Single-step purificazione di complessi macromolecolari usando RNA attaccato alla biotina e un Linker foto-spaccabili

Summary

Complessi RNA/proteici purificati mediante botin-streptavidina strategia sono eluiti per soluzione in condizioni denaturanti in forma inadatta per ulteriore purificazione e analisi funzionale. Qui, descriviamo una modifica di questa strategia che utilizza un linker foto-spaccabili in RNA e un delicato passaggio di UV-eluizione, producendo complessi RNA/proteine native e completamente funzionale.

Abstract

Per molti anni, eccezionalmente forte e rapidamente formato interazione biotina streptavidina è stata utilizzata con successo per purificazione parziale dei complessi RNA/proteine biologicamente importanti. Tuttavia, questa strategia soffre di uno dei principali svantaggi che limita il suo utilizzo più ampio: l'interazione biotina/streptavidina può essere rotto solo sotto denaturare condizioni che anche compromettere l'integrità dei complessi eluiti, quindi precludendo loro successive analisi funzionale e/o ulteriore purificazione da altri metodi. Inoltre, i campioni eluiti sono spesso contaminati con le proteine di sfondo che non specifico associano con streptavidina perline, che complica l'analisi dei complessi purificati dalla macchiatura d'argento e spettrometria di massa. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una variante della biotina/streptavidina strategia in cui biotina è collegata a un RNA substrato tramite un linker foto-spaccabili e i complessi immobilizzati su streptavidina perline sono eluiti selettivamente alla soluzione in un formato nativo di onda lunga UV, lasciando le proteine di sfondo sui branelli. Substrati di associazione più breve RNA possono essere sintetizzati chimicamente con biotina e il linker foto-spaccabili legame covalente all'estremità 5' del RNA, mentre più substrati di RNA possono essere forniti con i due gruppi di un oligonucleotide complementare. Queste due varianti del metodo UV-eluizione sono state testate per la purificazione dei complessi elaborazione snRNP-dipendente U7 che fendono istone pre-mRNA all'estremità 3' e hanno entrambi dimostrato di reggono il confronto ad altri precedentemente sviluppato metodi di purificazione. I campioni eluiti UV contengono quantità molto facilmente rilevabile delle snRNP U7 che era esente dagli agenti inquinanti principali proteine e adatto per l'analisi diretta di spettrometria di massa e saggi funzionali. Il metodo descritto può essere prontamente adattato per la purificazione di altri complessi di associazione di RNA e utilizzato in combinazione con siti di legame del DNA singolo - e double-stranded per purificare proteine DNA-specifico e complessi macromolecolari.

Introduction

Negli eucarioti, precursori di RNA polimerasi II-generato mRNA (pre-mRNA) sottoporsi a diversi eventi di maturazione nel nucleo prima di diventare pienamente funzionali modelli di mRNA per la sintesi proteica nel citoplasma. Uno di questi eventi è di processamento dell'estremità 3'. Per la stragrande maggioranza dei pre-mRNA, 3' fine trattamento comporta clivaggio accoppiato di poliadenilazione. Questa reazione in due fasi è catalizzata da un complesso relativamente abbondante composto da più di 15 proteine¹. Animale replica-dipendente dell'istone pre-mRNA vengono elaborati all'estremità 3' da un meccanismo differente in cui il ruolo chiave è g....

Protocol

1. preparazione del substrato

Nota: Substrati RNA inferiore a ~ 65 nucleotidi possono essere sintetizzati chimicamente con biotina (B) e il linker di foto-spaccabili (pc) (insieme denominati foto-spaccabili biotina o pcB) legame covalente all'estremità 5' RNA (configurazionecis ). Substrati di RNA contenenti siti di legame significativamente più lunghi devono essere generati in vitro da T7 (o SP6) trascrizione e successivamente ricotto per un oligonucleotide di breve adattatore complementare contenente parte di pcB all'estremità 5' (trans configurazione) (Figura 1).

1. Per siti....

Results

Il metodo UV-eluizione è stato testato con due substrati di RNA sintetizzati chimicamente legate covalentemente all'estremità 5' ad il pcB (configurazionecis ): pcB-SL (Figura 1) e pcB-dH3/5m RNAs (Figura 2). Il 31-nucleotide pcB-SL RNA contiene una struttura di gambo-ciclo seguita da una coda di filamento singola 5-nucleotide e la sua sequenza è identica all'estremità 3' dell'istone maturo mRNA (cioè., dopo la .......

Discussion

Il metodo qui descritto è semplice e oltre che incorporano un foto-spaccabili linker e il passaggio di UV-eluizione non differisce dai metodi comunemente usati che sfruttano estremamente forte interazione biotina streptavidina. Il passaggio di UV-eluizione è molto efficiente, rilasciando in genere oltre il 75% del RNA immobilizzato e proteine da streptavidina perline, lasciando dietro di sé un elevato background di proteine che legano non specificamente ai talloni associate. Eliminando questo sfondo, il passo di UV-eluiz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptavidina-Agarosio	Sigma	S1638-5ML
Lampada UV ad alta intensità, a onde lunghe	Cole-Parmer	UX-97600-00
Lampadina di ricambio	Cole-Parmer	UX-97600-19	Lampadina da 100 Watt Mercury H44GS-100M che emette luce UV da 366 nm (Sylvania)
RNA e oligonucleotidi contenenti biotina e linker foto-scivabile in cis	Dharmacon (Lafayette, CO) o Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)		Richiedi un preventivo in Dharmacon
Beckman GH 3.8 rotore a secchiello oscillante	Beckman
RiboMAX Sistemi di produzione di RNA su larga scala (T7 polimerasi)	Promega	P1300
RiboMAX Sistemi di produzione di RNA su larga scala (SP6 polimerasi)	Promega	P1280
Pierce Silver Stain Kit	ThermoFisher Scientifico	24612