Summary
Complessi RNA/proteici purificati mediante botin-streptavidina strategia sono eluiti per soluzione in condizioni denaturanti in forma inadatta per ulteriore purificazione e analisi funzionale. Qui, descriviamo una modifica di questa strategia che utilizza un linker foto-spaccabili in RNA e un delicato passaggio di UV-eluizione, producendo complessi RNA/proteine native e completamente funzionale.
Abstract
Per molti anni, eccezionalmente forte e rapidamente formato interazione biotina streptavidina è stata utilizzata con successo per purificazione parziale dei complessi RNA/proteine biologicamente importanti. Tuttavia, questa strategia soffre di uno dei principali svantaggi che limita il suo utilizzo più ampio: l'interazione biotina/streptavidina può essere rotto solo sotto denaturare condizioni che anche compromettere l'integrità dei complessi eluiti, quindi precludendo loro successive analisi funzionale e/o ulteriore purificazione da altri metodi. Inoltre, i campioni eluiti sono spesso contaminati con le proteine di sfondo che non specifico associano con streptavidina perline, che complica l'analisi dei complessi purificati dalla macchiatura d'argento e spettrometria di massa. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una variante della biotina/streptavidina strategia in cui biotina è collegata a un RNA substrato tramite un linker foto-spaccabili e i complessi immobilizzati su streptavidina perline sono eluiti selettivamente alla soluzione in un formato nativo di onda lunga UV, lasciando le proteine di sfondo sui branelli. Substrati di associazione più breve RNA possono essere sintetizzati chimicamente con biotina e il linker foto-spaccabili legame covalente all'estremità 5' del RNA, mentre più substrati di RNA possono essere forniti con i due gruppi di un oligonucleotide complementare. Queste due varianti del metodo UV-eluizione sono state testate per la purificazione dei complessi elaborazione snRNP-dipendente U7 che fendono istone pre-mRNA all'estremità 3' e hanno entrambi dimostrato di reggono il confronto ad altri precedentemente sviluppato metodi di purificazione. I campioni eluiti UV contengono quantità molto facilmente rilevabile delle snRNP U7 che era esente dagli agenti inquinanti principali proteine e adatto per l'analisi diretta di spettrometria di massa e saggi funzionali. Il metodo descritto può essere prontamente adattato per la purificazione di altri complessi di associazione di RNA e utilizzato in combinazione con siti di legame del DNA singolo - e double-stranded per purificare proteine DNA-specifico e complessi macromolecolari.
Introduction
Negli eucarioti, precursori di RNA polimerasi II-generato mRNA (pre-mRNA) sottoporsi a diversi eventi di maturazione nel nucleo prima di diventare pienamente funzionali modelli di mRNA per la sintesi proteica nel citoplasma. Uno di questi eventi è di processamento dell'estremità 3'. Per la stragrande maggioranza dei pre-mRNA, 3' fine trattamento comporta clivaggio accoppiato di poliadenilazione. Questa reazione in due fasi è catalizzata da un complesso relativamente abbondante composto da più di 15 proteine1. Animale replica-dipendente dell'istone pre-mRNA vengono elaborati all'estremità 3' da un meccanismo differente in cui il ruolo chiave è giocato da U7 snRNP, una scarsa abbondanza complesso composto da U7 snRNA di ~ 60 nucleotidi e più proteine2,3 . Le coppie di basi U7 snRNA con specifiche sequenze di istone pre-mRNA e uno delle subunità della snRNP U7 catalizza la reazione di scissione, generando maturo istone mRNA senza un poli (a) coda. 3' terminare l'elaborazione di istone pre-mRNA richiede anche gambo-ciclo Binding Protein (SLBP), che associa un gambo-ciclo conservato situato a Monte del sito di clivaggio e migliora l'assunzione delle snRNP U7 al substrato2,3. Gli studi finalizzati ad individuare i singoli componenti delle snRNP U7 sono stati impegnativi a causa della bassa concentrazione delle snRNP U7 in cellule animali e la tendenza del complesso di dissociare o subiscono parziale proteolisi durante la purificazione come conseguenza dell'utilizzo detergenti delicati4,5,6, lavaggi sale alte e/o più passaggi cromatografici7,8,9.
Recentemente, per determinare la composizione dell'apparato di elaborazione U7-dipendente, un breve frammento di biotina contenenti pre-mRNA di istone 3' o 5' è stato incubato con un estratto nucleare e i complessi montati sono stati catturati su rivestite con streptavidina agarosio perline5,6,10. A causa di eccezionalmente forte interazione biotina streptavidina, proteine immobilizzate su streptavidina perline sono stati eluiti sotto condizioni di denaturazione bollendo in SDS e analizzati dalla macchiatura d'argento e spettrometria di massa. Mentre questo approccio semplice ha individuato una serie di componenti delle snRNP U7, ha reso relativamente grezzi campioni, spesso contaminati con un gran numero di proteine sfondo non specifico associato a perle di streptavidina, potenzialmente mascherare alcuni componenti di i macchinari di lavorazione e prevenire la loro rilevazione su argento macchiato gel5,6,10. D'importanza, questo approccio anche precluso qualsiasi studi funzionali con il materiale isolato e suo ulteriore purificazione per omogeneità di metodi aggiuntivi.
Sono state proposte una serie di modifiche nel tempo per affrontare la natura praticamente irreversibile dell'interazione biotina/streptavidina, con la maggior parte di loro essendo progettato per indebolire o l'interazione o per fornire un braccio spaziatore chimicamente spaccabili nella biotina-contenere i reagenti11,12. L'inconveniente di tutte queste modifiche era che riducono in modo significativo l'efficienza del metodo e/o condizioni di non-fisiologica spesso richieste durante la fase di eluizione, compromettere l'integrità o la attività delle proteine purificate.
Qui, descriviamo un approccio diverso per risolvere il problema inerente della strategia di biotina/streptavidina utilizzando RNA substrati in cui la biotina è covalente al 5' estremità tramite una foto-spaccabili 1-(2-nitrofenil) frazione etilico che è sensibile alla lunghezza d'onda UV13,14. Abbiamo testato questo approccio per la purificazione dell'apparato di elaborazione limitante U7-dipendente dalla drosofila e mammiferi nucleari estratti15. Dopo una breve incubazione di biotina contenenti pre-mRNA di istone e il linker foto-spaccabili con un estratto nucleare, i complessi di elaborazione assemblati sono immobilizzati su perle di streptavidina, lavati accuratamente e delicatamente rilasciati alla soluzione in un nativo forma di esposizione a ~ 360 nm UV luce. Il metodo UV-eluizione è molto efficiente, veloce e semplice, producendo una quantità sufficiente delle snRNP U7 per visualizzare i componenti di scheggia colorazione da appena 100 µ l di Estratto di15. Il materiale UV-eluito è privo di proteine sfondo e adatto per analisi di spettrometria di massa diretto, fasi di purificazione supplementare e saggi enzimatici. Lo stesso metodo può essere adottato per la purificazione di altri complessi di RNA/proteine che richiedono relativamente brevi siti di legame di RNA. Biotina e il linker foto-spaccabili può anche essere in covalenza collegati al singolo - e double-stranded DNA, potenzialmente estendendo il metodo UV-eluizione per la depurazione di vari complessi di DNA/protein.
Sintesi chimica di substrati di RNA contenenti covalenza collegato biotina e il linker foto-spaccabili è pratico solo con le sequenze che non superano i nucleotidi ~ 65, diventando costoso e inefficiente per sequenze significativamente più lungo. Per risolvere questo problema, abbiamo anche sviluppato un metodo alternativo che è adatto per molto più tempo obiettivi vincolanti di RNA. In questo approccio, RNA di qualsiasi sequenza del nucleotide e lunghezza è generato in vitro di T7 e SP6 la trascrizione e ricotto per un breve oligonucleotide complementare che contiene biotina e il linker foto-spaccabili all'estremità 5' (trans configurazione). Il duplex risultante viene successivamente utilizzato per purificare proteine leganti singoli o complessi macromolecolari su streptavidina perline seguendo lo stesso protocollo descritto per i substrati di RNA contenenti foto-spaccabili biotina associata covalentemente (cis configurazione). Con questa modifica, la biotina foto-spaccabili utilizzabile in combinazione con le trascrizioni in vitro generato contenente centinaia di nucleotidi, estendendo il metodo UV-eluizione per la purificazione di una vasta gamma di RNA/proteine.
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Protocol
1. preparazione del substrato
Nota: Substrati RNA inferiore a ~ 65 nucleotidi possono essere sintetizzati chimicamente con biotina (B) e il linker di foto-spaccabili (pc) (insieme denominati foto-spaccabili biotina o pcB) legame covalente all'estremità 5' RNA (configurazionecis ). Substrati di RNA contenenti siti di legame significativamente più lunghi devono essere generati in vitro da T7 (o SP6) trascrizione e successivamente ricotto per un oligonucleotide di breve adattatore complementare contenente parte di pcB all'estremità 5' (trans configurazione) (Figura 1).
- Per siti di legame costituito da meno di ~ 65 nucleotidi, utilizzare un fornitore commerciale (Tabella materiali) per sintetizzare chimicamente il RNA di interesse con pcB covalenza collegato all'estremità 5' RNA (Figura 1A e Figura 2A). Sciogliere in acqua sterile per ottenere la concentrazione desiderata e memorizzare in piccole aliquote a-80 ° C.
- Per i siti di legame significativamente più a lungo ~ 65 nucleotidi, forma un duplex parziale di un in vitro generato RNA di interesse e un oligonucleotide complementare adattatore contenente la frazione di pcB all'estremità 5' (Figura 3A).
- Eseguire T7 trascrizione su un DNA del plasmide linearizzato o un appropriato modello PCR per generare RNA con il sito di legame di interesse esteso all'estremità 3' da una sequenza arbitraria di ~ 20-nucleotide.
- Utilizzare un fornitore commerciale (Tabella materiali) per sintetizzare chimicamente un oligonucleotide di adattatore che è complementare all'estensione 3' nel RNA T7-generato e contiene pcB all'estremità 5' (Figura 3A).
Nota: Due distanziali 18-atomo e nucleotidi non complementari 2-3 possono trovarsi all'estremità 5' dell'oligonucleotide per ridurre potenziale sterico fra il complesso associato e streptavidina perline. È anche auspicabile che il oligonucleotide è uniformemente modificato con un 2' O-metil gruppo per aumentare la resistenza del duplex e per fornire la resistenza contro vari nucleasi. - Temprare il RNA T7-generato il oligonucleotide adattatore pcB.
- Mix 20 pmol del RNA e 100 pmol dell'oligonucleotide adattatore pcB (rapporto molare 1:5) in un 1,5 mL tubo contenente 100 µ l di tampone di associazione con la seguente composizione: 75 mM KCl, pH di 15 mM HEPES 7.9, 15% glicerolo, acido etilendiamminotetracetico 10mm (ed).
Nota: È importante utilizzare una quantità minima dell'oligonucleotide adattatore che sia sufficiente a formare un duplex con la maggior parte (se non tutti) substrato pre-mRNA utilizzato nella reazione di ricottura. Questo potrebbe essere convenientemente determinato dall'etichettatura RNA substrato all'estremità 5' con 32P, ricottura del substrato con etichettato con quantità crescenti dell'adattatore del oligonucleotide utilizzando vari buffer condizioni e monitoraggio la ritenzione della segnale radioattivo su streptavidina perline dopo diversi lavaggi delle perline con il buffer di associazione. - Posizionare il tubo in acqua bollente per 5 min.
- Lasciare che l'acqua si raffreddi a temperatura ambiente.
- Mix 20 pmol del RNA e 100 pmol dell'oligonucleotide adattatore pcB (rapporto molare 1:5) in un 1,5 mL tubo contenente 100 µ l di tampone di associazione con la seguente composizione: 75 mM KCl, pH di 15 mM HEPES 7.9, 15% glicerolo, acido etilendiamminotetracetico 10mm (ed).
2. complesso assemblaggio
- Supplemento 1 mL di un estratto nucleare del mouse (o un altro estratto di scelta) con pH di EDTA 80 mM 8 a una concentrazione finale di 10 mM per bloccare aspecifiche nucleasi di metallo-dipendenti che sono presenti nell'estratto.
Nota: Questo si tradurrà in buffer nell'estratto per la stessa composizione che nel buffer di associazione di regolazione (Vedi punto 1.2.3.1). EDTA non influenza in vitro l'elaborazione di istone pre-mRNA, ma può essere dannoso nel purificare proteine o complessi della proteina che assemblare in modo magnesio-dipendente. In questi casi, EDTA dovrebbe essere evitato. - Aggiungere 5-10 pmol di RNA substrato taggato con la frazione di pcB in cis (vedi passaggio 1.1) o trans (Vedi punto 1.2.3.3) a 1 mL di estratto contenente da 10 mM EDTA.
Nota: La quantità di RNA deve essere attentamente valutati in una serie di esperimenti di prova. Usando troppo RNA substrato per la purificazione di un complesso limitano forse controproducente, aumentando significativamente sullo sfondo delle proteine di legame aspecifici RNA senza avere alcun effetto sulla resa di proteine specifiche. - Incubare il RNA substrato con l'estratto per 5 minuti sul ghiaccio, mescolando occasionalmente il campione.
Nota: Sia il tempo e la temperatura di incubazione devono essere stabiliti empiricamente e possono variare sensibilmente, a seconda della natura specifica del complesso RNA/proteine. - Girare la miscela di incubazione in una microcentrifuga pre-raffreddata per 10 min a 10.000 x g per rimuovere qualsiasi potenziale precipitati e accuratamente raccogliere il surnatante evitando trasferendo il pellet.
3. immobilizzazione dei complessi RNA/proteine streptavidina perline.
- ~ 100 µ l della sospensione di streptavidina agarosio perlina di trasferimento da un fornitore commerciale (Tabella materiali) in una provetta da 1,5 mL e aumentare il volume con il buffer di associazione (75 mM KCl, pH di 15 mM HEPES 7.9, 15% glicerolo, 10mm EDTA).
Nota: Questo buffer dovrebbe avere la stessa composizione che nella miscela di ricottura e nell'estratto utilizzato per assemblaggio complesso (punto 2.1). - Raccogliere le perle nella parte inferiore del tubo di filatura per 2-3 min a 25 x g e aspirare il supernatante.
- Ripetere la stessa procedura di lavaggio/spinning 2 - 3 volte per equilibrare le perline con il buffer di associazione.
Nota: Al termine di questo passaggio, il pellet di perline dovrebbe avere un volume di ~ 30 µ l. - Caricare il supernatante contenente il complesso assemblato (punto 2.4) sopra le perline di agarosio streptavidina equilibrato.
- Ruotare di 1 h a 4 ° C per immobilizzare RNA e i complessi associati le perline.
- Raccogliere le perle nella parte inferiore del tubo di filatura per 2-3 min a 25 x g.
Nota: Utilizzare un'oscillazione il rotore principale per evitare perdita sostanziale di perline se tendono ad aderire al lato del tubo in rotori angolari. - Aspirare il supernatante e sciacquare le perle due volte con 1 mL di buffer di associazione, utilizzando le stesse condizioni di centrifugazione.
- Aggiungere 1 mL di buffer di associazione e ruotare il campione 1 h a 4 ° C.
Nota: Questo passaggio può essere abbreviato se il complesso formato sul substrato tende a dissociarsi. - Rotazione verso il basso le perle per 2-3 min a 25 x g, aggiungere 1 mL di tampone e trasferire la sospensione ad un nuovo tubo.
- Ruotare per un ulteriore 1 h o più breve, se il complesso non è stabile, rotazione verso il basso per 2-3 min a 25 x g e trasferire le perle in una provetta di 500 µ l a 200 µ l di tampone di associazione.
4. UV-eluizione.
- Accendere una lampada UV che emettono luce UV di 365 nm per 5-10 minuti prima di raggiungere la piena brillantezza ad alta intensità.
Nota: Questo è essenziale per ottenere la massima energia di emissione UV all'inizio di irradiazione. - Riempire il fondo di un piatto di Petri (100 x 15 mm) con ghiaccio strettamente imballata e capovolgerla coperchio del piatto.
- Brevemente vortice nella provetta contenente il complesso immobilizzato, posizionarlo orizzontalmente sul ghiaccio e copertura con la lampada pre-riscaldata, assicurando che il campione si trova entro la distanza di 2-3 cm della superficie del bulbo.
Nota: Se la distanza è troppo grande, utilizzare ulteriori piastre di Petri o altri oggetti adatti per portare il campione più vicino al bulbo. - Irradiare per un totale di 30 min, frequentemente invertendo e Vortex il tubo per garantire un'esposizione uniforme della sospensione ai raggi UV e per evitare il surriscaldamento.
Nota: Per fornire raffreddamento addizionale, il passaggio di UV-eluizione può avvenire in una stanza fredda. Passare a una capsula di Petri con ghiaccio fresco in caso di fusione del ghiaccio eccessivo. - Rotazione verso il basso le perle per 2-3 min a 25 x g e raccogliere il surnatante.
- Re-spin il supernatante utilizzando le stesse condizioni e raccogliere il surnatante.
Nota: Lasciare una piccola quantità di surnatante nella parte inferiore per evitare di trasferire il residui perline.
5. esempio analisi dalla macchiatura d'argento seguita da spettrometria di massa.
- Elettroforesi del gel di SDS/poliacrilammide di uso per separare una frazione del surnatante eluiti UV e la frazione stessa del materiale lasciato le perline seguendo eluizione UV.
Nota: L'analisi può anche includere un'aliquota dei branelli ritirati dal campione prima UV-eluizione. - Macchia il gel contenente proteine separate utilizzando un argento disponibile in commercio kit di colorazione.
- Valutare l'efficienza di UV-eluizione confrontando le intensità delle proteine presenti nel surnatante UV-eluiti e quelli lasciati sui branelli dopo irradiazione UV.
- Asportare le fasce della proteina di interesse e determinare la loro identità tramite spettrometria di massa utilizzando protocolli standard10,15.
6. globale analisi del campione eluito UV mediante spettrometria di massa.
- Analizzare direttamente una frazione del surnatante UV-eluita mediante spettrometria di massa per determinare l'intero proteoma del materiale purificato in modo imparziale.
Nota: Questo può essere fatto di solubilizzazione dei campioni purificati con tripsina seguita da protocolli standard spettrometria di massa per determinare l'identità del genera peptidi10,15.
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Representative Results
Il metodo UV-eluizione è stato testato con due substrati di RNA sintetizzati chimicamente legate covalentemente all'estremità 5' ad il pcB (configurazionecis ): pcB-SL (Figura 1) e pcB-dH3/5m RNAs (Figura 2). Il 31-nucleotide pcB-SL RNA contiene una struttura di gambo-ciclo seguita da una coda di filamento singola 5-nucleotide e la sua sequenza è identica all'estremità 3' dell'istone maturo mRNA (cioè., dopo la scissione dell'istone pre-mRNA di snRNP U7). Questa sequenza univoca è un sito di legame noto per due proteine presentano nella frazione citoplasmatica dei mammiferi: SLBP e 3' hExo16,17,18. pcB-dH3/5m è un frammento di 63-nucleotide di Drosophila H3 istone pre-mRNA e oltre il gambo-ciclo contiene una sequenza che lega Drosophila U7 snRNP (Figura 2).
dH3 Ext (125 nucleotidi) è un esempio di più substrati di RNA che possono essere generati da T7 trascrizione e fornito con biotina e un distanziatore di foto-spaccabili in trans da ricottura di pcB/22mer, un oligonucleotide sintetizzato chimicamente adattatore ( Trans configurazione). pcB/22mer contiene due gruppi all'estremità 5' e si compone di 22 2' O-metil-modifed nucleotidi (Figura 3A). 19 nucleotidi all'estremità 3' del pcB/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) sono complementari alle ultime 19 nucleotidi del pre-mRNA dH3 Ext. Questo pre-mRNA oltre ad essere più a lungo non differisce significativamente dal sintetica pcB-dH3/5m, contenente gli stessi due chiave elaborazione segnali: gambo-ciclo e U7-associazione sito.
pcB-SL RNA è stato incubato con 1 mL di Estratto S100 preparato dall'ultracentrifugazione (100.000 x g per 1 h) di una frazione citoplasmatica ottenuta da mouse mieloma cellule19 e l'effetto e l'efficienza di UV-eluizione in primo luogo sono stati analizzati dalla macchiatura d'argento. Un numero di proteine sono stato rilevato su streptavidina perline prima UV-eluizione (Figura 1B, corsia 1). L'irradiazione con raggi UV rilasciato solo alcune di queste proteine al supernatante (Figura 1B, lane 3), lasciando uno sfondo non specifico sui branelli (Figura 1B, lane 2), quindi sottolineando l'importanza del passaggio UV-eluizione. Principali proteine eluite UV sono state identificate mediante spettrometria di massa come 3' hExo e SLBP, con SLBP essendo rappresentato dalla proteina integrale (FL) e un numero di prodotti di degradazione più corti (DP). Piccole quantità di altre proteine, identificati come varie proteine leganti di RNA (RBPs), sono state rilasciate anche selettivamente alla soluzione di irradiazione UV (Figura 1B, lane 3).
pcB-dH3/5m pre-mRNA (Figura 2) o Ext dH3 pre-mRNA ricotto per pcB/22mer (Figura 3) sono state incubate con 1 mL di un estratto nucleare dalla drosofila Kc cellule a forma di elaborazione complessi20,21. Per meglio valutare la specificità delle proteine che si legano a ogni istone pre-mRNA, un controllo negativo è stato preparato in parallelo con l'aggiunta di Estratto di due concorrenti al nucleare: RNA SL che sequestra SLBP e un breve oligonucleotide antisenso che coppie con di base la U7 snRNA e impedisce l'interazione tra le snRNP U7 con il suo sito sul pre-mRNA.
Il passaggio di UV-eluizione del pre-mRNA immobilizzato pcB-dH3 / 5m ha provocato un rilascio selettivo di solo un piccolo numero di proteine al supernatante (Figura 2B, corsia 1), con un fondo intenso delle proteine non specifiche restanti sui branelli (Figura 2B , vicolo 3). Queste proteine, con l'etichetta A-io, fossi identificati mediante spettrometria di massa come componenti dell'U7 snRNP15. Il campione contenuto anche parzialmente degradato SLBP che migra al 10 kDa e può solo essere visibile il più alta concentrazione di che gel di poliacrilammide/SDS. Tutte queste proteine non sono state rilevate in presenza i due concorrenti di elaborazione che bloccano il legame della snRNP U7 istone pre-mRNA (Figura 2B, lane 2).
Gli stessi componenti della drosofila U7 snRNP sono stati rilasciati alla soluzione di irradiazione UV di un immobilizzato duplex composto dH3 Ext pre-mRNA e pcB/22mer (Figura 3B, corsia 1). In questo esempio, inoltre, contenuti più proteine che legano RNA che ha interagito con il oligonucleotide pcB/22mer utilizzato in eccesso per formare un duplex con dH3 Ext pre-mRNA. In contrasto con le subunità della U7 snRNP, queste proteine contaminanti, come pure tutte le proteine di sfondo che è rimasto sui branelli, ha persistito in presenza dei concorrenti di elaborazione (Figura 3B, confronta le corsie 1 e 2 e corsie 3 e 4).
Una piccola frazione dei complessi UV-supernatante contenente l'elaborazione e la stessa frazione del UV-surnatante da un controllo negativo (preparato in presenza i oligonucleotides di due concorrenti e quindi carente elaborazione complessi) possono essere direttamente analizzati mediante spettrometria di massa senza una preventiva separazione delle proteine eluite tramite elettroforesi su gel15. Questo metodo è molto sensibile nel rilevare tutte le proteine eluite indipendentemente dalle loro dimensioni e abbondanza e in combinazione con il campione negativo fornisce una lista completa e imparziale delle proteine che associano specificamente istone pre-mRNA di condurre estremità 3' reazione di elaborazione.
Figura 1: purificazione di proteine citoplasmatiche del mouse associato a pcB-SL RNA. (A) A diagramma di chimicamente sintetizzato pcB-SL RNA (31-nucleotidi). Biotina (Biot) all'estremità 5' è seguita da una frazione foto-spaccabili (pc) sensibile alla lunghezza d'onda UV (366 nm), due 18 atomo distanziali e 31 nucleotidi che formano la struttura conservata gambo-ciclo trovata all'estremità 3' del mRNA maturo dell'istone. (B) pcB-SL RNA è stato incubato con S100 citoplasmico Estratto da cellule di mieloma di topo. Il RNA e proteine rilegate sono state purificate su perle di streptavidina, ampiamente lavati, UV eluiti e analizzati dalla macchiatura (corsia 3) d'argento. Proteine immobilizzate su streptavidina perline prima eluizione UV e lasciato le perline dopo eluizione UV sono riportati nelle corsie 1 e 2, rispettivamente. Posizione di proteine marker di dimensione (in kDa) è indicata a sinistra.
Figura 2: Purificazione di complessi da trasformazione di Drosophila montato su pcB-dH3/5m pre-mRNA. (A) sintetizzato chimicamente un diagramma della drosofila-pcB-dH3/5m specifico pre-mRNA (63-nucleotidi). Biotina (Biot) all'estremità 5' è seguita da una foto-spaccabili frazione (pc), due distanziali 18-atomo e 63 nucleotidi che contengono il trattamento essenziale di sequenza di due elementi: struttura del gambo-ciclo e U7-associazione sito. Cinque nucleotidi intorno al sito di clivaggio principali situato tra i due elementi vengono modificati con un 2' O-metil gruppo per bloccare il clivaggio delle snRNP U7 durante l'assemblaggio di complesso (linee incrociate). (B) pcB-dH3/5m è stato incubato con un estratto nucleare di Drosophila per assemblare complessi da trasformazione. Nel controllo negativo, l'estratto nucleare contiene due concorrenti di elaborazione per bloccare l'associazione di SLBP e U7 snRNP istone pre-mRNA. I complessi montati sono stati immobilizzati su perle di streptavidina, ampiamente lavati e rilasciati alla soluzione tramite l'esposizione del campione a onda lunga UV. Le frazioni stesse del materiale eluito UV (UV-sup) e le perline seguendo UV-eluizione (UV-perline) sono state analizzate dalla macchiatura d'argento. Posizione di proteine marker di dimensione (in kDa) e streptavidina (SA) è indicata a destra.
Figura 3: Purificazione di Drosophila elaborazione complessi montati su dH3 Ext pre-mRNA attaccato al gruppo foto-spaccabili in trans. (A) A diagramma del duplex Ext dH3 generati da ricottura T7-generato dH3 Ext pre-mRNA e oligonucleotidi sintetizzati chimicamente pcB/22mer con la seguente sequenza: 5' Biot/pc/18S/18S/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. Nel oligonucleotide, biotina (Biot) è posta all'estremità 5' ed è seguita dal linker foto-spaccabili (pc). Le ultime 19 nucleotidi (sottolineati nella sequenza di cui sopra) sono complementari per l'estensione 3' aggiunta a dH3 Ext pre-mRNA. La presenza di 2' modifiche O-metilica (non indicate nella figura) serve a due scopi: stabilizza il oligonucleotide contro Estratto nucleasi e aumenta la forza del duplex formato con l'Ext dH3 pre-mRNA. (B) dH3 Ext duplex è stato incubato con una drosofila Kc nucleare Estratto in assenza o in presenza di concorrenti, immobilizzati su perle di streptavidina, ampiamente lavati e UV-eluiti con le proteine rilegate di elaborazione. Le stesse frazioni del materiale eluito UV (UV-sup, corsie 1 e 2) e le perline seguendo UV-eluizione (UV-perline, vicoli 3 e 4) sono state analizzate dalla macchiatura d'argento. Componenst specifici di elaborazione complessi (quelli che vengono eliminati dai concorrenti di elaborazione) sono indicate con alle lettere F. Proteine che legano RNA principali non specifici (quelli che sono eluiti UV ma persistono in presenza di due concorrenti di elaborazione) sono contrassegnati con un asterisco. Posizione di proteine marker di dimensione (in kDa) è indicata a destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo qui descritto è semplice e oltre che incorporano un foto-spaccabili linker e il passaggio di UV-eluizione non differisce dai metodi comunemente usati che sfruttano estremamente forte interazione biotina streptavidina. Il passaggio di UV-eluizione è molto efficiente, rilasciando in genere oltre il 75% del RNA immobilizzato e proteine da streptavidina perline, lasciando dietro di sé un elevato background di proteine che legano non specificamente ai talloni associate. Eliminando questo sfondo, il passo di UV-eluizione rendimenti notevolmente puri campioni per l'analisi diretta di macchiatura d'argento, spettrometria di massa e saggi funzionali.
Come risultato che coinvolge relativamente pochi e semplici passaggi, il metodo UV-eluizione è altamente riproducibile, fornendo una quantità sufficiente delle snRNP U7 per la macchiatura d'argento da appena 100 µ l di mouse e Drosophila nucleare estratti15. Il metodo è una valida alternativa ad altre strategie sperimentali precedentemente utilizzato per purificare complessi RNA/proteine, tra cui tagging substrati di RNA con un sito di legame di MS2 e immobilizzare complessi associati su perle di amilosio tramite una fusione di MS2-MBP proteina. La strategia di MS2, mentre successo nell'isolazione spliceosomes relativamente abbondanti e canoniche 3' fine elaborazione complessi22,23, non è riuscito a produrre una quantità sufficiente di elaborazione complessi contenenti U7 snRNP (ZD, inedito Risultati), che è circa 100 volte meno concentrato in cellule animali rispetto le principali snRNP spliceosomal U1.
Molti aspetti del protocollo devono essere modificati per soddisfare diversi obiettivi di ricerca individuale e di produrre risultati ottimali con altri complessi RNA/proteine. In primo luogo, è importante far corrispondere la quantità di RNA substrato utilizzato per l'assemblaggio di complesso con l'importo di questo complesso che esiste nell'estratto. Per limitare complessi, tra cui U7 snRNP, usando troppo substrato è controproducente, aumentando solo sullo sfondo delle proteine di legame al RNA aspecifici nel surnatante-UV. In secondo luogo, è anche importante ottimizzare la lunghezza e la temperatura di incubazione di promuovere l'Assemblea vigoroso del complesso, impedendo allo stesso tempo la sua dissociazione a causa di potenziali proteolisi o eccessiva degradazione del RNA.
È una chiave difficilmente in collaborazione con i complessi da trasformazione U7-dipendente e simili complessi RNA/proteine che trasportano le attività enzimatiche che dopo essendo completamente assemblato si possono dissociare a seguito di catalisi. Clivaggio di istone pre-mRNA avviene rapidamente anche a basse temperature, riducendo in modo significativo il rendimento dei complessi elaborazione purificata. Per evitare questo effetto indesiderato, il sito di clivaggio principali e quattro nucleotidi nelle vicinanze di pcB-dH3/5m pre-mRNA sono stati modificati durante la sintesi chimica con 2' O-metilica gruppi (5m)10. Questo pre-mRNA è quasi completamente resistente alla fenditura di snRNP U7 e possa essere incubato con un estratto nucleare a temperatura ambiente per 60 min senza causare disturbo complesso rilevabile. La T7-generato dH3 che EXT ricotto per pcB/22mer manca di queste modifiche e sua incubazione con un estratto nucleare avviene sul ghiaccio per 5 minuti o più breve per limitare la catalisi. pcB-SL RNA contiene maturo 3' estremità dell'istone mRNA e negli estratti citoplasmatici non subisce alcun trattamento di aggiunta. 3' hExo, che è magnesio-dipendente 3' - 5' esonucleasi è in grado di rimuovere 2-3 nucleotidi della singola coda incagliato in vivo24,25 ma in vitro che l'attività è inibita dalla presenza di EDTA16. Di conseguenza, pcB-SL RNA possono essere incubati in estratti citoplasmatici a temperatura ambiente per un tempo prolungato senza effetti negativi, anche se in genere è sufficiente per formare un complesso ternario del RNA con SLBP e 3' hExo una breve incubazione in ghiaccio.
Delle due varianti alternative del metodo UV-eluizione, utilizzando substrati di RNA con biotina e il linker foto-spaccabili in cis (legame covalente all'estremità 5' del RNA) nel complesso è più semplice e produce campioni relativamente puri. Una limitazione importante di questo approccio è che i due gruppi possono essere collegati in modo covalente a substrati di RNA non superiore a ~ 65 nucleotidi. Più obiettivi vincolanti di RNA possono essere collegati nella frazione di pcB in trans tramite un oligonucleotide di adattatore. Tuttavia, questo approccio può produrre sfondo superiore di proteine non specifiche che tendono ad associare l'eccesso dell'oligonucleotide adattatore. Pertanto è importante utilizzare solo un minimo eccesso molare dell'oligonucleotide sufficiente per legare tutto il substrato pre-mRNA usato nell'esperimento.
La natura di sequenza, lunghezza e chimica degli oligonucleotidi adattatore possa essere variata per migliorare la loro capacità di coppia con le sequenze complementari nei substrati di RNA, di base, riducendo la loro capacità di interagire con proteine che legano RNA non specifici. Infine, più substrati pre-mRNA duplexing con oligonucleotidi adattatore possono essere immobilizzati su streptavidina perline prima di essere utilizzati per la formazione del complesso. Uno dei vantaggi di questo approccio di pre-selezione è che elimina dalle molecole di RNA di esempio che non è riuscito a tempri il oligonucleotide. Queste molecole mantengono una normale capacità di assemblare in un complesso nell'estratto ma sono in grado di associare perle di streptavidina, parzialmente riducendo la resa di purificazione.
Oltre a purificare complessi montati su substrati di single-stranded RNA, il metodo UV-eluizione in un simile modo utilizzabile per purificare proteine o complessi di proteine che legano sequenze di DNA singolo - e double-stranded.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Ringraziamo i nostri colleghi e collaboratori per il loro contributo al nostro lavoro. Questo studio è stato sostenuto dal NIH concedere GM 29832.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
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