’ARN, tandis que des substrats de RNA plus longues peuvent être fournis avec les deux groupes par un oligonucléotide complémentaire. Ces deux variantes de la méthode d’élution UV ont été testés pour la purification des U7 snRNP-dépendant de traitement complexes qui coupent les histones pré-ARNm à l’extrémité 3' et ils ont tous deux prouvèrent pour comparer favorablement aux autres précédemment développé des méthodes de purification. Les échantillons UV-élué contiennent facilement détectable de la snRNP U7 qui était exempt de contaminants de la protéine majeure et adapté à l’analyse directe par spectrométrie de masse et de tests fonctionnels. La méthode décrite peut être facilement adaptée pour la purification des autres complexes de liaison ARN et utilisée en conjonction avec des sites de liaison simple et double-brin de l’ADN pour purifier les protéines ADN spécifiques et complexes macromoléculaires.

Introduction

Chez les eucaryotes, les précurseurs de l’ARN polymérase II généré ARNm (pré-ARNm) subissent plusieurs événements de maturation dans le noyau avant de devenir des modèles de mRNA entièrement fonctionnel pour la synthèse des protéines dans le cytoplasme. Un de ces événements est 3' fin au traitement. Pour la grande majorité des pré-ARNm, 3' fin traitement implique de clivage couplé à la polyadénylation. Cette réaction en deux étapes est catalysée par un complexe relativement abondant composée de plus de 15 protéines1. Animaux dépendante de réplication histone pré-ARNm est traitées à l’extrémité 3' par un mécanisme différent, dont le rôle est joué par U7 snRNP, une faible abondance complexe consistant en U7 snRNA de ~ 60 nucléotides et plusieurs protéines2,3 . Les paires de bases U7 snRNA avec une séquence spécifique en histone pré-ARNm et l’une des sous-unités de la snRNP U7 catalyse la réaction de clivage, générant des histones mature ARNm sans un poly (a) la queue. fin traitement de 3' de l’ARN pré-messager histone exige également la tige-boucle Binding Protein (PBEL), qui lie une tige-boucle conservée située en amont du site de clivage et améliore le recrutement de la snRNP U7 au substrat2,3. Des études visant à identifier les différents composants de la snRNP U7 ont été difficiles en raison de la faible concentration de la snRNP U7 dans les cellules animales et la tendance du complexe à dissocier ou subir une protéolyse partielle durant la purification suite à l’utilisation détergents doux4,5,6, lavages de sels élevées et/ou plusieurs étapes chromatographiques7,8,9.

Récemment, afin de déterminer la composition de la machinerie U7-dépendant de traitement, un court fragment de biotine contenant de histone pré-ARNm à 3' ou 5' est incubé avec un extrait nucléaire et l’assemblé complexes ont été capturés sur la streptavidine d’agarose perles5,6,10. Due à l’interaction exceptionnellement forte entre la biotine et la streptavidine, protéines immobilisées sur des billes de streptavidine ont été élués dans des conditions dénaturantes par ébullition en SDS et analysées par coloration à l’argent et la spectrométrie de masse. Bien que cette approche simple a identifié un certain nombre de composants de la snRNP U7, il a donné des échantillons relativement grossières, souvent contaminées par un grand nombre de protéines de fond non spécifique lié à la streptavidine perles, potentiellement masquant certaines composantes du les machines de traitement et d’empêcher leur détection sur argent souillé gels5,6,10. Ce qui est important, cette approche empêche également toute étude fonctionnelle avec le matériel isolé et sa purification plus poussée à l’homogénéité des méthodes supplémentaires.

Un certain nombre de modifications ont été proposé au fil du temps d’aborder le caractère pratiquement irréversible de l’interaction de la streptavidine/biotine, avec la plupart d'entre eux étant conçu soit affaiblir l’interaction ou fournir un bras chimiquement clivables entretoise dans la biotine-contenant les réactifs11,12. L’inconvénient de ces modifications était qu’ils réduisent significativement l’efficacité de la méthode et/ou des conditions non physiologiques souvent requises lors de l’étape d’élution, compromettre l’intégrité ou l’activité des protéines purifiées.

Nous décrivons ici une approche différente pour résoudre le problème inhérent de la stratégie de streptavidine/biotine en utilisant RNA substrats dans lequel biotine est covalente à la 5' mettre fin via une photo-clivables 1-(2-nitrophényl) portion d’éthyle qui est sensible à la longue vague UV13,14. Nous avons testé cette approche pour la purification de la machinerie de traitement limitante U7 dépendant de drosophile et mammifères nucléaire extrait15. Après une courte incubation de biotine contenant de l’ARN pré-messager histone et l’éditeur de liens clivables-photo avec un extrait nucléaire, les complexes de traitement assemblé sont immobilisés sur des billes de streptavidine, lavés et doucement libérés dans la solution en natif se forment par exposition à une lumière ~ 360 nm UV. La méthode UV-élution est très efficace, rapide et simple, ce qui donne une quantité suffisante de la snRNP U7 pour visualiser ses composantes par sliver coloration d’aussi peu que 100 µL de l' extrait15. Le matériel UV-élué est exempt de protéines de fond et approprié pour l’analyse directe par spectrométrie de masse, des étapes de purification supplémentaire et des essais enzymatiques. La même méthode peut être adoptée pour la purification des autres complexes ARN/protéines qui nécessitent des sites de fixation de RNA relativement courtes. Biotine et l’éditeur de liens clivables-photo peuvent également être par covalence fixés à single - et ADN bicaténaire, potentiellement étendre la méthode d’élution UV pour la purification de divers complexes ADN/protéine.

Synthèse chimique des substrats de RNA contenant par covalence attaché biotine et l’éditeur de liens photo-clivables pratique qu’avec les séquences qui ne dépassent pas 65 ~ nucléotides, plus coûteuse et inefficace pour les séquences significativement plus longues. Pour résoudre ce problème, nous avons développé également une autre approche qui convient à des objectifs contraignants RNA beaucoup plus longues. Dans cette approche, l’ARN de n’importe quelle séquence de longueur et de nucléotide est généré en vitro par transcription T7 ou SP6 et recuite à un court oligonucléotide complémentaire qui contient de la biotine et l’éditeur de liens photo-clivables à l’extrémité 5' (trans configuration). Le duplex qui en résulte est ensuite utilisé pour purifier les protéines de liaison individuelle ou complexes macromoléculaires streptavidine perles suivant le même protocole décrit pour les substrats de RNA contenant photo-clivables biotine attaché de façon covalente (CEI configuration). Avec cette modification, la biotine photo-clivables peut être utilisée en conjonction avec in vitro généré transcriptions, contenant des centaines de nucléotides, d’étendre la méthode d’élution UV pour la purification d’une large gamme d’ARN/protéines.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. préparation du substrat

NOTE : Substrats RNA inférieurs à 65 ~ nucléotides peuvent être synthétisés chimiquement avec la biotine (B) et le linker de photo-clivables (pc) (ensemble dénommé photo-clivables biotine ou pcB) par covalence attaché à l’extrémité 5' RNA (configurationcis ). RNA substrats contenant des sites de liaison significativement plus longues doivent être générés in vitro de transcription T7 (ou SP6) et ensuite recuit à un oligonucléotide courte adaptateur complémentaires contenant pcB à l’extrémité 5' (trans configuration) (Figure 1).

  1. Pour les sites de liaison composé de moins de 65 ~ nucléotides, utilisez un fabricant commercial (Table des matières) pour synthétiser chimiquement l’ARN d’intérêt avec pcB par covalence attaché à l’extrémité 5' RNA (Figure 1 et Figure 2 a). Dissoudre dans de l’eau stérile pour obtenir la concentration désirée et stocker dans de petites parties aliquotes à-80 ° C.
  2. Accepteurs significativement plus longtemps que les nucléotides ~ 65, forme un duplex partiel d’un in vitro générée, l’ARN d’intérêt et un oligonucléotide adaptateur complémentaires contenant des pcB à l’extrémité 5' (Figure 3 a).
    1. Effectuer T7 transcription sur un Plasmide linéarisé ou un modèle approprié de la PCR pour générer des RNA avec le site de liaison d’intérêt prolongé à l’extrémité 3' par une séquence arbitraire de ~ 20 nucléotides.
    2. Utilisez un fabricant commercial (Table des matières) pour synthétiser chimiquement un oligonucléotide adaptateur est complémentaire à l’extension de 3' dans l’ARN généré T7 et contenant des pcB à l’extrémité 5' (Figure 3 a).
      Remarque : Deux entretoises 18-atom et 2-3 nucléotides non-complémentaire peuvent être placés à l’extrémité 5' de l’oligonucléotide pour réduire le potentiel stérique entre le complexe lié et la streptavidine perles. Il est également souhaitable que l’oligonucléotide est uniformément modifié avec un groupe 2' O-méthyl pour augmenter la force du duplex et pour fournir la résistance contre différentes nucléases.
    3. Recuire l’ARN T7 généré pour l’oligonucléotide adaptateur de pcB.
      1. Mélanger 20 pmol d’ARN et 100 pmol de l’oligonucléotide de BPC d’adaptateur (rapport molaire de 1:5) dans un 1,5 mL tube contenant 100 µL de tampon de liaison avec la composition suivante : 75 mM KCl, 15 millimètres HEPES pH 7,9, 15 % de glycérol, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 10 mM.
        Remarque : Il est important d’utiliser une quantité minimale de l’oligonucléotide adaptateur qui est suffisant pour former un duplex avec la plupart (sinon tous) substrat de pré-ARNm, utilisé dans la réaction de recuit. Cela peut être commodément déterminée par étiquetage substrat de l’ARN à l’extrémité 5' avec 32P, recuit le substrat marqué avec quantités croissantes de l’oligonucléotide adaptateur utiliser divers tampons conditions et surveillance de la conservation de la signal radioactif sur des billes de streptavidine après plusieurs lavages des perles avec le tampon de liaison.
      2. Placer le tube dans l’eau bouillante pendant 5 min.
      3. Laisser l’eau refroidir à température ambiante.

2. complexes d’assemblage

  1. Supplément 1 mL d’un extrait nucléaire de souris (ou un autre extrait de choix) avec 80 mM EDTA pH 8 à une concentration finale de 10 mM pour bloquer les nucléases de métal-dépendante non spécifiques qui sont présents dans l’extrait.
    Remarque : Cela se traduira en ajustant le tampon non contrôlé dans l’extrait de la même composition que celle dans le tampon de liaison (voir étape 1.2.3.1). EDTA n’affecte pas en vitro traitement des histones pré-ARNm, mais peut être nocif dans la purification de protéines ou complexes de protéines qui se réunissent dans une manière dépendante du magnésium. Dans ces cas, EDTA devrait être évitée.
  2. Ajouter 5-10 pmol du substrat RNA estampillé de la portion de pcB en cis (voir étape 1.1) ou trans (voir étape 1.2.3.3) à 1 mL de l’extrait contenant 10 mM EDTA.
    Remarque : La quantité de l’ARN doit être soigneusement évaluée dans une série d’expériences du procès. À l’aide de substrat de trop d’ARN pour la purification d’un complexe limitant peut-être contre-productif, augmentant considérablement le fond des protéines de liaison ARN non spécifiques sans aucun effet sur le rendement des protéines spécifiques.
  3. Incuber le substrat de l’ARN avec l’extrait pendant 5 min sur la glace, occasionnellement mélanger l’échantillon.
    Remarque : Les deux le temps et la température de l’incubation doivent être établies de façon empirique et peuvent varier considérablement, selon la nature spécifique du complexe ARN/protéines.
  4. Tourner le mélange d’incubation dans une micro-centrifugeuse refroidi pendant 10 min à 10 000 g pour enlever n’importe quel potentielles précipités et recueillir délicatement le surnageant évitant transférant le culot.

3. immobilisation des Complexes ARN/protéines sur des billes de streptavidine.

  1. Transférer des ~ 100 µL de suspension de perle d’agarose streptavidine auprès d’un fournisseur commercial (Table des matières) dans un tube de 1,5 mL et augmenter le volume avec le tampon de liaison (75 mM KCl, 15 millimètres HEPES pH 7,9, 15 % de glycérol, 10 mM EDTA).
    NOTE : Cette mémoire tampon doit avoir la même composition que celle du mélange de recuit et de l’extrait utilisé pour l’assemblage complexe (point 2.1).
  2. Collecter les perles au fond du tube en filature pendant 2-3 min à 25 x g et aspirer le surnageant.
  3. Répétez la même procédure de lavage/essorage 2 ou 3 fois pour équilibrer les perles avec le tampon de liaison.
    Remarque : À la fin de cette étape, le culot des perles doit avoir un volume de ~ 30 µL.
  4. Charger le surnageant contenant le complexe assemblé (étape 2.4) au cours des streptavidine équilibré d’agarose perles.
  5. Faire tourner 1 h à 4 ° C pour immobiliser les ARN et les complexes liés sur les perles.
  6. Collecter les perles au fond du tube en filature pendant 2-3 min à 25 x g.
    Remarque : Utilisez une balançoire rotor afin d’éviter une perte importante des perles si ils ont tendance à adhérer à la paroi du tube à rotors angulaires.
  7. Aspirer le surnageant et rincer les perles deux fois avec 1 mL de tampon de la liaison, en utilisant les mêmes conditions de centrifugation.
  8. Ajouter 1 mL de tampon de la liaison et faire tourner l’échantillon de 1 h à 4 ° C.
    Remarque : Cette étape peut être raccourcie si complexe formé sur le substrat tend à se dissocier.
  9. Tournez en bas les perles pendant 2-3 min à 25 x g, ajouter 1 mL de tampon et transférer la suspension dans un nouveau tube.
  10. Faites tourner pendant 1 h supplémentaires ou plus courte, si le complexe n’est pas stable, tournez vers le bas pendant 2-3 min à 25 g et transférer les billes dans un tube de 500 µL dans 200 µL de tampon de liaison.

4. UV d’élution.

  1. Allumer une lampe UV émettant une lumière de UV 365 nm pendant 5-10 min avant d’atteindre le plein éclat de haute intensité.
    NOTE : Ceci est essentielle pour obtenir une énergie maximale d’émission UV au début de l’irradiation.
  2. Remplissez le fond d’un plat de pétri (100 x 15 mm) avec de la glace serrée et empiler sur le couvercle de la capsule.
  3. Brièvement vortex le tube contenant le complexe immobilisé, placez-le horizontalement sur la glace et le couvercle avec la lampe préchauffée, veiller à ce que l’échantillon est situé à une distance de 2-3 cm de la surface de l’ampoule.
    Remarque : Si la distance est trop grande, utilisez pétri supplémentaires ou autres objets appropriés pour amener l’échantillon plus près à l’ampoule.
  4. Irradier pendant un total de 30 min, en retournant fréquemment et mélangé au vortex le tube pour assurer une exposition uniforme de la suspension aux ultraviolets et pour éviter la surchauffe.
    NOTE : Afin de fournir un refroidissement supplémentaire, l’étape d’élution UV peut se faire dans une chambre froide. Placez-vous dans une boîte de pétri avec de la glace fraîche en cas de fonte des glaces excessive.
  5. Tournez en bas les perles pendant 2-3 min à 25 x g et recueillir le surnageant.
  6. Re-spin le surnageant à l’aide des mêmes conditions et recueillir le surnageant.
    NOTE : Laisser une petite quantité de liquide surnageant au fond pour éviter de transférer des perles résiduelles.

5. analyse par coloration à l’argent suivi par spectrométrie de masse.

  1. Utilisation SDS/électrophorèse sur gel polyacrylamide pour séparer une fraction du liquide surnageant UV-élution et la même fraction du matériel laissé sur les perles après élution UV.
    Remarque : L’analyse peut également inclure une partie aliquote de perles retirés de l’échantillon avant d’élution UV.
  2. Souillez le gel contenant des protéines séparées en utilisant une coloration kit à l’argent disponible dans le commerce.
  3. Évaluer l’efficacité des UV-élution en comparant les intensités des protéines présentes dans le surnageant UV-élué et ceux laissés sur les perles après irradiation UV.
  4. Exciser les bandes de protéines d’intérêt et de déterminer leur identité par spectrométrie de masse à l’aide de protocoles standard10,15.

6. global analyse d’échantillon UV-éluée par spectrométrie de masse.

  1. Analyser directement une fraction de surnageant UV-éluée par spectrométrie de masse pour déterminer le protéome ensemble des matières purifiées de manière impartiale.
    NOTE : Cela peut être fait par-solution traitement des échantillons purifiés avec de la trypsine suivie de protocoles de spectrométrie de masse standard pour déterminer l’identité des peptides générer10,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La méthode UV-élution a été testée avec deux substrats de RNA synthétisés chimiquement de façon covalente à l’extrémité 5' de la portion de pcB (configurationcis ) : pcB-SL (Figure 1) et pcB-dH3/5 m RNAs (Figure 2). Le 31-nucléotide pcB-SL RNA contient une structure de tige-boucle suivie d’une queue de brin unique 5-nucléotide et sa séquence est identique à l’extrémité 3' de l’histone mature ARNm (i.e., après le clivage de l’ARN pré-messager histone par U7 snRNP). Cette séquence unique est un site de liaison connue pour deux protéines présentes dans la fraction cytoplasmique mammifères : PBEL et 3' hExo16,17,18. pcB-dH3 / 5m est un fragment de 63 nucléotides de drosophile , histone H3 pré-ARNm et en plus de la tige-boucle contient une séquence qui lie Drosophila U7 snRNP (Figure 2).

dH3 Ext (125 nucléotides) est un exemple de substrats de RNA plus longues qui peut être générée par la transcription T7 et fournies avec biotine et une entretoise photo-clivables en trans par recuit à pcB/22mer, un oligonucléotide adaptateur par synthèse chimique ( trans configuration). pcB/22mer contient les deux groupes à l’extrémité 5' et se compose de 22 2' O-méthyl-modifed nucléotides (Figure 3 a). 19 nucléotides à l’extrémité 3' de la pcB/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) sont complémentaires aux dernière 19 nucléotides de l’Ext dH3 pré-ARNm. Cet pré-ARNm en plus d’être plus longue ne diffère pas significativement de la synthétique pcB-dH3 / 5m, contenant les mêmes deux clés de traitement des signaux : tige-boucle et U7-accepteur.

pcB-SL RNA est incubé avec 1 mL d’extrait S100 préparé par ultracentrifugation (100 000 x g pendant 1 h) de la fraction cytoplasmique obtenue à partir de cellules myélomateuses souris19 et l’effet et l’efficacité des UV-élution ont été tout d’abord analysés par coloration à l’argent. Un certain nombre de protéines ont été détecté sur des billes de streptavidine avant UV d’élution (Figure 1 b, piste 1). L’irradiation à grande longueur d’onde UV libéré seulement certaines de ces protéines au surnageant (Figure 1 b, piste 3), laissant un fond non spécifique sur les perles (Figure 1 b, allée 2), soulignant ainsi l’importance de l’étape d’élution UV. UV-élué les protéines majeures ont été identifiés par spectrométrie de masse comme 3' hExo et PBÉL, avec PBEL étant représenté par la protéine pleine longueur (FL) et un certain nombre de produits de dégradation plus courtes (DP). Petites quantités d’autres protéines, identifiés comme diverses protéines de liaison ARN (pratiques commerciales restrictives), ont été également sélectivement libérées à solution par irradiation aux rayons UV (Figure 1 b, piste 3).

pcB-dH3 / 5m pré-ARNm (Figure 2) ou Ext dH3 pré-ARNm recuit à pcB/22mer (Figure 3) ont été incubées avec 1 mL d’un extrait nucléaire de drosophile Kc cellules au formulaire de traitement complexes20,21. Afin de mieux évaluer la spécificité des protéines qui se lient à chaque histone pré-ARNm, un témoin négatif a été préparé en parallèle en ajoutant deux concurrents pour le nucléaire extrait : ARN SL qui séquestre PBEL et un oligonucléotide antisens court qui base s’associe la snRNA U7 et empêche l’interaction de la snRNP U7 avec son site sur le pré-ARNm.

L’étape d’élution UV de l’immobilisé pcB-dH3 / 5m pré-ARNm a entraîné un rejet sélectif de seulement un petit nombre de protéines dans le surnageant (Figure 2 b, voie 1), avec un fond intense des protéines non spécifiques restant sur les perles (Figure 2 b , piste 3). Ces protéines, étiquetée A-I, ont été identifiés par spectrométrie de masse en tant que composants des U7 snRNP15. L’échantillon contenue également partiellement dégradés PBEL qui migre à 10 kDa et ne peut être visible sur une concentration plus élevée que SDS/polyacrylamide gels. Toutes ces protéines n’ont pas été détectés en présence les deux concurrents de traitement qui bloquent la liaison des U7 snRNP d’histone pré-ARNm (Figure 2 b, allée 2).

Les mêmes composants de Drosophila U7 snRNP ont été libérés à la solution par irradiation UV d’un duplex immobilisée consistant dH3 Ext pré-ARNm et pcB/22mer (Figure 3 b, piste 1). Cet échantillon contenait en outre plusieurs protéines de liaison du RNA qui interagissent avec l’oligonucléotide pcB/22mer utilisé en excès pour former un duplex avec dH3 Ext pré-ARNm. Par contraste avec les sous-unités de l’U7 snRNP, ces protéines contaminantes, ainsi que toutes les protéines de fond qui sont restées sur les perles, a persisté en présence des concurrents de transformation (Figure 3 b, comparer les voies 1 et 2 et les pistes 3 et 4).

Une petite fraction des complexes de traitement UV-surnageant contenant et la même fraction de surnageant-UV d’un contrôle négatif (préparé en présence des oligonucléotides de deux concurrents et donc dépourvus de complexes de traitement) peuvent être directement analysés par spectrométrie de masse sans une séparation préalable des protéines éluées par électrophorèse de gel15. Cette méthode est très sensible dans la détection de toutes les protéines éluées indépendamment de leur taille et leur abondance et de concert avec l’échantillon négatif fournit une liste complète et impartiale des protéines qui associent spécifiquement aux histones pré-ARNm pour mener l’extrémité 3' réaction de transformation.

Figure 1
Figure 1 : Purification des protéines cytoplasmiques souris lié à pcB-SL RNA. (A) A schéma de synthèse chimique BPC-SL RNA (31-nucléotides). Biotine (Biot) à l’extrémité 5' est suivie d’une portion de photo-clivables (pc) sensible à la longueur d’onde UV (366 nm), entretoises atome deux 18 et 31 nucléotides qui forment la structure conservée tige-boucle à l’extrémité 3' des ARNm matures histone. (B) pcB-SL RNA est incubé avec S100 cytoplasmique extrait de cellules de myélome de souris. Les ARN et les protéines liées ont été purifiés sur des billes de streptavidine, abondamment lavés, UV éluée et analysés par coloration (piste 3) à l’argent. Protéines immobilisé sur des billes de streptavidine avant l’élution UV et a laissé les perles après élution UV sont affichés dans les couloirs 1 et 2, respectivement. Position des marqueurs de taille de protéine (en kDa) est indiquée à gauche.

Figure 2
Figure 2 : Purification des complexes de traitement de la drosophile assemblés sur pcB-dH3/5 m pré-ARNm. (A) un schéma de synthèse chimique drosophile-pré-ARNm spécifique pcB-dH3/5 m (63-nucléotides). Biotine (Biot) à l’extrémité 5' est suivie d’une portion de photo-clivables (pc), les deux entretoises de 18 atomes et 63 nucléotides qui contiennent le traitement essentiel de séquence de deux éléments : structure en épingle et U7-accepteur. Cinq nucléotides autour du site de clivage majeur situé entre les deux éléments sont complétés par un 2' groupe O-méthylés pour bloquer le clivage de la snRNP U7 lors de l’assemblage complexe (traversé les lignes). (B) pcB-dH3/5 m est incubée avec un extrait nucléaire de drosophile pour assembler des complexes de traitement. Dans le contrôle négatif, l’extrait nucléaire contient deux concurrents de traitement pour bloquer la liaison de PBEL et U7 snRNP d’histone pré-ARNm. Les complexes assemblés ont été immobilisés sur des billes de streptavidine, abondamment lavées et rejetés dans la solution par l’exposition de l’échantillon à grande longueur d’onde UV. Les fractions mêmes du matériau élué à l’UV (UV-sup) et les perles suite d’élution UV (UV-perles) ont été analysées par coloration à l’argent. Position des marqueurs de taille de protéine (en kDa) et streptavidine (SA) est indiquée à droite.

Figure 3
Figure 3 : Purification des complexes de traitement de la drosophile assemblés sur dH3 Ext pré-ARNm rattaché au groupe photo-clivables en trans. (A) A diagramme du duplex Ext dH3 généré par recuit généré T7 dH3 Ext pré-ARNm et oligonucléotides chimiquement synthétisés pcB/22mer avec la séquence suivante : 5' Biot/pc/18 s/18 s/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. Dans l’oligonucléotide, biotine (Biot) est placé à l’extrémité 5' et est suivi par l’éditeur de liens photo-clivables (pc). Les dernière 19 nucléotides (soulignées dans la séquence ci-dessus) sont complémentaires de l’extension 3' ajoutée à l’Ext dH3 pré-ARNm. La présence de 2' modifications O-méthyl (ne pas indiquées sur la figure) sert à deux fins : il stabilise l’oligonucléotide contre extrait nucléases et accroît la résistance du duplex formé avec le dH3 Ext pré-ARNm. (B) dH3 Ext duplex est incubé avec une drosophile Kc nucléaire extrait l’absence ou en présence de concurrents, immobilisés sur des billes de streptavidine, abondamment lavés et UV-élué avec les protéines liées de traitement. Les fractions mêmes du matériau élué à l’UV (UV-sup, voies 1 et 2) et les perles suite d’élution UV (UV-perles, pistes 3 et 4) ont été analysées par coloration à l’argent. Componenst spécifique de traitement complexes (celles qui sont éliminées par traitement concurrents) sont indiqués avec A aux lettres F. Les protéines de liaison majeurs du RNA non-spécifiques (celles qui sont éluées-UV mais persistent en présence les deux concurrents de traitement) sont indiquées par des astérisques. Position des marqueurs de taille de protéines (dans kDa) est indiquée à droite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La méthode décrite ici est simple et outre incorporant un linker photo-clivables et l’étape d’élution UV ne diffère pas des méthodes couramment utilisées qui tirent parti de la très forte interaction entre la biotine et la streptavidine. L’étape d’élution UV est très efficace, généralement libérant plus de 75 % de l’ARN immobilisée et protéines de streptavidine beads, laissant derrière elle un fond important de protéines qui se lient non spécifiquement aux talons associées. En éliminant cette toile de fond, l’étape d’élution UV donne remarquablement pures échantillons d’analyse directe par coloration à l’argent, de spectrométrie de masse et de tests fonctionnels.

Mettant en cause une procédure simple et relativement peu, à la suite de la méthode d’élution UV est très reproductible, fournissant une quantité suffisante de la snRNP U7 pour la coloration à l’argent d’aussi peu que 100 µL de souris et Drosophila nucléaire extrait15. La méthode est une alternative intéressante aux autres stratégies expérimentales précédemment utilisé pour purifier les complexes ARN/protéines, y compris le marquage substrats RNA avec un site de liaison de MS2 et immobiliser complexes associés sur des billes d’amylose via une fusion MBP-MS2 protéine. La stratégie de MS2, tandis que réussi à isoler des spliceosomes relativement abondant et canonique de 3' fin traitement complexes22,23, a échoué à produire des quantités suffisantes de traitement complexes contenant U7 snRNP (ZD, inédit résultats), qui est environ 100 fois moins concentrée dans les cellules animales que le grands U1 splicéosomal snRNP.

Beaucoup d’aspects du protocole doit être modifiées pour répondre aux différents objectifs de recherche individuels et de produire des résultats optimaux avec des autres complexes ARN/protéines. Tout d’abord, il est important de faire correspondre la quantité de substrat RNA utilisé pour l’assemblage complexe avec le montant de ce complexe qui existe dans l’extrait. Pour limiter les complexes, y compris les snRNP U7, en utilisant des substrats trop est contreproductif, augmentant seulement l’arrière-plan des protéines de liaison à l’ARN non spécifique dans le surnageant-UV. Deuxièmement, il est également important d’optimiser la durée et la température d’incubation pour promouvoir l’Assemblée vigoureuse du complexe, empêchant du même coup sa dissociation en raison de la protéolyse potentielle ou excessive dégradation de l’ARN.

Une clé difficilement en collaborant avec les complexes de traitement U7-dépendante et complexes ARN/protéines semblables qui transportent des activités enzymatiques n’est qu’après être assemblé ils peuvent dissocier par suite de la catalyse. Clivage des histones pré-ARNm se produit rapidement, même à basse température, réduisant considérablement le rendement des complexes de traitement purifiée. Pour éviter cet effet indésirable, le site de clivage majeur et de quatre nucléotides à proximité de pcB-dH3 / 5m pré-ARNm ont été modifiés au cours de la synthèse chimique avec des groupes (5m) de O-méthyl-2'10. Cet pré-ARNm est presque complètement résistant au clivage par U7 snRNP et peut être incubé avec un extrait nucléaire à température ambiante pendant 60 min sans perturbation complexe décelable. Le dH3 généré T7 Qu'ext recuit à pcB/22mer ne possède pas ces modifications et son incubation avec un extrait nucléaire est réalisée sur la glace pendant 5 min ou plus court pour limiter la catalyse. pcB-SL RNA contient mature 3' extrémité de l’histone ARNm et en extraits cytoplasmiques ne subit aucun traitement d’ajout. 3' hExo, qui est dépendante de magnésium 3' - 5' exonucléase est capable d’enlever 2-3 nucléotides de la simple queue échoués en vivo24,25 , mais in vitro que son activité est inhibée par la présence d’EDTA,16. Ainsi, pcB-SL RNA peut être incubé dans des extraits cytoplasmiques à température ambiante pendant une période prolongée sans effets indésirables, bien que généralement une incubation courte sur la glace est suffisante pour former un complexe ternaire de l’ARN avec hExo PBEL et 3'.

Les deux variantes de la méthode UV-élution, en utilisant des substrats de RNA avec biotine et l’éditeur de liens photo-clivables en cis (par covalence attaché à l’extrémité 5' de l’ARN) est globalement plus simple et donne des échantillons relativement purs. Une limitation importante de cette approche est que les deux groupes peuvent être par covalence attachés à des substrats de RNA n’excédant ne pas 65 ~ nucléotides. Des objectifs contraignants RNA plus longs peuvent être fixés à la portion de pcB en trans par un oligonucléotide adaptateur. Cependant, cette approche peut produire des fond plus élevée de protéines non spécifiques qui ont tendance à lier des excès de l’oligonucléotide adaptateur. Il est donc important d’utiliser uniquement un excès molaire minime de l’oligonucléotide suffisante pour lier le tout le substrat pré-ARNm utilisé pour l’expérience.

La nature chimique, la longueur et la séquence des oligonucléotides adaptateur réglable afin d’améliorer leur capacité à fonder la paire avec les séquences complémentaires dans les substrats de RNA, tout en réduisant leur capacité à interagir avec les protéines de liaison ARN non spécifiques. Enfin, plus substrats de pré-ARNm en duplex avec des oligonucléotides de l’adaptateur peuvent être immobilisées sur la streptavidine perles avant d’être utilisés pour la formation d’un complexe. Un des avantages de cette approche de la présélection, c’est qu’il élimine des molécules d’ARN échantillon qui n’a pas de recuire à l’oligonucléotide. Ces molécules conservent une capacité normale de rassembler en un complexe dans l’extrait, mais sont incapables lier les perles de la streptavidine, partiellement réduire le rendement de la purification.

En plus purifiant complexes assemblés sur des substrats de RNA monocaténaire, la méthode UV-élution de manière similaire peut servir à purifier les protéines ou complexes de protéines qui se lient à des séquences d’ADN simple et double-brin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Acknowledgments

Nous remercions nos collègues et collaborateurs pour leur contribution à nos travaux. Cette étude a été financée par les NIH accorder GM 29832.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin-Agarose Sigma S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp Cole-Parmer UX-97600-00
Replacement bulb Cole-Parmer UX-97600-19 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) Promega P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) Promega P1280
Pierce Silver Stain Kit ThermoFisher Scientific 24612

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
  3. Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
  4. Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
  5. Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
  6. Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
  7. Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
  8. Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
  9. Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
  10. Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
  11. Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
  12. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  13. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
  14. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
  15. Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
  16. Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
  17. Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
  18. Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
  19. Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
  20. Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
  21. Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
  22. Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
  23. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
  24. Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
  25. Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).

Tags

Biochimie numéro 143 purification d’affinité complexes ARN/protéines biotine streptavidine éditeur de liens photo-clivables UV-élution U7 snRNP 3' fin de traitement
Seule étape Purification des Complexes macromoléculaires utilisant l’ARN attaché à la biotine et un éditeur de liens Photo-clivables
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Skrajna, A., Yang, X. C., Dominski,… More

Skrajna, A., Yang, X. C., Dominski, Z. Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker. J. Vis. Exp. (143), e58697, doi:10.3791/58697 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter