Summary
RNA och protein komplex renas med hjälp av botin-streptividin strategi elueras lösning under denatureringen förhållanden i en form som är olämpliga för ytterligare rening och funktionell analys. Här beskriver vi en ändring av denna strategi som utnyttjar en foto-cleavable linker i RNA och en mild UV-eluering steg, framställning av infödda och fullt fungerande RNA och protein komplex.
Abstract
Under många år har exceptionellt starkt och snabbt bildade samspelet mellan biotin och streptividin använts framgångsrikt för delvis rening av biologiskt viktiga RNA och protein komplex. Men denna strategi lider en stor nackdel som begränsar dess bredare utnyttjande: biotin/streptividin interaktionen kan brytas under denatureringen villkor som också stör integriteten för de eluerade komplex, därmed utgör hinder för deras efterföljande funktionell analys och/eller ytterligare rening av andra metoder. Dessutom är de eluerade proverna ofta förorenat med bakgrunden proteinerna som nonspecifically förknippar med streptividin pärlor, komplicerar analysen av renat komplexen av silverfärgning och masspektrometri. För att övervinna dessa begränsningar, vi utvecklat en variant av biotin/streptividin strategin som biotin är kopplad till en RNA-substrat via en foto-cleavable länkare och komplexen orörlig på streptividin pärlor elueras selektivt till lösning i en Native form av långvåg UV, lämnar proteinerna som bakgrund på pärlor. Kortare RNA bindande substrat kan syntetiseras kemiskt med biotin och foto-cleavable länkaren kovalent bifogas 5' slutet av RNA, medan längre RNA substrat kan förses med två grupper av en kompletterande oligonukleotiden. Dessa två varianter av UV-eluering metoden testades för rening av U7 snRNP-beroende bearbetning komplex som klyver Histon pre-mRNA i slutet 3' och de båda visat att jämföra gynnsamt till andra tidigare utvecklat reningsmetoder. UV-elueras proverna innehöll lätt påvisbara mängder av U7 snRNP som var fritt från föroreningar i stora protein och lämplig för direkt analys av masspektrometri och funktionella analyser. Den beskrivna metoden kan lätt anpassas för rening av andra RNA-bindande komplex och används tillsammans med singel - och dubbelsträngat DNA bindande platser för att rena DNA-specifika proteiner och makromolekylärt komplex.
Introduction
I Eukaryoter genomgå RNA-polymeras II-genererade mRNA prekursorer (pre-mRNA) flera mognad händelser i kärnan innan det blir fullt fungerande mRNA mallar för proteinsyntesen i cytoplasman. En av dessa händelser är 3' slutet bearbetning. För den stora majoriteten av pre-mRNA innefattar 3' avsluta behandlingen klyvning kopplad till polyadenylation. Denna två-stegs reaktion katalyseras av en relativt riklig komplex bestående av mer än 15 proteiner1. Djur replikering-beroende Histon pre-mRNA behandlas i 3' slutet av en annan mekanism där rollen spelas av U7 snRNP, en låg överflöd komplex bestående av U7 snRNA ~ 60 nukleotider och flera proteiner2,3 . U7 snRNA basparen med en specifik sekvens i Histon pre-mRNA och en av subunitsna av den U7 snRNP katalyserar reaktionen klyvning, genererar mogen Histon mRNA utan en poly(A) svans. 3' slutet bearbetning av Histon pre-mRNA kräver också Stem-Loop bindande Protein (SLBP), som binder en bevarade stem-loop som ligger uppströms webbplatsen klyvning och förbättrar rekrytering av den U7 snRNP till substrat2,3. Studier som syftar till att identifiera enskilda komponenter i den U7 snRNP har varit utmanande på grund av den låga koncentrationen av den U7 snRNP i djurceller och tendensen av anläggningen att dissociera eller genomgå partiell proteolys under reningen till följd av att milda tvättmedel4,5,6, hög salt tvättar eller flera kromatografiska steg7,8,9.
Nyligen, för att bestämma sammansättningen av U7-beroende bearbetningsmaskiner, en korta fragment av Histon pre-mRNA som innehåller biotin på antingen 3 eller 5' var inkuberas med en nukleär extrakt och monterade komplexen fångades på streptividin-belagd agaros pärlor5,6,10. På grund av exceptionellt stark växelverkan mellan biotin och streptividin, var proteiner orörlig på streptividin pärlor elueras under denatureringen villkor genom kokning i SDS och analyseras av silverfärgning och masspektrometri. Medan denna enkla metod identifierat ett antal komponenter i den U7 snRNP, gav det ganska grov prover, ofta förorenade med ett stort antal bakgrund proteiner nonspecifically bunden till streptividin pärlor, potentiellt maskera vissa komponenter i maskinen och förhindra deras upptäckt på silver färgade geler5,6,10. Allt utesluten detta tillvägagångssätt också någon funktionella studier med isolerade materialet och dess ytterligare rening till homogenitet med ytterligare metoder.
Ett antal ändringar föreslogs över tid att ta itu med den nästan oåterkalleliga karaktär av biotin/streptividin samverkan, med de flesta av dem utformas antingen försvaga interaktionen eller tillhandahålla en kemiskt cleavable spacer arm i den som innehåller biotin reagenser11,12. Nackdelen med alla dessa ändringar var att de avsevärt minska effektiviteten av metod eller ofta krävs icke-fysiologiska förhållanden under eluering steg, äventyra integriteten eller aktivitet av de renade proteinerna.
Här beskriver vi en annan strategi för att lösa det inneboende problemet i strategin biotin/streptividin med hjälp av RNA substrat som biotin är kovalent bifogas den 5' slut via en foto-cleavable 1-(2-nitrofenyl) etyl-delen som är känsliga för långt vinka UV13,14. Vi testade detta tillvägagångssätt för rening av den begränsande U7-beroende bearbetning maskinen från Drosophila och däggdjurs nukleära extrakt15. Efter en kort inkubation av Histon pre-mRNA som innehåller biotin och foto-cleavable länkaren med en nukleär extrakt, de monterade bearbetning komplex orörlig på streptividin pärlor, noggrant tvättas och försiktigt ut till lösning i en infödd form av exponering för ~ 360 nm UV ljus. UV-eluering metoden är mycket effektiv, snabb och okomplicerad, ger tillräckliga mängder av de U7 snRNP att visualisera dess komponenter av sliver färgning från så lite som 100 µL av extraktet15. UV-elueras materialet är fri från bakgrunden proteiner och lämplig för direkt masspektrometri analys, ytterligare reningssteg och enzymatisk analyser. Samma metod kan antas för rening av andra RNA och protein komplex som kräver relativt korta RNA bindningsställen. Biotin och foto-cleavable länkaren kan även kovalent kopplas till singel - och dubbelsträngat DNA, potentiellt utvidga UV-eluering metoden för rening av olika DNA och protein komplex.
Kemisk syntes av RNA substrat som innehåller kovalent fäst biotin och foto-cleavable länkaren är praktiskt endast med de sekvenser som inte överstiger ~ 65 nukleotider, blir dyrt och ineffektivt för betydligt längre sekvenser. För att lösa detta problem, har vi också utvecklat en alternativ metod som är lämplig för mycket längre RNA bindande mål. I denna strategi, RNA av valfri längd och nukleotid sekvens är genererade i vitro genom T7 eller SP6 transkription och glödgas till en kort kompletterande oligonukleotiden som innehåller biotin och foto-cleavable länkaren i slutet 5' (trans konfiguration). Den resulterande duplex används därefter att rena individuella bindande proteiner eller makromolekylära komplex på streptividin pärlor efter samma protokoll som beskrivs för de RNA substrat som innehåller foto-cleavable biotin fäst kovalent (cis konfiguration). Med denna ändring, kan den foto-cleavable biotin användas tillsammans med in vitro- genererade avskrifter som innehåller hundratals nukleotider, utvidga den UV-eluering metoden för rening av ett brett utbud av RNA och protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. substrat förberedelse
Obs: RNA substrat kortare än ~ 65 nukleotider kan syntetiseras kemiskt med biotin (B) och foto-cleavable (pc) länkaren (grupp kallad foto-cleavable biotin eller pcB) kovalent fäst vid RNA 5' slutet (cis -konfiguration). RNA-substrat som innehåller betydligt längre bindande platser måste vara genererade i vitro genom T7 (eller SP6) transkription och därefter glödgas till en kort kompletterande adapter oligonukleotiden innehållande pcB biexponentiellt i slutet 5' (trans konfiguration) (figur 1).
- För bindande platser som består av färre än ~ 65 nukleotider, använda en kommersiell tillverkare (Tabell för material) att kemiskt syntetisera RNA av intresse med pcB kovalent bifogas RNA 5' slutet (figur 1A och figur 2A). Lös upp i sterilt vatten för att uppnå önskad koncentration och lagra i små alikvoter vid-80 ° C.
- För bindningsställen betydligt genererade längre än ~ 65 nukleotider, bildar en partiell duplex i en in vitro- RNA av intresse och en kompletterande adapter oligonukleotiden innehållande pcB-delen i 5' slutet (figur 3A).
- Utföra T7 transkription på antingen en linearized plasmid-DNA eller en lämplig PCR-mall för att generera RNA med webbplatsen bindande intresseanmälan förlängas en godtycklig ~ 20-nukleotidsekvensen i slutet 3'.
- Använda en kommersiell tillverkare (Tabell för material) att kemiskt syntetisera en adapter oligonukleotiden som är ett komplement till tillägget 3' i T7-genererade RNA och innehåller pcB i 5' slutet (figur 3A).
Obs: Två 18-atom distanser och 2-3 icke-kompletterande nukleotider kan placeras i slutet 5' av oligonukleotiden att minska potentiella sterisk hinder mellan bundna komplex och streptividin pärlor. Det är också önskvärt att oligonukleotiden jämnt är modifierad med en 2' O-metyl grupp att förbättra styrkan i duplex och ge motstånd mot olika nukleaser. - Glödga T7-genererade RNA till den pcB adapter oligonukleotiden.
- Blanda 20 pmol av RNA och 100 pmol av den adapter pcB oligonukleotiden (1:5 molar förhållandet) i en 1,5 mL tub innehållande 100 µL av bindande buffert med följande sammansättning: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glycerol, 10 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA).
Obs: Det är viktigt att använda en minimal mängd av den adapter oligonukleotiden som är tillräckligt för att bilda en duplex med de flesta (om inte alla) pre-mRNA-substrat som används i glödgning reaktionen. Detta kunde vara bekvämt bestäms av märkning RNA substrat i 5' slutet med 32P, glödgning märkt substratet med ökande mängder av adapter oligonukleotiden med olika buffert villkor och övervakning bibehållandet av den radioaktiva signal på streptividin pärlor efter flera tvättar av pärlor med bindande bufferten. - Placera röret i kokande vatten i 5 min.
- Låt vattnet svalna till rumstemperatur.
- Blanda 20 pmol av RNA och 100 pmol av den adapter pcB oligonukleotiden (1:5 molar förhållandet) i en 1,5 mL tub innehållande 100 µL av bindande buffert med följande sammansättning: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glycerol, 10 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA).
2. komplex sammansättning
- Tillägg 1 mL av en mus nukleära extrakt (eller en annan extrakt av val) med 80 mM EDTA pH 8 till en slutlig koncentration av 10 mM att blockera ospecifik metall-beroende nukleaser som finns i extraktet.
Obs: Detta kommer att resultera i justera buffert i utdraget till samma sammansättning som i bindande bufferten (se steg 1.2.3.1). EDTA påverkar inte in vitro- bearbetning av Histon pre-mRNA men kan vara skadligt för rening av proteiner eller proteinkomplex som monterar på ett sätt som magnesium-beroende. I dessa fall bör EDTA undvikas. - Lägg till 5-10 pmol RNA substratets märkta med den pcB biexponentiellt i cis (se steg 1.1) eller trans (se steg 1.2.3.3) till 1 mL av extraktet innehållande 10 mM EDTA.
Obs: Mängden RNA måste utvärderas noggrant i en serie prov experiment. Använda för mycket RNA substrat för rening av ett begränsande komplex kanske kontraproduktivt, avsevärt öka bakgrunden av ospecifik RNA-bindande proteiner utan att ha någon effekt på avkastningen av specifika proteiner. - Inkubera RNA underlaget med extraktet för 5 min på isen, ibland blanda provet.
Obs: Både tid och temperatur av Inkubationen måste fastställas empiriskt och kan variera avsevärt, beroende på den särskilda karaktären hos RNA och protein komplex. - Snurra inkubation blandningen i en nedkylda mikrocentrifug för 10 min vid 10 000 x g att ta bort alla potentiella fällningar och omsorgsfullt samla den supernatant undvika överföra pelleten.
3. immobilisering av RNA och protein komplex på streptividin pärlor.
- Överföra ~ 100 µL streptividin agaros pärla suspension från en kommersiell leverantör (Tabell för material) till en 1,5 mL tub och öka volymen med bindande bufferten (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glycerol, 10 mM EDTA).
Obs: Denna buffert bör ha samma sammansättning som i glödgning blandningen och extraktet används för komplex sammansättning (steg 2.1). - Samla pärlor längst ned på röret genom spinning för 2-3 min på 25 x g och Aspirera supernatanten.
- Upprepa förfarandet för samma tvätt/spinning 2 - 3 gånger temperera pärlorna med bindande bufferten.
Obs: I slutet av detta steg, pelleten av pärlor bör ha en volym av ~ 30 µL. - Ladda supernatanten innehållande monterade komplexet (steg 2,4) över skakade streptividin agaros pärlorna.
- Rotera 1 h vid 4 ° C att immobilisera RNA och de bundna komplex på pärlor.
- Samla pärlor längst ned på röret genom spinning för 2-3 min på 25 x g.
Obs: Använd en utsvängbar rotor för att undvika betydande förlust av pärlor om de tenderar att hålla sig till sidan av röret i kantiga rotorer. - Aspirera supernatanten och skölj pärlorna två gånger med 1 mL av det bindande buffert, med samma centrifugering villkor.
- Tillsätt 1 mL av den bindande bufferten och rotera provet 1 h vid 4 ° C.
Obs: Detta steg kan förkortas om de komplex som bildas på substratet tenderar att dissociera. - Snurra ner pärlorna för 2-3 min på 25 x g, tillsätt 1 mL av bufferten och överför till en ny tub.
- Rotera för en ytterligare 1 h eller kortare, om anläggningen inte är stabil, snurra ner för 2-3 min 25 x g och överföra pärlorna till ett 500 µL rör i 200 µL av bindande buffert.
4. UV-eluering.
- Slå på en hög intensitet UV-lampa avger 365 nm UV ljus för 5-10 min innan den når full briljans.
Obs: Detta är nödvändigt för att uppnå maximal energi av UV strålning vid början av bestrålning. - Fyll botten av en petriskål (100 x 15 mm) med tätt packad is och stack den över skålens lock.
- Kort vortex röret som innehåller den immobiliserade komplexet, placera det vågrätt på isen och täck med pre värmde lampan, att säkerställa att provet ligger inom 2-3 cm av ytbehandla av glödlampan.
Obs: Om avståndet är för stort, använda ytterligare petriskålar eller andra lämpliga objekt för att få provet närmare till glödlampan. - Bestråla för totalt 30 min, ofta Invertera och vortexa röret att säkerställa enhetlig exponering av upphängning för UV- och förhindra överhettning.
Obs: För att ge ytterligare kylning, UV-eluering steget kan utföras i ett kallt rum. Växla till en petriskål med färsk is vid överdriven isen smälter. - Snurra ner pärlorna för 2-3 min på 25 x g och samla supernatanten.
- Re-Spin supernatanten med samma villkor och samla supernatanten.
Obs: Lämna en liten mängd av supernatanten i botten för att undvika att överföra resterande pärlor.
5. provets analys av silverfärgning följt av masspektrometri.
- Använda SDS/polyakrylamid gelelektrofores att avskilja en del av UV-elueras supernatanten och den samma bråkdel av materialet kvar på pärlor efter UV eluering.
Obs: Analysen kan också inbegripa en alikvot av pärlor ur provet innan UV-eluering. - Färga den gel innehållande separerade proteiner med hjälp av kommersiellt tillgängliga silver färgning kit.
- Utvärdera effektiviteten i UV-eluering genom att jämföra stödnivåerna proteiner närvarande i UV-elueras supernatanten och de lämnade på pärlor efter UV-bestrålning.
- Punktskatt banden protein av intresse och bestämma deras identiteter genom masspektrometri använder standardprotokoll10,15.
6. global analys av UV-elueras prov av masspektrometri.
- Direkt analysera en bråkdel av UV-elueras supernatanten genom masspektrometri att avgöra det hela proteomet av renade materialet på ett opartiskt sätt.
Obs: Detta kan göras genom in-lösning behandling av renat proverna med trypsin följt av standard masspektrometri protokoll att fastställa identiteten på de generera peptider10,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UV-eluering metoden testades med två kemiskt syntetiserade RNA substrat kovalent bifogas i slutet 5' den pcB biexponentiellt (cis -konfiguration): pcB-SL (figur 1) och pcB-dH3/5 m RNAs (figur 2). 31-nukleotid pcB-SL RNA innehåller en stam-loop struktur följt av en 5-nukleotid enda stranded svans och dess sekvens är identisk med 3' ände mogen Histon mRNA (dvs., efter klyvning av Histon pre-mRNA av U7 snRNP). Denna unika sekvens är en känd bindningsstället för två proteiner presentera i däggdjur cytoplasmiska fraktionen: SLBP och 3' hExo16,17,18. pcB-dH3 / 5m är en 63-nukleotid fragment av Drosophila H3 Histon pre-mRNA och förutom stem-slingan innehåller en sekvens som binder Drosophila U7 snRNP (figur 2).
dH3 Ext (125 nukleotider) är ett exempel på längre RNA substrat som kan genereras av T7 transkription och försedd med biotin och en foto-cleavable spacer i trans av glödgning till pcB/22mer, ett kemiskt syntetiserade adapter oligonukleotiden ( Trans konfiguration). pcB/22mer innehåller två grupper i slutet 5' och består av 22 2' O-metyl-modifed nukleotider (figur 3A). 19 nukleotider i slutet 3' av den pcB/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) är ett komplement till de senast 19 nukleotiderna av dH3 Ext pre-mRNA. Detta pre-mRNA förutom att vara längre skiljer sig inte avsevärt från den syntetiska pcB-dH3 / 5m, som innehåller samma två viktiga bearbetning signaler: stam-loop och U7-bindningsstället.
pcB-SL RNA var inkuberas med 1 mL av S100-extrakt som utarbetats av ultracentrifugering (100 000 x g för 1 h) i cytoplasmiska bråket erhållits från mus myelom celler19 och effekten och effektiviteten av UV-eluering analyserades först av silverfärgning. Ett antal proteiner upptäcktes på streptividin pärlor innan UV-eluering (figur 1B, lane 1). Bestrålning med långvåg UV släppte endast en del av dessa proteiner till supernatanten (figur 1B, lane 3), lämnar en ospecifik bakgrund på pärlor (figur 1B, lane 2), därav betonar vikten av UV-eluering steget. Stora UV-elueras proteiner identifierades genom masspektrometri som 3' hExo och SLBP, med SLBP företräds av full längd protein (FL) och ett antal kortare nedbrytningsprodukter (DP). Mindre mängder av andra proteiner, identifierats som olika RNA-bindande proteiner (RBPs), släpptes också selektivt till lösning av UV-bestrålning (figur 1B, lane 3).
pcB-dH3 / 5m pre-mRNA (figur 2) eller dH3 Ext pre-mRNA glödgas till pcB/22mer (figur 3) inkuberades med 1 mL av en nukleär extrakt från Drosophila Kc cellerna att bilda bearbetning komplex20,21. För att bättre utvärdera specificiteten av proteiner som binder till varje Histon pre-mRNA, en negativ kontroll utarbetades parallellt genom att lägga till två konkurrenter till den kärntekniska extrahera: SL RNA som sequesters SLBP och en kort antisense oligonukleotiden att bas par med den U7 snRNA och förhindrar samspelet mellan den U7 snRNP med dess webbplats på pre-mRNA.
UV-eluering kliva av immobiliserade pcB-dH3 / 5m pre-mRNA resulterade i en selektiv utgåva av endast ett litet antal proteiner till supernatanten (figur 2B, lane 1), med intensiva bakgrund av icke-specifika proteiner kvar på pärlor (figur 2B , lane 3). Dessa proteiner, märkt A-I, identifierades genom masspektrometri som komponenter av U7 snRNP15. Provet innehöll också delvis förstörd SLBP som migrerar på 10 kDa och kan endast vara synlig på högre koncentration SDS/polyakrylamid geler. Alla dessa proteiner identifierades inte i närvaro av två bearbetning konkurrenterna som blockerar bindningen av U7 snRNP till Histon pre-mRNA (figur 2B, lane 2).
Samma komponenter av Drosophila U7 snRNP släpptes till lösning av UV-bestrålning av en immobiliserade duplex bestående av dH3 Ext pre-mRNA och pcB/22mer (figur 3B, lane 1). Detta prov innehöll dessutom flera RNA-bindande proteiner som interagerat med den pcB/22mer oligonukleotiden används i överskott för att bilda en duplex med dH3 Ext pre-mRNA. I motsats till subunitsna av U7 snRNP, dessa kontaminerande proteiner, samt alla de proteiner som bakgrund som återstod på pärlor, framhärdade i närvaro av bearbetning konkurrenterna (figur 3B, jämför körfält 1 och 2, och lanes 3 och 4).
En bråkdel av de UV-supernatant innehållande bearbetning komplex och samma fraktionen av UV-supernatanten från en negativ kontroll (beredd i närvaro av de två konkurrent oligonukleotider och därmed saknar bearbetning komplex) kan vara direkt analyseras av masspektrometri utan en föregående separation av de eluerade proteinerna av gelelektrofores15. Denna metod är mycket känsligt att upptäcka alla eluerade proteiner oavsett storlek och överflöd och i samband med negativa provet ger en komplett och opartisk lista av proteiner som specifikt förknippar med Histon pre-mRNA att genomföra 3' slutet bearbetning reaktion.
Figur 1: rening av cytoplasmisk musproteiner bunden till pcB-SL RNA. (A) A diagram för kemiskt syntetiserade pcB-SL RNA (31-nukleotider). Biotin (Biot) i slutet 5' följs av en foto-cleavable del (pc) som är känsliga för långt vinka UV (366 nm), två 18 atom distanser och 31 nukleotider som bildar bevarat stem-loop struktur finns i 3' slutet av mogen Histon mRNA. (B) pcB-SL RNA var inkuberas med S100 cytoplasmiska extrakt från mus myelomceller. Den RNA och bundna proteiner var renat på streptividin pärlor, i stor utsträckning tvättas, UV elueras och analyseras av silver färgning (lane 3). Proteiner orörlig på streptividin pärlor innan UV eluering och lämnade på pärlor efter UV eluering visas i körfält 1 och 2, respektive. Positionen av protein storlek markörer (i kDa) indikeras till vänster.
Figur 2: Rening av Drosophila bearbetning komplex monterade på pcB-dH3/5 m pre-mRNA. (A) ett diagram av kemiskt syntetiserade Drosophila-specifika pcB-dH3/5 m pre-mRNA (63-nukleotider). Biotin (Biot) i slutet 5' följs av en foto-cleavable del (pc), två 18-atom distanser och 63 nukleotider som innehåller två sekvens element väsentliga bearbetning: stam-loop struktur och U7-bindningsstället. Fem nukleotider runt stora klyvning platsen ligger mellan de två beståndsdelarna är modifierad med en 2' O-metyl grupp för att blockera klyvning av den U7 snRNP under komplex sammansättning (korsade linjer). (B) pcB-dH3/5 m var inkuberas med ett Drosophila kärnvapen att montera bearbetning komplex. I den negativa kontrollen innehåller nukleära extraktet två bearbetning konkurrenter för att blockera bindningen av SLBP och U7 snRNP till Histon pre-mRNA. De monterade komplex var orörlig på streptividin pärlor, i stor utsträckning tvättas och släpptes till lösning av provet exponering för långvåg UV. De samma fraktionerna av UV-elueras materialet (UV-SUP) och pärlor efter UV-eluering (UV-pärlor) analyserades av silverfärgning. Positionen av protein storlek markörer (i kDa) och streptividin (SA) indikeras till höger.
Figur 3: Rening av Drosophila bearbetning komplex monterade på dH3 Ext pre-mRNA kopplade till gruppen foto-cleavable i trans. (A) A diagram över dH3 Ext duplex genereras av glödgning T7-genererade dH3 Ext pre-mRNA och kemiskt syntetiserade pcB/22mer oligonukleotiden med följande sekvens: 5' Biot/pc/18S/18S/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. I oligonukleotiden, biotin (Biot) är placerad i slutet 5' och följs av foto-cleavable (pc) länkaren. De senast 19 nukleotider (understruken i sekvensen ovan) är ett komplement till den 3' utsträckande adderat till dH3 Ext pre-mRNA. Förekomsten av 2' O-metyl ändringar (inte anges i figuren) tjänar två syften: Det stabiliserar oligonukleotiden mot extrakt nukleaser och ökar styrkan i duplex bildade med dH3 Ext pre-mRNA. (B) dH3 Ext duplex var inkuberas med en Drosophila Kc nukleära extrahera frånvaro eller närvaro av bearbetning konkurrenter, orörlig på streptividin pärlor, i stor utsträckning tvättas och UV-elueras tillsammans med bundna proteinerna. De samma fraktionerna av UV-elueras materialet (UV-sups, körfält 1 och 2) och pärlor efter UV-eluering (UV-pärlor, körfält 3 och 4) analyserades av silverfärgning. Specifika componenst av bearbetning komplex (de som elimineras genom bearbetning konkurrenter) indikeras med A till F bokstäver. Större icke-specifik RNA-bindande proteiner (de som är UV-elueras men kvarstår i närvaro av två bearbetning konkurrenterna) markeras med asterisker. Placeringen av protein storlek markörer (i kDa) anges till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här är okomplicerat och förutom införliva en foto-cleavable länkare och UV-eluering steget skiljer sig inte från de vanliga metoder att utnyttjar den extremt starka växelverkan mellan biotin och streptividin. Det UV-eluering steget är mycket effektiv, vanligtvis släppa mer än 75% av immobiliserade RNA och associerade proteiner från streptividin pärlor, lämnar bakom en hög bakgrund av proteiner som icke-specifikt binder till pärlorna. Genom att eliminera denna bakgrund, ger steget UV-eluering anmärkningsvärt ren prover passar direkt analys av silverfärgning, masspektrometri och funktionella analyser.
Till följd av involvera en relativt få och enkla steg, UV-eluering metoden är mycket reproducerbara, att tillhandahålla tillräckliga mängder av de U7 snRNP för silverfärgning från så lite som 100 µL av mus och Drosophila nukleära extrakt15. Metoden är ett attraktivt alternativ till andra experimentella strategier som tidigare brukade rena RNA och protein komplex, inklusive taggning RNA substrat med en MS2 bindningsställe och immobilisera associerade komplex på amylose pärlor via en MS2-MBP fusion protein. MS2 strategin, medan lyckats isolera relativt riklig spliceosomes och kanoniska 3' slut bearbetning komplex22,23, underlåtit att ge tillräckliga mängder bearbetning komplex som innehåller U7 snRNP (ZD, opublicerad resultat), som är cirka 100 gånger mindre koncentrerad i djurens celler än de stora snRNP U1 spliceosomal.
Många aspekter av protokollet behöver ändras för att tillgodose olika individuella forskning mål och att skapa optimala resultat med andra RNA och protein komplex. Först, är det viktigt att matcha mängden det RNA-substrat som används för komplex sammansättning med beloppet av detta komplex som finns i extraktet. För att begränsa komplex, inklusive U7 snRNP, är använder för mycket substrat kontraproduktivt, endast öka bakgrunden av icke-specifika RNA-bindande proteiner i UV-supernatanten. Andra, det är också viktigt att optimera längden och temperaturen inkubation att främja kraftfull montering av komplexet, förhindra samtidigt dess dissociation på grund av potentiella proteolys eller överdriven RNA nedbrytning.
En nyckel difficultly i arbeta med U7-beroende bearbetning komplex och liknande RNA och protein komplex som bär enzymatiska aktiviteter är att de efter att vara färdigmonterade kan separera till följd av katalys. Klyvning av Histon pre-mRNA uppstår snabbt även vid låga temperaturer, vilket avsevärt minskar avkastningen av de rena bearbetning komplex. För att förhindra denna oönskade effekt, ändrades webbplatsen stora klyvning och fyra närliggande nukleotider i pcB-dH3 / 5m pre-mRNA under kemisk syntes med 2' O-metyl grupper (5m)10. Detta pre-mRNA är nästan helt resistent mot klyvning av U7 snRNP och kan inkuberas med en nukleär extrakt i rumstemperatur i 60 min utan att orsaka detekterbara komplexa störningar. Den T7-genererade dH3 Ext glödgas till pcB/22mer saknar dessa ändringar och dess inkubation med en nukleär extrakt utförs på is under 5 minuter eller kortare att begränsa katalys. pcB-SL RNA innehåller mogna 3' ände Histon mRNA och i cytoplasmiska extrakt genomgår inte någon tillsats bearbetning. 3' hExo, som är beroende av magnesium 3' - 5' exonuclease klarar av att ta bort 2-3 nukleotider enda stranded svans i vivo24,25 men i vitro dess aktivitet hämmas av närvaron av EDTA16. Som ett resultat, kan pcB-SL RNA inkuberas i cytoplasmiska extrakt i rumstemperatur en längre tid utan några negativa effekter, även om en kort inkubation på is är vanligtvis tillräckligt för att bilda en ternär komplex av RNA med SLBP och 3' hExo.
Två alternativa varianter av metoden UV-eluering, använder RNA substrat med biotin och foto-cleavable länkaren i cis (kovalent bifogas 5' slutet av RNA) övergripande är enklare och ger relativt rena prover. En viktig begränsning av detta tillvägagångssätt är att de två grupperna kan fästas kovalent till RNA substrat inte överstiger ~ 65 nukleotider. Längre RNA bindande mål kan kopplas till den pcB biexponentiellt i trans via en adapter oligonukleotiden. Detta tillvägagångssätt kan dock ge högre bakgrund av icke-specifika proteiner som tenderar att binda överskott av den adapter oligonukleotiden. Det är därför viktigt att använda endast en minimal molar överskott av oligonukleotiden som är tillräcklig för att binda alla det pre-mRNA substrat som används i experimentet.
Sekvens, längd och kemiska beskaffenhet adapter oligonukleotider kan varieras för att förbättra deras förmåga att basera par med kompletterande sekvenser i de RNA-substratesna, samtidigt minska deras förmåga att interagera med ospecifika RNA-bindande proteiner. Slutligen kan längre pre-mRNA substrat dubbelsidiga med adapter oligonukleotider immobiliseras på streptividin pärlor innan används för komplexa bildande. En fördel med detta förval synsätt är att det eliminerar från de prov RNA-molekyler som lyckats glödga till oligonukleotiden. Dessa molekyler behåller en normal förmåga att montera i ett komplex i extraktet men är inte binda streptividin pärlor, delvis minska avkastningen av rening.
Förutom renande komplex monteras på enkelsträngat RNA substrat, kan UV-eluering metoden på ett liknande sätt användas för att rena proteiner eller proteinkomplex som binder och dubbel-enkelsträngat DNA-sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Vi tackar våra kolleger och medarbetare för deras bidrag till vårt arbete. Denna studie stöddes av NIH bevilja GM 29832.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L.
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
