Summary
Burada, lökosit çıkış üzerinden saf, iltihaplı, vivo miktar ve malign fare cilt için yöntemleri gösterir. Biz iki model kafa kafaya bir karşılaştırma gerçekleştirir: transdermal FITC uygulama ve in situ photoconversion. Ayrıca, lökosit çıkış kutanöz tümörler izlemek için photoconversion yardımcı programı göstermektedir.
Abstract
Periferik dokulara gelen lökosit çıkış drenaj lenf düğümleri için sadece immün gözetim ve başlatma için kritik değil ama ayrıca periferik doku yanıt olarak çözümlenmesini katkıda bulunur. Çeşitli yöntemler kullanılır lökosit çıkış lenfoid sigara, periferik dokulara üzerinden ölçmek için içerik bağımlı çıkış yöneten hücresel ve moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. Burada, biz Nicel analiz lökosit çıkış fare deri ve tümörleri, in situ photoconversion nasıl kullanılacağını açıklar. Photoconversion doğrudan lökosit kutanöz doku içinde ikamet etiketleme için sağlar. Cilt ışığa maruz kalma menekşe yerel indükler rağmen inflamatuar yanıt lökosit infiltratlar ve floresan izleyiciler, transdermal uygulama ile kafa kafaya karşılaştırılması vasküler leakiness photoconversion özellikle ile karakterize göçmen dendritik hücre popülasyonlarının etiketli ve kutanöz microenvironments ve tümör myeloid ve lenfoid çıkış miktar aynı anda etkin. Lökosit çıkış mekanizmaları anlayışımız intratumoral lökosit karmaşıklık içinde eksik bir bileşeni olarak kalır ve böylece uygulama burada açıklanan araçları bağışıklık microenvironments tümör dinamikleri benzersiz bir anlayış sağlayacak Devlet ve tedaviye yanıt yükseliyor.
Introduction
Periferik doku bağışıklık yanıtı sadece sitelerine lökosit alımı iltihap tarafından aynı zamanda onların sonraki bekletme düzenleyen mekanizmalar tarafından şekillenir. Böylece, koruyucu bağışıklık kalır içinde ister bir lökosit girer, ya da daha doğrusu geçirir lenf damarları ile periferik doku dışında belirlemek toplu hücresel ve moleküler mekanizmaları tarafından dikte edilir. Önemlisi, doku (çıkış olarak adlandırdığı) lenf damarları ile çıkmak lökosit için eğilimi onların özel işlevlere bağlıdır. Dendritik hücreler (DC) yanıt olarak olgunlaşma sinyalleri antijen taşıma ve edinilmiş bağışıklığın1için gerekli olan bir işlemi lenf düğümleri (dLN), drenaj içinde tanıtımı için önde gelen göçmen davranış elde etmek. Makrofajlar ve nötrofiller, gibi atma myeloid hücrelerin apoptotik enkaz fagositoz ile temizlemek için hizmet vermektedir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında nötrofil doku çıkış ve sonuçta apoptosis dLNs2 ve kolit DSS kaynaklı bir model geçmesi, veri makrofaj çıkış yerel iltihap3gidermek için gerekli olan hipotezi destekler. Olup tüm inflamatuar bağlamlarda, nötrofil ve makrofaj çıkış oluşur ancak bilinmemektedir. Kanıt için T lenfosit çıkış kararlı duruma4,5,6,7, virüslü8ve iltihaplı4,9,10, 11,12 periferik, Sigara-lenfoid doku gösterir T hücreleri aktif olarak recirculate, bu çıkış sürücü doku tabanlı sinyalleri kötü anlaşılır kalır rağmen. Çeşitli çalışmalarda belirledik sinyalleri lenfatik kapiller boşaltma doğru yönlü geçiş için gerekli ve sonraki çıkış kemokin (C-C motifi) ligand de dahil olmak üzere 21 (CCL21) ve onun reseptör CCR74,11, 13, kemokin (C-X-C motifi) ligand 12 (CXCL12) ve reseptör CXCR42,14ve sphingosine-1-fosfat (S1P)10,15,16. Bu mekanizmalar tüm bağlamlarda etkin değildir ve olup tüm hücre tiplerinin çıkış belirlemek bir açık soru kalır. Önemlisi, daha fazla çıkış ve fonksiyonel önemini hastalığında yöneten mekanizmaları içgörü nicel vivo içinde analiz yöntemleri gerektirir.
Doğrudan cannulation lenf damarlarının, lökosit, etiketli ex vivo transdermal uygulama floresan izleyiciler, evlat edinen transferi dahil olmak üzere birden fazla hayvan modelleri vivo içinde çıkış ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır, Enjeksiyon etiketli parçacıklar ve in vivo photoconversion17,18. Afferent fare lenf damarları doğrudan cannulation zor ve küçük hayvanlarda sıvı toplanabilir birimler tarafından sınırlı. Böylece, cannulation büyük ölçüde büyük hayvanlarda yapılmıştır (Örn., koyun) gibi cerrahi işlemler nerede pratik. Bu çalışmalar lenf10,19,20lenfoid ve myeloid hücrelerin varlığı için doğrudan kanıt sağlar. Ayrıca, ovine modelleri akut ve kronik inflamasyon lenf lenfosit varlığı neredeyse 100-fold10,21tarafından artış ortaya koyuyor.
Etiketli ve genetik olarak işlenmiş lenfositlerin evlat edinen transfer, CCR7 CD4 çıkış için gerekli olduğunu da önemlisi koymuştur+ T hücreleri Akut iltihaplı cilt5,11, lenfositler ön süre S1P reseptör agonist küçük molekül ile FTY720, yalnızca kısmen onların çıkış10engeller. İlginçtir, kronik iltihaplı deri üzerinden transfer edilen lenfositlerin çıkış CCR7 bağımsız10, ama kısmen CXCR49gerektirebilir. Evlat edinen transfer deneyler, ancak, aktif ve etiketli lenfositler doku doku ve yükseltilmiş interstisyel sıvı basıncı biyomekanik ortamı değiştirir enjeksiyon ile içine ex vivo fizyolojik olmayan sayıda teslim Bu ilk lenfatik kapiller açın ve onların taşıma özellikleri22alter. Floresein isothiocyanate (FITC) varlığı veya yokluğu dermal tahriş edici bir alternatif, transdermal uygulama olarak (Örn., Dibutil ftalat, DBP) veya enfeksiyon23,24 için izleme sağlar İzleyici biriken ve dLNs için göç fagositik hücreler. Benzer şekilde, fluorescently etiketli tümör tümör malzeme25yuttu fagositik hücreleri izlemek için bir yol sağlar. Bu yöntemler DC çıkış13,14,17,26,27 yöneten ancak olmayan fagositik takip edemiyoruz mekanizmalarının içine önemli fikir vermiş lenfositler ve yorumu çözünür FITC LN ikamet DCs böylece göçmen olmayan-etiketleme ücretsiz lenfatik drenaj tarafından karmaşık.
Alternatif olarak, intravital mikroskobu vivo içinde izleme gerçek zamanlı28,29fizyolojik ilgili lökosit nüfusun sağlayan güçlü bir araçtır. Mikroskopi kompleks kayma ortaya koymuştur ile birlikte muhabir fareler ve antikor tabanlı vivo içinde immünfloresan etiketleme, intravital kullanılan ve ticareti, dahil interstisyel geçiş30 bağışıklık zamansal dinamiği hücre , hicret arasında lenfatik endotel, geçit lenfatik lümen ve geçiş sonucunda LN giriş28,31içinde. İntravital görüntüleme teknikleri geniş kabulü gider, kurmak, için gerekli uzmanlık ile sınırlıdır ve birden çok hücre tipleri miktarının için çıkışını sınırlı. Yine de, nüfus dinamikleri analiz nicel metodlar kaplin intravital görüntüleme kurcalayarak geçiş doğru ve lenfatik kapiller içinde ve hareket mekanizmaları ile ilgili olarak ek ve önemli mekanik kavrama sağlayacak 18 , 31 , 32.
Sonuç olarak, in vivo photoconversion in situ etiketleme için izin veren bir yöntem olarak fagositik aktivite ve (akış sitometresi ile birleştiğinde) fizyolojik lökosit çıkış miktar için bağımsız ortaya çıkmıştır Devamsızlık veya meydan okuma varlığı. Kaede-Tg fareler yapısal mor ışık, sonra geri dönüşümsüz kırmızı floresans (Kaede kırmızı)33' e dönüştürür maruz kadar yeşil floresan (Kaede yeşil) sergiler taşlı mercan dan izole bir protein hızlı. Photoconverted hücrelerin periferik doku sitelerden çıkış olarak izleniyor ve dLNs içinde birikir. Bu ve diğer benzer photoconvertible fare modelleri34,35 önemli biyoloji bünye çıkış düzenleyici T hücreleri cilt36, CXCR4 bağımlı B hücre çıkış Peyer's yamalar37 üzerinden de dahil olmak üzere indirdik , peptid yeniden meydan38ve geniş lökosit çıkış tümör microenvironments39üzerine sakin bellek T hücrelerinin seferberlik. Burada, kutanöz inflamasyon ve enfeksiyon varolan verileri doğrudan karşılaştırma için photoconvertible yöntemi ile izin bağlamında photoconversion transdermal FITC uygulama ile kafa kafaya karşılaştırılması gerçekleştiriyoruz. Ayrıca, implante tümörler photoconversion göstermek ve dönüşüm verimliliği ve tümör microenvironments üzerinden seçici çıkış açıklayın. Bu nedenle, biz daha fazla uygulama bu yöntemlerin lökosit çıkış intratumoral lökosit karmaşıklığı, anti-tümör dokunulmazlık, yorumlamak için önemli etkileri olacaktır tümörler üzerinden kritik biyoloji aydınlatmak için gerekli olduğunu iddia ve tedaviye yanıt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan iletişim kuralları kurumsal hayvan bakım ve kullanım komite toplantısında Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. indüksiyon iltihaplanma ve fare Pinna FITC resim
- Bir laminar akış başlık, buharlaşmış isofluorane kullanarak C57Bl/6 fare anestezi (% 3-5 isofluorane teşvik ve % 1-3 isofluorane at; korumak oksijen akış hızı 0.5-1.0'de L/dk). Pedal refleks kaybı izleyerek uygun anesthetization emin olmak istemsiz hareketler ve solunum indirimli.
- Ventral tarafı yukarı bakacak şekilde kulak ile düz bir kulak yatıyordu. Damlalıklı 20 µL % 5 FITC çözüm çözünmüş 1:1 aseton: Dibutil ftalat (DBP) kulak pinna ventral tarafına. Bir kaç saniyeliğine kurumaya kulak ver.
- 24 h FITC uygulama sonra ötenazi servikal çıkığı tarafından takip karbon dioksit pozlama ile fare. Kulak pinnae makas kullanarak başından kulakları ayırarak PBS toplamak. Servikal dLNs ve kasık sigara boşaltma LNs dokuları çevreleyen LNs ayırmak için cımbız kullanarak PBS içine toplamak. Kasık sigara boşaltma LNs FITC+/Kaede kırmızı+ lökosit varlığı için negatif denetimleri olarak görev yapacak. Kurumsal iletişim kuralı başına karkas atmayın.
Not: Uygun zaman yazı photoconversion analiz için hücre tipi ve bilinen göçmen davranışları üzerinde bağlıdır. Dendritik hücreler, örneğin, dLNs gibi erken 6 h mesaj DBP uygulama olarak tespit edilebilir.
2. indüksiyon iltihaplanma ve fare Pinna Photoconversion
- Bir laminar akış başlık, Kaede-Tg fare (arka plan C57Bl/6) 80 mg/kg ketamin ve salin çözünmüş 10 mg/kg xylazine mayi enjeksiyonla anestezi. Uygun anesthetization adım 1. 1'açıklandığı gibi olun.
- Ventral tarafı yukarı bakacak şekilde kulak ile düz bir kulak yatıyordu. Damlalıklı 20 µL bir 1:1 aseton: DBP kulak pinna ventral tarafına. Bir kaç saniyeliğine kurumaya kulak ver.
- DBP uygulama sonra bir yarık bir parça alüminyum folyo kesim ve kulak mor ışık kaynağına maruz slit kulağından çek. Kulak düz dorsal yüzü yukarı folyo kulağa güvenliğini sağlamak için çift taraflı bant kullanarak bakacak şekilde yatıyordu.
- Işık kaynağı ve photoconvert altında doğrudan kulak 3 dk 100 mW gücünde bir 405 nm ışık kaynağı kullanarak yerleştirin.
- 24 h photoconversion sonra Kaede-Tg fareler ötenazi ve kulak pinnae, servikal Ins ve kasık LNs adım 1. 3'açıklandığı gibi hasat.
Not: Kaede kırmızı kaybı hızla hücre bölünmesi ortaya çıkar gibi ek konuları adım 1. 3'gösterdi, nükleer silahların yayılmasına karşı oranları analiz zamanlama belirler.
3. vaksinia enfeksiyon fare Pinna ve FITC uygulama
- C57Bl/6 fare buharlaşmış isofluorane ile adım 1. 1'açıklandığı gibi anestezi.
- Kulak ventral tarafında düz yatıyordu. Damlalıklı 5 x 106 plak oluşturan birim (PFU) PBS 10 µL üzerine kulak pinna içinde seyreltilmiş vaksinia virüs (VacV). 29-gauge iğne kullanarak, pinna 25 kez40poke.
- 24 saat sonrası enfeksiyon, adım 1.1 ve damlalıklı 20 µL FITC çözünmüş aseton kulak teleklerinin ventral yan üzerine içinde %5 açıklandığı gibi isofluorane ile VacV-enfekte fareler anestezi. Bir kaç saniyeliğine kurumaya kulak ver.
- 24 h FITC uygulama sonra fareyi ötenazi ve adım 1. 3'açıklandığı gibi kulak pinnae, servikal Ins ve kasık LNs toplamak.
Not: FITC DC çeşitli 24 h aralıklarla kaçakçılığı belirlemek için herhangi bir zaman noktası sonrası enfeksiyon, uygulanabilir. Biz daha önce dLNs DC göç gün 1-3 sonrası enfeksiyon41benzer düzeyde korunur bildirdi.
4. vaksinia enfeksiyonu fare Pinna ve Photoconversion.
- Kaede-Tg fareyle buharlaşmış isofluorane adım 1. 1'açıklandığı gibi anestezi.
- Kulak pinna VacV ile adım 3.2 açıklandığı gibi bulaştırmak.
- 24 saat sonrası enfeksiyon, adım 2.1 içinde açıklandığı gibi VacV enfekte Kaede fareler anestezi ve photoconversion 2.3-2.4 adımlarda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
- 24 h photoconversion sonra fareyi ötenazi ve kulak pinnae, servikal Ins ve kasık LNs adım 1. 3'açıklandığı gibi hasat.
Not: adım 3.4 yukarıda belirtildiği gibi herhangi bir zaman noktası sonrası enfeksiyon photoconversion yönetilebilir.
5. kulak ve lenf nodu akış sitometresi için işleme
- Kulak pinnae tek hücre süspansiyonlar oluşturun: 1 mg/mL collagenase D ve içinde seyreltilmiş 80 U/mL DNaz içeren bir 24-şey plaka kuyu içine aşağı bakacak şekilde kulak içi ile iki çift cımbız ve yer kullanarak kulak teleklerinin tahliyeleri ve dorsal taraf ayrı soyma Hank tamponlu tuz çözüm ((Ca2 + ve Mg2 +içeren) HBSS). 30 dk. basın sindirilir doku 37 ° C'de 70 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla kuluçkaya.
- Tek hücre süspansiyonlar LNs oluşturun: LNs kuyu 1 mg/mL collagenase D ve HBSS içinde seyreltilmiş 80 U/mL DNaz içeren bir 24-şey tabak yerleştirin. Lenf nodu iki 29-gauge iğne kullanarak kapsül ve 30 dk. 37 ° C'de lenf düğümleri kuluçkaya tease aç'a basın sindirilir doku 70 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla.
6. intradermal Melanom tümör implantasyon ve Photoconversion.
- Bir Kaede-Tg fare tıraş kullanılarak arka ortasından kürk tıraş.
- 29-gauge iğne sol ve sağ üst scapulae arasında arka ortasına yerleştirin ve intradermally (50 µL serum içinde seyreltilmiş) 5 x 105 tümör hücreleri Kaede-Tg fareler deri içine enjekte. Tümörler (LNs tümör üst sırt ortasında yeryani, sol ve sağ brakiyal) belirtilen lenf düğümlerine lenf drenaj sağlamak için dikkatli bir şekilde konumlandırılmalıdır. Bu LNs cilt/tümör aracılığıyla doğrudan photoconversion, neden olabilir gibi tümör dLN yukarıda yerleştirmekten kaçının.
- Tümörler istenen boyuta (100-650 mm3) büyümeye izin.
- 2.1 içinde açıklandığı gibi bir Kaede-Tg fare bir gün önce doku koleksiyonu, anestezi ve tümör çevresinde herhangi bir yeni regrown kürk tıraş.
- Alüminyum folyo bir dairesel delik ve tümör tümör ışık kaynağına maruz çek. Delik biraz tümör tümör geri delikten düşmesini önlemek için daha küçük ve bitişik, Sigara-tümörün cilt dönüşüm en aza indirmek.
- Tümör hemen altında ışık kaynağı ve photoconvert 5 dk 200 mW gücünde bir 405 nm ışık kaynağı kullanarak yerleştirin.
- 24 h photoconversion sonra adım 1. 3'açıklandığı gibi farelerin ötenazi. Tümörler, brakiyal dLNs ve kasık sigara boşaltma LNs PBS toplamak. Tümör çevresindeki deri makas kullanarak uzak kesmek ve INS adım 1. 3'konusunda açıklanan şekilde kaldırın.
7. tümör ve lenf nodu akış sitometresi için işleme
- Tek hücre kullanılamaz hale tümör oluşturun: tümör makasla 1 mg/mL collagenase D ve HBSS içinde seyreltilmiş 80 U/mL DNaz içeren bir 24-şey plaka kuyu içine kıyma. 1 h. basın sindirilir doku için 37 ° C'de 70 µm naylon süzgeç aracılığıyla kuluçkaya.
- Tek hücre süspansiyon lenf nodlarının adım 5,2 açıklandığı gibi oluşturun.
8. antikor akış sitometresi için boyama
- Dokular tek hücre süspansiyonlar sindirerek sonra standart akış sitometresi boyama teknikleri hücreleri faiz işaretleyicilerle etiketlemek için gerçekleştirin. Kısaca, damlalıklı 2 x 106 hücrelere bir 96-şey plaka. Buz üzerinde 20 dk için Fc bloğu (1 µg/mL) ile örnekleri kuluçkaya; FACs arabellek (%1 sığır serum albümin PBS içinde) iki kez yıkayın. Canlı/ölü leke (PBS içinde seyreltilmiş) örnekleri için ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya; iki kez FACs arabellek ile yıkayın. Birincil antikorlar (Tablo reçetesi) FACs arabellek için buz üzerinde 30 dk içinde seyreltilmiş ile kuluçkaya; iki kez FACs arabellek ile yıkayın.
Not: Kaede yeşil ve kırmızı floresans FITC ve PE fluorophores ile çakışıyor Kaede; Böylece, FITC ve PE-Birleşik antikorlar Kaede proteinler ile birlikte kullanılamaz. - Boyama sonra örnekleri üzerinde bir akış sitometresi çalıştırın. Alternatif olarak, %2 ile hücreleri tamir PFA.
9. Akış Sitometresi Analizi
- FITC (Kaede yeşil) ve PE (Kaede kırmızı) Kanal toplam Aralık % 70-80 Devresel_ödeme gerilimleri ayarla (Merkezi nüfus yaklaşık 104) ex vivo Kaede yeşil veya kırmızı Kaede tek renkli splenocytes ya da kan kullanarak.
Not: Bu büyük sinyal yaymak yol açar gibi Kaede yeşil (FITC) ve Kaede kırmızı (PE) kanalları için telafi etmek değil.- Tek renkli Kaede denetimleri oluşturmak için bir Kaede-Tg fare--dan bir dalak veya kan toplama. Kırmızı kan hücreleri ile ACK arabellek parçalayıcı, sonra hücreleri iki gruba ayırın: Kaede yeşil ve dönüştürülmüş Kaede kırmızı din.
- Tek renk Kaede kırmızı denetimleri, askıya PBS 1 mL hücrelerde ve photoconvert 5 dk 100 gücünde bir 405 nm ışık kaynakları kullanarak bir 24-şey plaka mW. Bu hücreler Kaede yeşil (FITC) ve Kaede ayarlamak için kullanın kırmızı Devresel_ödeme gerilimleri akış sitometresi (adım 9.1) üzerinde.
- Kaede protein gerilimleri ayarladıktan sonra tek-fluorophore tazminat boncuk üretici yönergelerine başına etiketli kullanarak diğer tüm birincil antikor lekeler için telafi.
- Örnekleri verileri toplamak için bir akış sitometresi çalıştırın.
Not: Kaede protein sürekli hücreleri tarafından üretilmektedir. Bu o 24 h anlamına gelir photoconversion sonra dönüştürülmüş hücrelerin Kaede yeşil için çift olumlu olacak ve Kaede yeni sentezlenmiş Kaede (yeşil) kırmızı protein hücre içinde birikmiş. - FlowJo yazılım veya benzer bir yazılım kullanarak veri analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz ilk etkinliğini değerlendirmek ve fare cilt ilişkili iltihap belirlemek için literatürde yayınlandı photoconversion sonuçları çoğaltmak aranan. Kulak pinna 100 mW menekşe ışığa maruz (405 nm) 3 dk. daha önce33açıklandığı gibi için. Tek poz takip tüm CD45 %78 dönüşüm verimliliğini ortaya hemen kulak cilt veya servikal dLNs oluşturulan hücre süspansiyonlar+ lökosit cilt dönüştürülmüş hiçbir hücre ile gözlenen dLNs (Şekil 1A). Photoconversion ile ilişkili inflamatuvar yanıtı değerlendirmek için biz CD45 infiltre sayılar sayısal+ lökosit dönüştürülmüş kulakları 0 ve 24 h dönüşüm (Şekil 1B) ve sonrası akut değişiklikler vasküler geçirgenliği olarak ölçülen Mile'nın tahlil42 tarafından (Şekil 1 c). Kısaca, 200 µL % 0,5 Evans mavi oldu intravascularly 2 h photoconversion sonra enjekte. Formamide 24 h 55 ° c (610 nm42, okumak absorbans) ile enjeksiyon ve Evans mavi çıkarılan sonra kulakları 30 dk toplanmıştır. Her iki CD45+ infiltratlar (24 saat) ve vasküler sızıntı (2 h) anlamlı bir artış bile bu kısa maruz kalma, doku özgü inflamatuar yanıt photoconversion kendisini etkileme belirten photoconversion, takip. CD45 karşılaştırma+ infiltratlar (Şekil 1B) ve vasküler sızıntı (1.4 µg/kulak ±0.75) enfekte VacV kulakları 24 saat sonrası enfeksiyon41 yılında iltihap mor ışık (0,08 µg/kulak ± 0,01) tarafından neden olduğu ölçüde için bağlam sağlar.
Çeşitli modeller lökosit çıkış lenfoid sigara, çevre dokulardan izlemek için çeşitli çalışmalarda kullanılan iken, bu yöntemler cilt inerken belirli nüfus izlemek için yeteneklerini karşılaştırıldığında nasıl belli değil. Sonuç olarak, biz göçmenlik için DC çıkış izlemek için iki yaygın olarak kullanılan yöntem doğrudan kafa kafaya karşılaştırılması gerçekleştirmek karar FITC boya ve in vivo photoconversion değerlendirmek için her yöntemi özgüllük ve verimliliği için nicel DC çıkış kararlı duruma, kutanöz enflamasyon sırasında ve enfekte deri, analizi. Her çözümlemenin, cilt transdermal FITC uygulamaya tabi veya 3 dk. LN DC nüfusu CD3ε tanımlanan için 100 mW 405 nm ışığa maruz-CD19-MHCII+CD11c+ ve daha fazla 1 tabakalı) MHCIIMerhaba Hangi göçmen DCs (mDCs) her iki CD103 zenginleştiren CD11cint DCs,+ BATF3 bağlı çapraz sunma-DCs ve CD11b+ dermal DCs; ve 2) MHCIIintolan CD8α de dahil olmak üzere yerleşik DCs için (rDCs) zenginleştiren CD11cMerhaba DCs,+ BATF3 bağlı çapraz sunma-DCs (Şekil 2A). 24 h FITC uygulama veya photoconversion sonra etiketli hücreleri kolayca drene tespit ama değil boşaltılmasına INS (Şekil 2B). DC Göç Bürosu kapsamını ölçmek ve aynı anda geçirme nüfus ve değil ikamet LN nüfus etiketleme yöntemi özgüllük belirlemek için etiketli mDCs ve rDCs kararlı duruma, 24 h DBP uygulanması takip, sayısal, ve 48 h VacV yakici (Şekil 2C). Photoconversion (Kaede) ve FITC mDCs her koşulda etiketli iken, Kaede etiketli mDCs dLNs, nerede iki yöntem çıkış benzer bir düzeyde sayısal VacV enfeksiyon dışında içinde daha fazla FITC-etiketli görülmektedir. Ayrıca, DBP bağlamında FITC Ayrıca rDC nüfus nerede photoconversion mDCs (Şekil 2C) belirli kaldı etiketli. Bu yöntemlerin her ikisi de kullanarak, biz VacV gelen yaklaşık 200 DCs çıkış cilt enfekte ve önemlisi çıkış bu düzeyde Loo vd tarafından transdermal FITC uygulamasını kullanarak daha önce yayımlanmış bulgular beyannamedir kaydetti gözlenen 41. böylece, inflamatuar bağlamda bağlı olarak, dLNs ve photoconversion ise göçmen olmayan LN yerleşik DC nüfusun non-spesifik etiketlemede sonucu tespit etiketli DCs numaralarını transdermal FITC uygulama artabilir Özellikle mDC nüfus düşen DCs tanımlar.
5,33,43 ve5,6,35,38 kutanöz, mukozal, çıkış lökosit saklama ölçmek için kullanılan Kaede-Tg fareler ve lenfoid doku küçük devlet sabit ve koşullar iltihaplı ve tümör nerede tümör intradermal kulakları ve küçük birimler39photoconverted içine implante edildi sadece tek bir yayındaki uygulanır. Böylece, lökosit çıkış daha fazla immünolojik hipotez testleri etkinleştirmek için kurulan, büyük birincil tümörleri gelen miktar için in vivo photoconversion yardımcı programı değerlendirmek istedi. İlk olarak, biz MC38 tümör hücreleri intradermally Kaede-Tg fareler arasında sol ve sağ scapulae içine yerleştirdim. İmplante edilebilir tümör modelleri için bilinen LNs lenfatik drenaj sağlamak için tümörlerin hassas konumlandırma izin verin; üst deride yerleştirilen tümörler öncelikle drenaj için sol ve sağ brakiyal LNs geri. 100-150 mm3ulaştıktan sonra tümör photoconverted idi (10 min, 200 mW) ve tümörleri ve photoconversion hemen sonra hasat dLNs. Çözümleme akış sitometresi ile ortaya intratumoral CD45 önemli dönüşüm+ Kaede yeşil+ hücrelerden Kaede kırmızı+ (% 69; Şekil 3A), önemlisi iken, dLNs kaldı Kaede kırmızı+ hücreler için negatif. Ayirt mikroskopi photoconverted YUMM 1.7 tümörlerin ortaya o photoconversion derin tümör dokusuna nüfuz (> 1 mm; Şekil 3B). İlginçtir, deri ve damar hücreleri yüksek photoconversion verimlilik Şekil 3B' görüldüğü gibi bu hücre tiplerinin önde gelen Kaede protein yüksek seviyede hızlı. Bu yüksek Kaede kırmızı ifade bağışıklık hücreleri (hem din ve dönüştürülür) tanımlamak zorlaştırır ayirt mikroskobu kullanarak.
Melanom İmmünoloji bizim özel ilgi göz önüne alındığında, biz sonraki tümör boyutu ve melanin çeşitli implante edilebilir fare tümör hücre hatları kullanarak photoconversion verimliliği üzerindeki etkisini değerlendirildi: MC38 (unpigmented kolorektal kanser hattı), B16. F10 (Melanom hat melanin üretimi), YUMM 1.1 (unpigmented Melanom satır) ve YUMM 1.7 (unpigmented Melanom satır)44. Bu satırların her biri implante intradermal Kaede-Tg fareler ve photoconverted, içine çeşitli tümör birimleri (50-650 mm3) yukarıda açıklandığı gibi. Tümör photoconversion hemen hasat ve Kaede kırmızı CD45 varlığı için değerlendirilen+ lökosit akış sitometresi tarafından. İlginçtir, CD45 photoconversion verimliliğini+ lökosit çeşitli önemli ölçüde tümör türleri ve boyutları (Şekil 3 c) arasında. CD45+ lökosit küçük (50-150 mm3) içinde YUMM 1.7 ve YUMM 1.1 tümörleri sırasıyla % 80 ve % 60'ı, en verimli photoconversion gösterdi. Bu tümörler için hacmi arttıkça, dönüşüm verimliliği büyük tümör (> 600 mm3) yaklaşık % 50 azalmıştır. Melanin photoconversion verimliliği üzerinde çarpıcı bir etkisi vardı: CD45 için maksimum photoconversion+ hücreler melanin B16 üreten içinde. F10 tümörler sadece yaklaşık % 30 ve 400 mm3cilt tümörleri ulaştı olarak % 10'una düştü. İlginçtir, ortaya photoconversion verimliliği bu hücreler melanin üretimi (şekil 3D) ne olursa olsun küçük tümörler yaklaşık % 80-90 için analiz intratumoral CD8+ T hücreleri. Unpigmented tümör, CD8+ T hücre dönüşüm kaldı tümörler geniş hacimli ulaştı olarak yüksek ama boyutu ile önemli ölçüde azalmıştır zaman melanin mevcuttu. Gibi B16 yarar. F10 fare melanomlar ve diğer melanin üreten Melanom satırları ışık emici melanin biyolojik fonksiyonu ile tutarlı olan küçük tümörler (50 mm3), sınırlı olabilir. Tümör photoconversion ile ilişkili inflamatuvar yanıtı değerlendirmek için biz CD45 sayısı sayısal+ hücreleri Dönüştürülmeyen tümörleri ve dönüştürülmüş tümörler 24 saat mesaj photoconversion (Şekil 3E). CD45 toplam sayısında anlamlı bir fark gördüm+ hücre tümörleri 24 h Dönüştürülmeyen tümörü karşılaştırıldığında photoconversion takip algılandı.
Sonraki her iki myeloid ve lenfoid hücre tiplerinin kaçakçılığı davranış sorgulamak için izin veren lökosit çıkış Kaede-Tg fareler, kullanarak tümör microenvironments üzerinden sayılabilir. MC38 veya YUMM 1.7 tümör hücreleri intradermally Kaede-Tg fareler implante edildi. Birimler arasında 100-150 mm3 kere photoconverted tümör vardı (5 dk, 200 mW); Brakiyal dLNs ve kasık sigara boşaltma LNs 24 saat sonra photoconversion toplanmıştır. Intratumoral lökosit nüfus MC38 sayısal ve YUMM 1.7 tümörler denetime C57Bl/6 fareler implante ve tümör 100-150 mm3kere toplanan. Lökosit karmaşıklık tümörleri ve egressed nüfus içinde akış sitometresi tarafından değerlendirildi: T hücreleri (CD3ε CD4+ /CD8+ /-+), B hücreleri (CD3ε-CD19+), DCs (CD11c+MHCII+CD11b+ /- ), nötrofil (CD11b+MHCII-Ly6G+), makrofajlar (CD11b+MHCII+F4/80+) ve inflamatuar monosit (CD11b+Ly6G-Ly6C+; Şekil 4A). Bu aynı gating düzeni'ni kullanarak, biz Kaede tümör microenvironments (Şekil 4B) önceki ikamet gösteren kırmızı ifade dLNs içinde her lökosit nüfusunun yüzde değerlendirildi. İlginçtir ki, her iki MC38 ise (Şekil 4 c) ve YUMM 1.7 (Şekil 4 d) tümör myeloid hücrelerin (monosit, DCs ve makrofajlar) esas olarak infiltre, her iki tümör türlerinden egressed hücreleri yaklaşık % 50 idi T lenfositler (her iki CD4+ ve CD8+). T hücreleri, ek olarak biz de DCs, B hücreleri, gözlenen ve monosit tümörler ama makrofajlar ve nötrofiller egressed nüfus içinde her iki tümör türünden algılanmadı. Özet olarak, bu veri Kaede-Tg photoconvertible fareler endojen bir ortamda birden fazla lökosit soy izleme yardımcı programı gösterir. Ayrıca, bizim analiz çıkış intratumoral lökosit karmaşıklığı belirlemek için önemli etkileri olabilir seçici, aktif bir süreç olduğunu gösterir.
Şekil 1: Photoconversion verimliliği ve fare deri iltihabı ilişkili. Fare DermIS yapıldı photoconverted 3 dk 100 mW (405 nm ışık). (A) temsilcisi akışı arsalar heykelde photoconverted (Kaede kırmızı+) CD45+ hücreleri bir din ve dönüştürülmüş kulak ve servikal dLN hemen aşağıdaki photoconversion. Nüfus ön kapı yaşamak, CD45+ tek hücre. Toplam CD45 numaralandırılmasına (B) + hücreleri Dönüştürülmeyen kulaklarında (-), photoconversion, takip kulaklar hemen toplanan kulakları toplanan 24 saat sonra photoconversion ve kulakları toplanan 24 h VacV enfeksiyon sonra (n = 3). (C) damar leakiness hemen ardından ışığa maruz kalma 405 nm ölçmek için A Mile'nın tahlil gerçekleştirildi (3 dk, 100 mW). Temsili resim kaçak kulak cilt (solda) ve ayıklanan boya (sağda) miktar (n = 3). Hata çubukları temsil SEM *p< 0,05 ve **p< 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: DC çıkış üzerinden saf, iltihaplı ve enfekte deri. (A) göçmen DCs (mDCs; tanımlamak için Gating düzeni MHCIIMerhabaCD11cint) ve ikamet DCs (rDCs; MHCIIMerhabaCD11cMerhaba). (B) temsilcisi akışı gösteren FITC+ araziler veya Kaede kırmızı+ DCs, mDCs, fareler üzerinde ön kapı VacV (dLN) veya kontralateral sigara boşaltma LN denetimleri bulaşmış. (C) deri (48 saat sonrası enfeksiyon) miktar+ Kaede kırmızı sayıda ve FITC+ mDCs ve dLNs kararlı duruma, DBP iltihaplı (24 h sonrası uygulama) ve VacV rDCs bulaşmış. Hata çubukları temsil SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: tümör microenvironments Photoconversion verimlilik. Tümör vardı photoconverted 10 dk 200 mW (405 nm ışık). (A) Kaede yeşil ve Kaede din ve dönüştürülmüş MC38 tümörler ve hemen ardından photoconversion brakiyal dLN kırmızı temsilcisi Akış grafiğini çizer. Nüfus ön kapı yaşamak, CD45+ tek hücre. (B) ayirt microcopy din donmuş, OCT gömülü YUMM 1.7 tümör her iki ve photoconverted. Ölçek çubuğu 200 µm. (C) dönüşüm verimliliği CD45 =+ lökosit ve (D) CD8+ melanin üreten-(B16. lenfositler F10) ve unpigmented (MC38, YUMM 1.1, YUMM 1.7). Her noktası tek bir fare temsil eder. Toplam CD45 numaralandırılmasına (E) + Dönüştürülmeyen tümör hücreleri ve photoconverted tümör toplanan 24 saat sonra photoconversion (n = 3). Hata çubukları temsil SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: lökosit çıkış tümör microenvironments üzerinden seçmeli. (A) MC38 dLNs myeloid ve lenfoid nüfus üzere Gating düzen. (B) photoconversion sonra tanımlayıcı Kaede kırmızı+ hücreler arasında MC38 dLNs 24 h myeloid ve lenfoid hücrelerde temsilcisi Akış grafiğini çizer. Akış parsellerde yüzdeleri belirtmek frekans intratumoral Ins. (C, D) göreli orantılarını belirtilen üst lökosit nüfus içindeki Kaede kırmızı+ hücreleri (CD45%+ hücreleri) ve egressed (% Kaede kırmızı+ hücreleri; Brakiyal dLNs) lökosit MC38 üzerinden (C, n = 3) ve YUMM 1.7 (D, n = 4) tümörler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lökosit çıkış periferik, Sigara-lenfoid doku üzerinden kritik başlatma ve bağışıklık yanıtı çözümlenmesi için olsa da, çıkış düzenleyen moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır. Bilgi serisindeki bu boşluğun miktar içinde vivoiçin araçları hazır kullanılabilirliğini büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Burada, photoconvertible fareler (Kaede-Tg) endojen lökosit çıkış deri ve tümör ölçmek ve inflamatuar FITC boya ile doğrudan kafa kafaya karşılaştırma sağlamak için ve enfeksiyon modelleri nasıl kullanılacağını açıklar. Biz her iki model endojen DC nüfus takip ederken FITC ve zavallı alımı olmayan fagositik hücreleri tarafından ücretsiz drenaj FITC boya myeloid ve lenfoid çıkış üzerinden periferik, Sigara-lenfoid doku dahil olmak üzere geniş analizi için yeni sınırlar göstermek tümörler. Ayrıca, tümör üzerinden çıkış seçici tercihan--dan Stokastik böylece teyit Torcellan vd tarafından sunulan bulgular gösterir veri mevcut 39. daha fazla soruşturma lökosit çıkış tümörler üzerinden yönetim mekanizmaları roman kavrama içine tümör ilişkili inflamasyon ve bağışıklık açığa.
Literatürde bildirilen ayarları kullanarak ne zaman biz ilk fare cilt ve yerel iltihap üzerindeki etkisini photoconversion verimliliğini değerlendirildi. Kulakları pozlama mor ışık 3 dk 100 mW güçte CD45 verimli photoconversion içinde sonuçlandı+ hücreleri yok dönüşüm aşağı akım dLNs ile kulak cilt (% 78) içinde. Literatürde raporlar 3-5 dk pozlama kutanöz dokularda5,33,38için en uygun olduğunu göstermektedir. Ancak, bu poz liderliğindeki CD45 artan sayıda+ hücreleri kulak pinna 24 h dönüşüm takip ve vasküler sızıntı kulak cilt bu ayarları, bu photoconversion gösteren indükler ne zaman dikkate alınması gereken yerel iltihabı, veri yorumlama. Sonraki doğrudan Kaede photoconversion ve daha geniş anlamda kullanıldığında FITC boya tahlil23,24 , kararlı durum, DBP kaynaklı enflamasyon sırasında ve enfekte VacV kulaklarını kullanarak LNs kaçakçılığı DC karşılaştırmak aradı. Biz gözlenen yükseltilmiş FITC içinde etiketleme photoconverted cilt kararlı duruma ve aşağıdaki DBP tedavi karşılaştırıldığında olarak kabul edilir. Ücretsiz FITC uygulanması cilt için neden olur lenf damarları ile doğrudan drenaj içinde boşaltma bürosu nerede ikamet geçirilmez DC nüfus, (Örn., CD8α+ DCs), FITC örnek. Bununla tutarlı, tahriş edici DBP ile tedavi ederken FITC etiketli rDCs sayıda gözlenen. Buna ek olarak, DCs kırmızı etiketli Kaede sadece gözlendi mDC nüfus aşağıda, bu photoconversion gösteren photoconversion etiket mDCs için daha özel bir yol sunar. Hatta mDC nüfus içinde ancak, biz kantitatif daha etiketli mDCs FITC photoconversion kullanırken görülmektedir. Bu aynı zamanda ücretsiz FITC drenaj tarafından açıklanabilir, etiketleme süresi farklılıkları, nerede photoconversion sadece DCs Şu anda etiketleyebilirsiniz cilt FITC süre ikamet deride 24 h dönemi süresince kalmasını mümkün iken , Google hesapları için gözlenen mDC çıkış farklılıkları. İlginçtir, viral enfeksiyon bağlamında, hem photoconversion hem de FITC uygulama nispeten eşit düzeyde mDC çıkış ve birkaç FITC+ rDCs VacV enfekte kulakları boşaltma INS içinde ölçülür. Biz son zamanlarda lenfatik drenaj önemli ölçüde azaltılmış aşağıdaki VacV enfeksiyondur ve böylece lenfatik taşıma viral kaynaklı azalma FITC boya özgüllük artırabilir ve LN ikamet DC nüfus31 etiketleme azaltılmış bildirdi . Önemlisi, bu çalışma aynı zamanda gerçeği vurgulamaktadır mDC nüfus içinde (CD3ε-CD19-MHCIIMerhabaCD11cint), 24 saat içinde aktif olarak geçirilen DCs bir küçük nüfus ve böylece toplam mDC sayıdır numaraları etkin geçişi41için iyi bir vekil değildir. Son olarak, biz sürekli olarak herhangi bir verilen 24 h dönem aşağıdaki VacV enfeksiyon için41, tümör microenvironments dan 1500-2000 DCs çıkış sırasında yaklaşık 200 hücreleri, mDC çıkış ölçmek dikkat çekicidir. VacV büyük etkinliği bir aşı platform olarak, özellikle yakici45,46,47tarafından uygulandığında göz önüne alındığında, bu DC kalitesini ve belki de DC türü olduğunu spekülasyon için ilginç miktar yerine antijen sunan, bu sağlam koruyucu bağışıklık belirler.
Lökosit çıkış ötesinde DCs25,48, tümör microenvironments gelen kötü incelenen bir alan kalır. Ne kadar kronik iltihaplı microenvironments tümörler olarak, olup Malign olmayan ve malign dokular üzerinden hücresel çıkış benzer mekanizmaları düzenleyici bilinmeyen kalır. Lökosit çıkış tümörler üzerinden Stokastik olup ayrıca, ya da daha doğrusu seçici lökosit birikimi ve tümör microenvironments saklama yorumlamak için önemli etkileri olacaktır. Bu nedenle, lökosit çıkış üzerinden tümörleri nasıl tümörler immün gözetim kaçmasına anlamak için çok önemli ve immünoterapi için yeni stratejiler yol. Burada biz lökosit çıkış nerede FITC boya için yetersiz olurdun implante edilebilir kutanöz tümörler üzerinden çalışmaya photoconvertible Kaede-Tg modeli uygulamak geniş etiket myeloid ve lenfoid nüfus. İlk çalışmalar ortaya yerleştirilmiş tümörler photoconversion verimlilik hem tümör boyutu ve melanin üzerine bağımlı vardı. Melanin olmadığı durumlarda Tümör büyüdükçe photoconversion verimliliği hızla kapalı damla iken (B16. F10), YUMM ve MC38 tümör gibi tümör pigmente olmayan satırları daha istikrarlı dönüşüm verimliliği test tümör boyutları arasında sergi. İlginçtir ki, biz gelişmiş dönüşüm verimliliği CD8 içinde gözlenen+ T hücre bölmesi karşılaştırıldığında CD45 için+ hücreleri, boyut olarak büyütülmüş tümörler olarak reddetti. Bu gözlem için katkıda bulunan büyük olasılıkla çeşitli faktörler vardır. İlk olarak, bir tümör içindeki konuma pozlama ve böylece belirli hücre tiplerinin dönüşüm verimliliği etkileyecektir. T hücreleri sık cilt tümörü arabirimi implante edilebilir tümör modelleri ile sınırlı bulunur ve böylece daha kolay photoconverted göre myeloid hücrelerin tümör parankimi sızmak olabilir. İkinci olarak, tüm lökosit Kaede protein49 aynı düzeyde hızlı ve böylece hepsi eşit akış sitometresi tarafından algılanabilir; Bu tüm CD45 gibi daha heterojen bir hücre nüfus analiz ederken photoconversion gözlenen oranlarda düşürmek için neden olabilir+ hücreleri. Son olarak, Şekil 3 ' te sunulan veri mor ışık pozlama oluşturulan aşağıdaki 10 dk olduğunu unutmamak gerekir. Bu ilk çekim hızı raporları photoconversion kez cilt, göçmenlik, mukozal doku ve tümör5,6,33,35 de dahil olmak üzere çeşitli organları için gerekçe göstererek edebiyat dayalı seçildi ,39,43. Tümör photoconvertible sisteminde istihdam yalnızca diğer çalışma, photoconversion 20 dk39için gerçekleştirildi. Elimizde daha fazla optimizasyon geliştirilmiş verimlilik 5 dk hem küçük hem de büyük birimler için bir kısaltılmış çekim hızı ile saptandı. Uzun süre maruz Kaede floresan photobleaching için yol açar ve bu nedenle, bizim bildirilen dönüşüm verimliliği hafife olabilir muhtemeldir. Uzun süreli pozlama da artan photoconversion ilişkili iltihap için yol ve çalışma sonuçları yıkmak. Tümör photoconverted 5 min için Dönüştürülmeyen tümörü göre photoconversion sonra 24 saat+ intratumoral CD45 sayısında anlamlı bir fark hücreleri gösterdi. Ayrıca, tümör photoconverted 5 min için ölçülebilir ve tekrarlanabilir çıkış myeloid ve lenfoid nüfus için gösterdi. Sonuç olarak, belirli dokuların ya da tümörler ilgi içinde bireysel optimizasyon en iyi sonuçları elde etmek gereklidir.
Son olarak, situ photoconversion endojen lökosit çıkış Kaede-Tg fareler implante tümörler üzerinden ölçmek için kullanılır. İki farklı implante edilebilir, Sigara pigmentli tümör modelleri kullanarak biz DC'lerin, önemli çıkış gözlenen T hücreleri ve monosit. Kısa bir süre önce iş39, her iki CD4 ile tutarlı+ ve CD8+ T hücreleri hücre tümörü microenvironments ile birlikte çok sayıda çift negatif CD3ε+ T üzerinden egressed. En azından bu gözlem fonksiyonel önemi belirlenecek kalır ama bu nüfusun bir bileşeni yukarıda açıklanan39, gama delta T hücreleri olabilir. Önemlisi, Biz gözlenen lökosit zenginleştirme intratumoral havuzlarda göre egressed nüfus tümör tümör microenvironments içinde mevcut lökositlerin göreli oranlarını geçin lökosit oranlarını karşılaştırıldığında Seçici lökosit çıkış gösteren her iki model de. Özellikle, makrofajlar ve nötrofiller yoktun egressed nüfus, yine de her iki hücre tipleri için çıkış iltihaplı ve virüslü koşulları2,50,51,52 altında açıklanan olmuştur , 53 , 54 ve are önemli katkıda bulunan intratumoral lökosit kapsayacağını39,55,56. Böylece, tümörler düşük lökosit çıkış photoconvertible modelleri kullanarak sayısal, daha doğrusu düzenlenmiş bir süreç Stokastik değildir ve bir önemli ve çöküşünde biyoloji anlayış inflamatuar için önemli etkileri ile kalır ve tümör microenvironments, kararlı duruma ve tedaviye yanıt bağışıklık dinamiği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çakışma var.
Acknowledgments
Yazarlar Dr. Marcus Bosenberg YUMM 1.1 ve YUMM 1.7 fare Melanom hatları ve Dr Deborah J. Fowell B6 sağlamak için sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr fareler RIKEN BRC aracılığıyla Ulusal biyo-kaynak olduğunu MEXT, Japonya ile anlaşma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
- D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
- Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
- Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
- Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
- Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
- Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
- Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
- Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
- Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
- Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
- Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
- Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
- Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
- Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
- Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
- Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
- Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
- Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
- Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
- Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
- Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
- Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
- Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
- Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
- Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
- Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
- Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
- Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
- Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
- Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
- Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
- Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
- Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
- Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
- Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
- Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
- Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
- Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
- Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
- Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
- Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
