Summary
Qui, noi dimostrare i metodi per la quantificazione in vivo d'uscita del leucocita da ingenuo, infiammato e maligni della pelle murino. Eseguiamo un confronto testa a testa tra due modelli: transdermico FITC applicazione ed in situ fotoconversione. Inoltre, dimostriamo l'utilità di fotoconversione per servizi esterni del leucocita di rilevamento da tumori cutanei.
Abstract
Uscita del leucocita dai tessuti periferici ai linfonodi drenanti non è solo fondamentale per la sorveglianza immune e l'inizio, ma contribuisce anche alla risoluzione delle risposte dei tessuti periferici. Mentre una varietà di metodi sono usati per quantificare in uscita del leucocita dai tessuti non linfoidi, periferici, i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il contesto-dipendente in uscita rimangono poco compresi. Qui, descriviamo l'uso di fotoconversione in situ per l'analisi quantitativa di uscita del leucocita da murina pelle e tumori. Fotoconversione permette l'etichettatura diretta dei leucociti residente all'interno del tessuto cutaneo. Anche se l'esposizione della pelle a luce ultravioletta induce locale le risposte infiammatorie caratterizzano da infiltrati del leucocita e permeabilità vascolare, in un confronto testa a testa con applicazione transcutanea di traccianti fluorescenti, fotoconversione specificamente con etichetta popolazioni migratori delle cellule dendritiche e contemporaneamente abilitato la quantificazione di uscita mieloide e linfoidi da microambienti cutanei e tumori. I meccanismi d'uscita del leucocita rimangono un componente mancante nella nostra comprensione della complessità del leucocita intratumoral, e così l'applicazione degli strumenti descritti nel presente documento fornirà visione unica le dinamiche del tumore immuni microambienti entrambi a costante dichiari e in risposta alla terapia.
Introduction
Risposte immunitarie tessuto periferico sono a forma di non solo di reclutamento leucocitario ai siti di infiammazione, ma anche dai meccanismi che regolano la loro successiva conservazione. Così, l'immunità protettiva è dettata dalla cumulativi meccanismi cellulari e molecolari che determinano se un leucocita entra, soggiorni all'interno, o meglio migra dal tessuto periferico tramite vasi linfatici. D'importanza, la propensione per i leucociti uscire del tessuto attraverso i vasi linfatici (definito in uscita) è legata alla loro funzioni specializzate. Le cellule dendritiche (DC) acquisiscono comportamento migratore in risposta a segnali di maturazione che conduce al trasporto dell'antigene e presentazione nello scarico dei linfonodi (dLN), un processo che è necessario per l'immunità adattativa1. Lo scavenging cellule mieloidi, quali macrofagi e neutrofili, servono a rimuovere i detriti apoptotici attraverso fagocitosi. Durante l'infezione batterica, neutrofili uscita del tessuto e, infine, andare incontro ad apoptosi in dLNs2 e in un modello di colite DSS indotta, dati supportano l'ipotesi che l'uscita del macrofago è necessaria per risolvere l'infiammazione locale3. Tuttavia, se conta dei neutrofili e dei macrofagi in uscita si verifica in tutti i contesti infiammatori, è sconosciuto. Prove per l'uscita dei linfociti T da stazionario4,5,6,7, infetti8e infiammata4,9,10, 11,12 tessuti periferici non linfoidi indica che le cellule T ricircolare attivamente, anche se i segnali tissutali che guidano questa uscita rimangono poco compresi. Parecchi studi hanno identificato i segnali necessari per la migrazione direzionale verso lo scarico di capillari linfatici e successivi uscita compreso ligando di chemochina (motivo C-C) 21 (CCL21) e del suo recettore CCR74,11, 13, ligando di chemochina (motivo C-X-C) 12 (CXCL12) e il suo recettore CXCR42,14e sfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Questi meccanismi non sono attivi in tutti i contesti, tuttavia, e se essi determinano in uscita di tutti i tipi di cellule rimane una questione aperta. D'importanza, ulteriore comprensione dei meccanismi che regolano l'uscita e la sua rilevanza funzionale nella malattia richiede metodi quantitativi in vivo di analisi.
Diversi metodi sono stati usati per quantificare in uscita in più modelli animali in vivo , tra cui diretto incannulazione dei vasi linfatici, trasferimento adottivo di ex vivo etichettato leucociti, applicazione transcutanea di traccianti fluorescenti, iniezione di particelle con etichettate e in vivo fotoconversione17,18. Incannulazione diretta dei vasi linfatici afferenti del mouse è difficile e limitata nei piccoli animali dai volumi di liquido che può essere raccolto. Così, inserimento di una canula in gran parte è stata eseguita in animali di grandi dimensioni (ad es., pecore) dove tali manipolazioni chirurgiche sono pratici. Questi studi forniscono la prova diretta per la presenza di cellule mieloidi e linfoidi in linfa10,19,20. Inoltre, ovine modelli rivelano che l'infiammazione acuta e cronica aumentata presenza dei linfociti nei linfonodi da quasi 100 volte10,21.
Trasferimento adottivo di linfociti con etichettati e geneticamente manipolati soprattutto ha rivelato che CCR7 è necessaria per l'uscita di CD4+ T cellule da acutamente inflamed pelle5,11, mentre il pretrattamento dei linfociti con la piccola molecola agonista del recettore S1P, FTY720, inibisce solo parzialmente la loro uscita10. È interessante notare che, l'uscita dei linfociti trasferiti da pelle cronicamente infiammata è CCR7-indipendente10, ma parzialmente può richiedere CXCR49. Esperimenti di trasferimento adottivo, tuttavia, forniscono numeri non-fisiologica di ex vivo linfociti attivati ed etichettati nel tessuto attraverso l'iniezione, che altera l'ambiente biomeccanica dei tessuti e l'elevata pressione del fluido interstiziale che aprire capillari linfatici iniziali e alterare le loro proprietà di trasporto22. Come un'applicazione alternativa, transdermica di isotiocianato di fluorescina (FITC) in presenza o assenza di sostanze irritanti cutanei (ad es., dibutilftalato, DBP) o infezione23,24 consente per il tracciamento degli cellule fagocitiche che si accumulano tracciante e la migrazione a dLNs. Analogamente, fluorescente identificati tumori forniscono un mezzo per tenere traccia di cellule fagocitiche che hanno inghiottito tumore materiale25. Questi metodi hanno fornito la comprensione importante nei meccanismi che regolano DC uscita13,14,17,26,27 , ma sono in grado di tenere traccia non fagocitica linfociti e, interpretazione può essere complicate da libero drenaggio linfatico di FITC solubile così etichettatura stanziali, LN residente DCs.
In alternativa, la microscopia intravital è un potente strumento che permette per il monitoraggio in vivo di popolazioni leucocitarie fisiologicamente rilevanti in tempo reale28,29. Usato in combinazione con i topi reporter e base di anticorpi in vivo etichettatura immunofluorescente, videomicroscopia microscopia ha rivelato il complesso spaziale e dinamica temporale di immune cellula traffico, tra cui migrazione interstiziale30 , trasmigrazione attraverso l'endotelio linfatico, il passaggio all'interno del lume linfatico e migrazione su LN voce28,31. L'adozione di tecniche di imaging videomicroscopia è limitata dalla spesa, competenze necessarie per la messa a punto e limitata velocità di trasmissione per quantificare più tipi di cellule. Ancora, metodi quantitativi che analizzare le dinamiche di popolazione di accoppiamento tessuti con imaging videomicroscopia fornirà ulteriori e importanti informazioni per quanto riguarda i meccanismi di migrazione verso e all'interno di capillari linfatici e motilità 18 , 31 , 32.
Di conseguenza, in vivo fotoconversione è emerso come un metodo che consente di in situ di etichettatura, indipendente di attività fagocitaria e per la quantificazione di uscita fisiologico del leucocita (quando accoppiato con citometria a flusso) nella assenza o presenza di sfida. Topi di Kaede-Tg esprimono costitutivamente una proteina isolata dal corallo che presenta fluorescenza verde (Kaede verde) fino a quando esposto a luce ultravioletta, dopo di che irreversibilmente converte in fluorescenza rossa (Kaede rosso)33. Photoconverted cellule possono essere monitorate come essi uscire da luoghi periferici del tessuto e si accumulano nel dLNs. Questo e altri simili fotoconvertibile mouse modelli34,35 hanno rivelato biologia importante tra cui uscita costitutiva delle cellule T regolatorie da pelle36, servizi esterni di CXCR4-dipendente delle cellule di B da placche di Peyer37 , mobilizzazione delle cellule di T di memoria residente al momento del peptide ri-sfida38e l'uscita del leucocita ampio da tumore microambienti39. Nel presente documento, eseguiamo un confronto testa a testa di fotoconversione con applicazione transdermica FITC nel contesto di infiammazione cutanea e infezione per consentire un confronto diretto dei dati esistenti con il metodo fotoconvertibile. Inoltre, dimostriamo fotoconversione in tumori impiantati e descrivere l'efficienza di conversione e l'uscita selettiva da microambienti di tumore. Come tale, ci sostengono che ulteriore applicazione di questi metodi è necessario chiarire la biologia critica d'uscita del leucocita dai tumori, che avrà implicazioni significative per l'interpretazione delle complessità di intratumoral del leucocita, immunità anti-tumorale, e risposta alla terapia.
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Protocol
Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la Oregon Health & Science University e istituzionali Animal Care.
1. induzione di infiammazione e pittura di FITC di Mouse Pinna
- In una cappa a flusso laminare, anestetizzare un mouse C57Bl/6 utilizzando vaporizzata isofluorano (indurre a 3-5% isofluorano e mantenere a 1-3% isofluorano; portata di ossigeno a 0,5-1,0 L/min). Garantire adeguata amputate monitorando la perdita del riflesso pedale, movimenti involontari e ridotta frequenza respiratoria.
- Posare un orecchio piatto con il lato ventrale dell'orecchio verso l'alto. Pipettare 20 µ l di soluzione FITC 5% sciolto in 1:1 acetone: dibutilftalato (DBP) al lato ventrale di pinna di orecchio. Consentire l'orecchio ad asciugare per pochi secondi.
- 24 h dopo l'applicazione di FITC, eutanasia i topi tramite l'esposizione di anidride carbonica seguita da dislocazione cervicale. Raccogliere i padiglioni auricolari in PBS separando le orecchie dalla testa con le forbici. Raccogliere la cervicale dLNs e inguinale non drenante LNs in PBS utilizzando una pinzetta per separare la LNs dai tessuti circostanti. Inguinale non drenante LNs servirà come controlli negativi per la presenza di leucociti /Kaede rosso+ +FITC. Smaltire le carcasse al protocollo ospedaliero.
Nota: Il tempo ottimale post fotoconversione per analisi dipenderà il tipo di cella e noti comportamenti migratori. Cellule dendritiche, ad esempio, possono essere rilevate in dLNs come presto come 6h post DBP applicazione.
2. induzione di infiammazione e di fotoconversione di Mouse Pinna
- In una cappa a flusso laminare, anestetizzare un mouse di Kaede-Tg (sfondo C57Bl/6) tramite l'iniezione intraperitoneale di 80 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina sciolto in soluzione salina. Garantire la corretta amputate come descritto nel passaggio 1.1.
- Posare un orecchio piatto con il lato ventrale dell'orecchio verso l'alto. Pipettare 20 µ l di un 1:1 di acetone: DBP al lato ventrale del padiglione auricolare dell'orecchio. Consentire l'orecchio ad asciugare per pochi secondi.
- Dopo l'applicazione di DBP, tagliare una fessura in un pezzo di carta stagnola e tirare l'orecchio attraverso la fessura per esporre l'orecchio alla sorgente di luce viola. Porre l'orecchio piatto con il lato dorsale rivolto verso l'alto utilizzando nastro biadesivo per fissare l'orecchio all'estruso.
- Posizionare l'orecchio direttamente sotto la fonte di luce e fotoconvertita per 3 minuti utilizzando una sorgente luminosa di 405 nm a 100 mW di potenza.
- 24 h dopo fotoconversione, eutanasia i topi di Kaede-Tg e raccogliere i padiglioni auricolari, LNs cervicale e inguinale LNs descritte al punto 1.3.
Nota: Oltre a considerazioni citate al passaggio 1.3, i tassi di proliferazione saranno determinare i tempi di analisi come si verifica la perdita di Kaede rosso in cellule in rapida divisione.
3. vaccinia infezione del Mouse Pinna e applicazione di FITC
- Anestetizzare un mouse C57Bl/6 con isofluorano vaporizzato come descritto nel passaggio 1.1.
- Appoggiare il lato ventrale dell'orecchio piatto. Pipettare 5 x 106 unità formanti placca (PFU) del virus vaccinico (VacV) diluito in 10 µ l di PBS sul padiglione auricolare dell'orecchio. Utilizzando un ago 29, poke pinna 25 volte40.
- post-infezione 24h, anestetizzare topi VacV-infettati con isofluorano come descritto nel passaggio 1.1 e dispensare 20 µ l 5% FITC disciolto in acetone sul lato ventrale del padiglione auricolare dell'orecchio. Consentire l'orecchio ad asciugare per pochi secondi.
- 24 h dopo l'applicazione di FITC, eutanasia i topi e raccogliere i padiglioni dell'orecchio, LNs cervicale e inguinale LNs descritte al punto 1.3.
Nota: FITC può essere applicato a qualsiasi infezione post punto di tempo per determinare DC traffico a vari intervalli di 24 h. Precedentemente abbiamo segnalato che la migrazione DC a dLNs è mantenuta a livelli simili da giorno 1 a 3 post infezione41.
4. vaccinia infezione del Mouse Pinna e fotoconversione.
- Anestetizzare un mouse di Kaede-Tg con isofluorano vaporizzato come descritto nel passaggio 1.1.
- Infettare il pinna orecchio con VacV come descritto al punto 3.2.
- 24h post-infezione, anestetizzare topi infettati VacV Kaede come descritto nel punto 2.1 ed eseguire fotoconversione come descritto ai punti 2.3-2.4.
- 24 h dopo fotoconversione, eutanasia i topi e raccogliere i padiglioni auricolari, LNs cervicale e inguinale LNs descritte al punto 1.3.
Nota: Come indicato al punto 3.4, fotoconversione può essere somministrato a qualsiasi infezione di post punto di tempo.
5. orecchio e linfonodo elaborazione per citometria a flusso
- Creare sospensioni singola cella dei padiglioni auricolari ear: sbucciate a pezzi i lati ventrali e dorsali del pinna orecchio utilizzando due coppie di pinzette e posto all'interno dell'orecchio rivolto verso il basso nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente collagenasi di 1 mg/mL D e 80 U/mL DNasi, diluito in Buffered Saline soluzione (HBSS di Hank) (contenente Ca2 + e Mg2 +). Incubare a 37 ° C per 30 min premere il tessuto digerito attraverso un colino di cella in nylon 70 µm.
- Creare sospensioni singola cella da LNs: posto LNs nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente collagenasi di 1 mg/mL D e 80 U/mL dnasi diluito in HBSS. Aprire civettuole linfonodo usando due aghi di 29-calibro della capsula e poi incubare i linfonodi a 37 ° C per 30 min premere il tessuto digerito attraverso un colino di cella in nylon 70 µm.
6. intradermica Melanoma impianto del tumore e fotoconversione.
- Radere il pelo dal centro della parte posteriore di un mouse di Kaede-Tg utilizza un rasoio elettrico.
- Posizionare un ago 29 al centro della schiena tra le scapole superiore di destra e sinistra e iniettare per via intradermica 5x105 cellule del tumore (diluite in 50 µ l di soluzione fisiologica) nella pelle dei topi di Kaede-Tg. I tumori devono essere posizionati accuratamente per assicurare il drenaggio linfatico ai linfonodi specificati (cioè, sinistra e destra brachiale LNs per tumori collocato al centro della parte superiore della schiena). Evitare di collocare il tumore sopra dLN poiché ciò può comportare fotoconversione diretto di LNs attraverso il tumore di pelle.
- Consentire i tumori crescere di dimensione desiderata (100-650 mm3).
- Un giorno prima della raccolta del tessuto, anestetizzare un mouse di Kaede-Tg come descritto al punto 2.1 e radere i peli appena ricresciuto intorno al tumore.
- Tagliare un foro circolare nella carta stagnola e tirare il tumore attraverso per esporre il tumore alla sorgente luminosa. Tagliare il foro leggermente più piccolo del tumore per impedire la caduta indietro attraverso il foro di tumore e ridurre al minimo la conversione della pelle adiacente, non tumorali.
- Posizionare il tumore direttamente sotto la sorgente luminosa e fotoconvertita per 5 min utilizzando una sorgente luminosa di 405 nm a 200 mW di potenza.
- 24 h dopo fotoconversione, eutanasia i topi come descritto al passaggio 1.3. Raccogliere i tumori, brachiale dLNs e inguinale LNs non-drenante in PBS. Tagliare i tumori dalla pelle circostante utilizzando le forbici e rimuovere LNs descritte al punto 1.3.
7. tumore e linfonodo elaborazione per citometria a flusso
- Creare sospensioni singola cella dai tumori: tritare i tumori con le forbici in pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente collagenasi di 1 mg/mL D e 80 U/mL dnasi diluito in HBSS. Incubare a 37 ° C per 1 h. Press il tessuto digerito attraverso un filtro di nylon 70 µm.
- Creare sospensione unicellulare dei linfonodi come descritto al punto 5.2.
8. anticorpo che macchia per citometria a flusso
- Dopo digerire i tessuti nelle sospensioni singola cella, eseguire tecniche di colorazione citometria a flusso standard per etichettare le cellule con gli indicatori di interesse. Brevemente, dispensare 2 x 106 le cellule in una piastra a 96 pozzetti. Incubare i campioni con blocco Fc (1 µ g/mL) per 20 minuti sul ghiaccio; lavare due volte con tampone di FACs (albumina di siero bovino 1% in PBS). Aggiungere live/dead macchia (diluito in PBS) ai campioni ed incubare per 15 minuti sul ghiaccio; lavare due volte con tampone di FACs. Incubare con gli anticorpi primari (Tabella materiali) diluiti in un tampone di FACs per 30 min in ghiaccio; lavare due volte con tampone di FACs.
Nota: Kaede verde e Kaede fluorescenza rossa si sovrappone con fluorofori FITC e PE; così, FITC e anticorpi coniugati PE non possono essere utilizzati in combinazione con proteine di Kaede. - Dopo la colorazione, è necessario eseguire gli esempi su un citometro a flusso. In alternativa, fissare le cellule con 2% PFA.
9. analisi di citometria a flusso di
- Impostare il FITC (Kaede verde) e il canale di PE (Kaede rosso) tensioni PMT al 70-80% dell'intervallo totale (centro della popolazione di circa 104) utilizzando ex vivo Kaede verde o gli splenocytes Kaede rosso colore singolo o sangue.
Nota: Non compensano per il verde di Kaede (FITC) e canali di Kaede rosso (PE) come questo si tradurrà in una maggiore segnale diffuso.- Per creare controlli di singolo-colore Kaede, raccogliere una milza o sangue da un mouse di Kaede-Tg. Lisare cellule rosse del sangue con buffer di ACK, poi dividere le celle in due gruppi: non convertiti Kaede verde e convertito Kaede rosso.
- Per singolo colore Kaede rossi controlli, sospendere le cellule in 1 mL di PBS e fotoconvertita in una piastra a 24 pozzetti per 5 min utilizzando un sorgenti luminose di 405 nm con una potenza di 100 mW. Utilizzare queste cellule per impostare il Kaede verde (FITC) e Kaede rosse tensioni PMT sul citofluorimetro (punto 9.1).
- Dopo aver impostato le tensioni per le proteine di Kaede, compensare tutte le altre macchie di anticorpo primario utilizzando single-fluoroforo etichettato perline di compensazione per le istruzioni del produttore.
- Eseguire gli esempi su un citometro a flusso per raccogliere dati.
Nota: La proteina di Kaede è continuamente essere prodotta dalle cellule. Questo significa che 24 h dopo fotoconversione, cellule convertite sarà doppio positivo per Kaede verde e Kaede rosso come recentemente sintetizzato Kaede (verde) della proteina ha accumulato nella cella. - Analizzare i dati utilizzando il software FlowJo o un software simile.
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Representative Results
In primo luogo abbiamo cercato di replicare fotoconversione risultati pubblicati nella letteratura per valutare l'efficienza e determinare l'infiammazione associata nella pelle del mouse. Padiglione auricolare dell'orecchio è stato esposto a 100 mW viola luce (405 nm) per 3 min come precedentemente descritto33. Singola di sospensioni cellulari generate dalla pelle dell'orecchio, o cervicale dLNs immediatamente dopo l'esposizione ha rivelato un'efficienza di conversione di 78% di tutti i CD45+ leucociti nella pelle con celle non convertite osservato in dLNs (Figura 1A). Per valutare la risposta infiammatoria connessa con fotoconversione, abbiamo quantificato i numeri di infiltrazione CD45+ leucociti nelle orecchie convertite 0 e 24 ore post conversione (Figura 1B) e cambiamenti acuti nella permeabilità vascolare come misurato di dosaggio42 (Figura 1). di miglio Brevemente, 200 µ l di 0,5% di blu di Evans era per via intravascolare iniettato 2 h dopo fotoconversione. Le orecchie sono stati raccolti 30 min dopo l'iniezione e il blu di Evans è stata estratta con formammide per 24 h a 55° C (assorbanza leggere a 610 nm42). Entrambi CD45+ si infiltra (24 h) e perdita vascolare (2 h) sono stati aumentati significativamente dopo fotoconversione, che indica che anche a questa breve esposizione, fotoconversione sé può influenzare la risposta infiammatoria del tessuto-specifica. Confronto di CD45+ si infiltra (Figura 1B) e perdita vascolare (1,4 µ g/orecchio ±0.75) in VacV infettati orecchie 24h post infezione41 fornisce il contesto per la misura dell'infiammazione causata da luce viola (0.08 µ g/orecchio ± 0.01).
Mentre diversi modelli sono stati utilizzati in vari studi per monitorare l'uscita del leucocita dai tessuti non linfoidi, periferici, non è chiaro come questi metodi confrontano nella loro capacità di tenere traccia di specifiche popolazioni come escono la pelle. Di conseguenza, abbiamo deciso di eseguire un confronto testa a testa diretto dei due metodi comunemente usati per tenere traccia di uscita DC a LNs, FITC fotoconversione di vernice e in vivo , al fine di valutare l'efficienza e la specificità di ogni metodo per quantitativi analisi d'uscita DC allo steady state, durante l'infiammazione cutanea e da pelle infetta. Per ogni analisi, la pelle era sottoposto ad applicazione transdermica FITC o esposto a 100 mW 405 nm luce in per popolazioni LN DC 3 min sono stati definiti come CD3ε–CD19–+CD11c MHCII+ e ulteriormente stratificati in 1) MHCIICiao CD11cint DCs, che arricchisce per migratori DCs (MDC) entrambi CD103+ BATF3-dipendente croce-che presenta DCs e CD11b+ cutaneo DCs; e 2) MHCIIintCD11cCiao DCs, che arricchisce per residente DCs (rDCs) tra cui CD8α+ BATF3-dipendente Croce-presentando DCs (Figura 2A). 24 h dopo l'applicazione di FITC o fotoconversione, le cellule con etichettate era prontamente rilevabile in drenante ma non non-drenante LNs (Figura 2B). Per misurare il limite di migrazione DC a LNs e contemporaneamente determinare la specificità del metodo per l'etichettatura di migrazione e non residente LN popolazioni, abbiamo quantificato con etichetta MDC e ADR allo steady state, 24 h dopo l'applicazione del DBP, e 48 h dopo VacV scarificazione (Figura 2). Mentre fotoconversione (Kaede) sia FITC etichettati MDC in tutte le condizioni, abbiamo osservato più FITC-etichettato di Kaede-etichetta MDC in dLNs, con l'eccezione di VacV infezione dove i due metodi quantificato un simile livello di uscita. Inoltre, nel contesto del DBP, FITC inoltre etichettati rDC popolazioni dove fotoconversione rimasto specifici di MDC (Figura 2). Usando entrambi i metodi, abbiamo osservato l'uscita di circa 200 DCs da VacV infetta la pelle e soprattutto notato che questo livello d'uscita ricapitola i risultati precedentemente pubblicati mediante applicazione transcutanea FITC Loo et al. 41. così, a seconda del contesto infiammatorio, applicazione transdermica FITC può aumentare i numeri di controller di dominio con etichetta rilevato in dLNs e risultato in contrassegno non specifico delle popolazioni stanziali di LN-residente DC, mentre fotoconversione in particolare identifica DCs cadere in una popolazione di mDC.
Topi di Kaede-Tg sono stati usati per quantificare la ritenzione del leucocita in5,33,43 e l'uscita da5,6,35,38 cutanea, mucosa, e tessuti linfoidi sotto stato stazionario e infiammano condizioni e applicata ai tumori solo in un'unica pubblicazione dove i tumori sono stati impiantati intradermica nelle orecchie da Topolino e photoconverted a piccoli volumi39. Così, abbiamo cercato di valutare l'utilità di fotoconversione in vivo per la quantificazione di uscita del leucocita da affermati, grandi tumori primari per abilitare il test ulteriori ipotesi immunologica. In primo luogo, abbiamo impiantato le cellule del tumore di MC38 per via intradermica in topi di Kaede-Tg tra la scapola sinistra e destra. Impiantabili tumore modelli consentono un posizionamento preciso dei tumori per assicurare il drenaggio linfatico a noto LNs; i tumori collocati nella pelle della tomaia indietro principalmente scarico a sinistra e destra brachiale LNs. Dopo aver raggiunto 100-150 mm3, i tumori erano photoconverted (10 min, 200 mW) e i tumori e dLNs raccolte immediatamente dopo fotoconversione. Analisi di citometria a flusso ha rivelato significativo conversione di intratumoral CD45+ celle da Kaede verde+ a Kaede rosso+ (69%; Figura 3A), mentre la cosa importante, dLNs è rimasto negativo per le cellule Kaede rosso+ . Microscopia di immunofluorescenza dei tumori photoconverted YUMM 1.7 ha rivelato quel fotoconversione penetra in profondità nel tessuto del tumore (> 1 mm; Figura 3B). È interessante notare che, la pelle e le cellule vascolari esprimono alti livelli della proteina Kaede fotoconversione alta l'efficienza di questi tipi di cellule, come si vede nella Figura 3B. Questa espressione di Kaede rosso alta rende difficile identificare le cellule immunitarie (entrambi non convertiti e convertito) usando la microscopia di immunofluorescenza.
Dato il nostro particolare interesse nel campo dell'immunologia del melanoma, successivamente abbiamo valutato l'effetto delle dimensioni del tumore e la melanina sull'efficienza di fotoconversione utilizzando varie linee cellulari di tumore murino impiantabili: MC38 (unpigmented linea del cancro del colon-retto), B16. F10 (produzione di melanina del linea di melanoma), YUMM 1.1 (linea unpigmented melanoma) e YUMM 1.7 (linea unpigmented melanoma)44. Ognuna di queste linee sono stati impiantati intradermica in topi Kaede-Tg e photoconverted, come descritto in precedenza presso i vari volumi del tumore (50-650 mm3). I tumori sono state raccolte subito dopo la fotoconversione e valutati per la presenza di Kaede rosso CD45+ leucociti tramite flusso cytometry. Interessante, l'efficienza di fotoconversione di CD45+ leucociti variavano notevolmente tra i tipi di tumore e le dimensioni (Figura 3). CD45+ leucociti all'interno di piccola (50-150 mm3) tumori YUMM 1.7 e YUMM 1.1 hanno dimostrato la fotoconversione più efficiente al 80% e 60%, rispettivamente. Come per questi tumori è aumentato i volumi, le efficienze di conversione è diminuito a circa il 50% per tumori di grandi dimensioni (> 600 mm3). Melanina ha avuto un notevole impatto sull'efficienza di fotoconversione: massimo fotoconversione per CD45+ cellule all'interno di produzione di melanina B16. F10 tumori era solo circa il 30% e al 10% è sceso come i tumori ha raggiunto volumi di 400 mm3. È interessante notare che, analisi di intratumoral CD8+ T cellule efficienza di fotoconversione rivelata per queste cellule a quasi 80-90% in piccoli tumori indipendentemente dalla produzione di melanina (Figura 3D). Per i tumori unpigmented, CD8+ conversione delle cellule T è rimasto alto anche se i tumori ha raggiunto grandi volumi, ma in diminuzione significativamente con le dimensioni quando la melanina era presente. Come tale, l'utilità di B16. F10 murini melanomi e altre linee di produzione di melanina del melanoma, possono essere limitati a piccoli tumori (50 mm3), che è coerente con la funzione biologica di melanina ad assorbire luce. Per valutare la risposta infiammatoria connessa con la fotoconversione dei tumori, abbiamo quantificato il numero di CD45+ cellule nei tumori non convertiti e tumori convertito 24h post fotoconversione (Figura 3E). Abbiamo non visto nessuna differenza significativa del numero totale di CD45+ cellule rilevate nei tumori 24 h dopo la fotoconversione rispetto ai tumori non convertiti.
Successivamente abbiamo quantificato l'uscita del leucocita da microambienti tumore utilizzando topi Kaede-Tg, che permette per l'interrogatorio di traffico comportamento di entrambi i tipi delle cellule mieloidi e linfoidi. MC38 o YUMM 1.7 le cellule del tumore sono state impiantate per via intradermica in topi Kaede-Tg. I tumori erano photoconverted una volta raggiungono i volumi tra 100-150 mm3 (5 min, 200 mW); brachiale dLNs e inguinale non drenante LNs sono stati raccolti 24 h dopo la fotoconversione. Intratumoral popolazioni leucocitarie sono stati quantificati da MC38 e YUMM 1.7 tumori impiantati nel controllo topi C57Bl/6 e raccolto una volta che i tumori ha raggiunto 100-150 mm3. Abbiamo valutato la complessità del leucocita nei tumori e popolazioni sboccava da citometria a flusso: cellule T (CD3ε+CD4+CD8+ /-), le cellule di B (CD3ε–CD19+), DCs (CD11c++CD11b MHCII+ /- ), i neutrofili (CD11b+MHCII–Ly6G+), macrofagi (CD11b+++F4/80 MHCII) e i monociti infiammatori (CD11b+Ly6G–Ly6C+; Figura 4A). Utilizzando questo stesso schema gating, abbiamo valutato la percentuale di ogni popolazione leucocitaria in dLNs che esprime Kaede rosso che indica la residenza precedente in microambienti del tumore (Figura 4B). È interessante notare che, mentre entrambi MC38 (Figura 4) e YUMM 1.7 (Figura 4) tumori erano principalmente infiltrati con le cellule mieloidi (monociti, DCs e macrofagi), circa il 50% delle cellule che avevano sboccava da entrambi i tipi di tumore sono stati T linfociti (entrambi CD4+ e CD8+). Oltre alle cellule T, inoltre abbiamo osservato DCs, linfociti B, e monociti all'interno delle popolazioni sboccava da tumori ma macrofagi e neutrofili non sono stati rilevati da uno dei due tipi di tumore. Complessivamente, questi dati dimostrano l'utilità di Kaede-Tg fotoconvertibile per tenere traccia delle stirpi multipli del leucocita in un ambiente endogeno. Inoltre, la nostra analisi indica che l'uscita è un processo selettivo e attivo che può avere implicazioni significative per determinare la complessità del leucocita intratumoral.
Figura 1: efficienza di fotoconversione e associati infiammazione pelle murina. Murino derma era photoconverted per 3 min a 100 mW (luce 405 nanometro). (A) rappresentante flusso trame raffigurante photoconverted (Kaede rosso+) CD45+ cellule da un orecchio non convertito e convertito e cervicale dLN fotoconversione immediatamente seguente. Le popolazioni erano pre-gated su live, CD45+ cellule singole. (B) enumerazione di CD45 totale+ cellule nelle orecchie non convertite (-), orecchie raccolte immediatamente seguito fotoconversione, orecchie raccolti 24 h dopo fotoconversione e orecchie raccolti 24 ore dopo l'infezione VacV (n = 3). (C) analisi di un miglio è stata eseguita per quantificare la permeabilità vascolare immediatamente dopo l'esposizione alla luce di 405 nm (3 min., 100 mW). Immagine rappresentativa di perdite in pelle dell'orecchio (a sinistra) e quantificazione degli estratta tintura (a destra) (n = 3). Barre di errore rappresentano SEM. *p< 0.05 e * *p< 0.01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: uscita DC da ingenuo, infiammato e infezione della pelle. (A) schema di Gating per identificare migratori DCs (MDC; MHCIICiaoCD11cint) e residente DCs (ADR; MHCIICiaoCD11cCiao). (B) flusso rappresentanza terreni indicando FITC+ o Kaede rosso+ DCs, pre-gated il MDC, dai topi infettati con VacV (dLN) o controlaterale non drenante LN controlli. (C) quantificazione dei numeri di Kaede rosso+ e MDC FITC+ e ADR in dLNs di stato stazionario, DBP-infiammato (24 h post applicazione) e VacV infettati pelle (infezione di post di 48 h). Barre di errore rappresentano SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: l'efficienza di fotoconversione in microambienti tumore. I tumori erano photoconverted per 10 min a 200 mW (luce 405 nanometro). (A) flusso rappresentanza trame di Kaede verde e in rosso non convertiti e convertiti MC38 tumori e brachiale dLN immediatamente successivo fotoconversione Kaede. Le popolazioni erano pre-gated su live, CD45+ singolo-cellule. (B) microcopy immunofluorescenza dei surgelati, OCT-embedded YUMM 1.7 tumori entrambi non convertiti e photoconverted. Barra della scala = 200 µm. (C) efficienza di conversione di CD45+ leucociti e CD8 (D) + linfociti nella produzione di melanina (B16. F10) e unpigmented (MC38, 1.1 YUMM YUMM 1.7). Ogni punto rappresenta un unico mouse. (E) enumerazione di CD45 totale+ cellule nei tumori non convertiti e tumori photoconverted raccolti 24 h dopo fotoconversione (n = 3). Barre di errore rappresentano SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: uscita del leucocita da microambienti del tumore è selettivo. (A) Gating schema per l'identificazione di popolazioni mieloidi e linfoidi in MC38 dLNs. (B) flusso rappresentanza tracciate identificazione Kaede rosso+ celle tra cellule mieloidi e linfoidi in MC38 dLNs 24h dopo fotoconversione. Percentuali nei diagrammi di flusso indicano la frequenza delle cellule di Kaede rosso+ all'interno della popolazione leucocitaria padre indicato in LNs. (C, D) proporzioni Relative di intratumoral (% di CD45+ cellule) e sboccava (cellule di Kaede rosso+ %; leucociti brachiale dLNs) da MC38 (C, n = 3) e YUMM 1.7 (D, n = 4) tumori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se l'uscita del leucocita dai tessuti periferici, non linfoidi è critico per l'avvio e la risoluzione della risposta immunitaria, i meccanismi molecolari che regolano i servizi esterni sono capiti male. Questa lacuna nella conoscenza è in gran parte a causa della pronta disponibilità di strumenti per la quantificazione in vivo. Qui, descriviamo l'uso di topi fotoconvertibile (Kaede-Tg) a quantificare egress endogeno del leucocita dalla pelle e tumori e fornire un diretto confronto testa a testa con vernice FITC in infiammatorie e modelli di infezione. Dimostriamo che, mentre entrambi i modelli traccia endogeni popolazioni DC, drenaggio libero di FITC e scarso assorbimento dalle cellule non fagocitiche limita l'utilità di vernice FITC per ampia analisi dell'uscita mieloide e linfoidi da tessuti periferici, non linfoidi compreso tumori. Inoltre, presentiamo i dati che indica che l'uscita dai tumori è selettiva, piuttosto che stocastico confermando risultati presentati da Torcellan et al. 39. ulteriori analisi dei meccanismi che regolano in uscita del leucocita dai tumori possono rivelare spaccato romanzo di immunità e infiammazione associati al tumore.
Primo luogo abbiamo valutato l'efficienza di fotoconversione in pelle murina e i suoi effetti su infiammazione locale quando utilizzando impostazioni segnalati nella letteratura. L'esposizione delle orecchie al viola chiaro per 3 min a 100 mW di potenza efficiente fotoconversione di CD45 ha provocato+ cellule all'interno della pelle dell'orecchio (78%) con nessuna conversione in dLNs a valle. Rapporti nella letteratura dimostrano che l'esposizione di 3-5 min è ottima per i tessuti cutanei5,33,38. Tuttavia, questa esposizione ha portato a un numero maggiore di CD45+ cellule nel pinna orecchio 24 h dopo la conversione e perdita vascolare che indica quel fotoconversione queste impostazioni nella pelle dell'orecchio induce l'infiammazione locale, che dovrebbe essere considerato quando interpretazione dei dati. Successiva abbiamo cercato di confrontare direttamente DC tratta di LNs utilizzando sia Kaede fotoconversione e il più largamente utilizzato FITC vernice dosaggio23,24 allo steady-state, durante l'infiammazione indotta da DBP e dalle orecchie VacV infettati. Abbiamo osservato etichettatura elevate in FITC trattati rispetto al photoconverted pelle allo steady state e dopo il trattamento DBP. Applicazione di FITC gratis per la pelle può causare scarico diretto tramite vasi linfatici al drenante LNs dove residente popolazioni DC, che non migrano (ad es., CD8α+ DCs), campione FITC. Coerentemente con questo, abbiamo osservato un numero significativo di ADR con etichetta FITC quando trattati con il DBP irritante. Al contrario, Kaede rosso-etichettato DCs sono stati osservati soltanto in quanto segue di popolazione di mDC fotoconversione che indica quel fotoconversione consente di etichetta MDC in modo più specifico. Anche all'interno della popolazione di mDC, tuttavia, abbiamo osservato quantitativamente più con etichetta MDC quando usando FITC sopra fotoconversione. Mentre questo può anche essere spiegato dal drenaggio FITC libero, è possibile che le differenze nel periodo di etichettatura, dove la fotoconversione può etichettare solo DCs, attualmente residente in pelle mentre FITC rimane nella pelle per tutta la durata del periodo di 24 h , rappresenta le differenze in uscita mDC osservati. È interessante notare che, nel contesto dell'infezione virale, sia fotoconversione e FITC applicazione misurato relativamente uguali livelli di uscita di mDC e pochi FITC+ ADR in LNs drenante orecchie VacV-infettati. Recentemente abbiamo riferito che il drenaggio linfatico è significativamente ridotta dopo l'infezione VacV, e quindi la riduzione virale indotta nel trasporto linfatico può migliorare la specificità della vernice FITC e ridotto etichettatura delle popolazioni di LN residenti DC31 . D'importanza, questo lavoro evidenzia anche il fatto che all'interno della popolazione di mDC (CD3ε–CD19–MHCIICiaoCD11cint), il numero di controller di dominio che attivamente hanno migrato entro 24 h è una popolazione secondaria e quindi totale mDC i numeri non sono un buon surrogato per migrazione attiva41. Infine, è interessante notare che quantifichiamo costantemente mDC uscita a circa 200 cellule per qualsiasi dato 24h periodo seguente VacV infezione41, mentre uscita 1500-2000 DCs da microambienti di tumore. Dato l'enorme efficacia di VacV come una piattaforma di vaccino, particolarmente quando applicato di scarificazione45,46,47, è interessante speculare che è la qualità della DC e forse il tipo di DC che presentano l'antigene, piuttosto che la quantità, che determina un'immunità protettiva robusta.
Uscita del leucocita da microambienti di tumore, di là di DCs25,48, rimane una zona scarsamente studiata. Anche se i tumori sono considerati microambienti cronicamente inflamed, se meccanismi simili regolano cellulare uscita dai tessuti non-maligne e maligni rimane sconosciuta. Inoltre, se l'uscita del leucocita dai tumori è stocastica o piuttosto selettivo avranno implicazioni significative per l'interpretazione del leucocita accumulo e ritenzione in microambienti di tumore. Come tale, uscita del leucocita dai tumori può essere fondamentale per capire come i tumori eludere la sorveglianza immunitaria e portare a nuove strategie per l'immunoterapia. Qui si applica il modello fotoconvertibile Kaede-Tg per studiare in uscita del leucocita da tumori cutanei impiantabili, dove sarebbe insufficiente per vernice FITC largamente etichetta popolazioni sia mieloidi e linfoidi. Gli studi iniziali hanno rivelato che l'efficienza di fotoconversione in tumori impiantati era dipendente sia sulla melanina e dimensioni del tumore. Mentre l'efficienza di fotoconversione si scende rapidamente come i tumori si sviluppano quando la melanina è presente (B16. F10), linee di tumore non pigmentati come i tumori YUMM e MC38 esibiscono più stabile efficienza di conversione attraverso dimensioni dei tumori testati. È interessante notare che, abbiamo osservato l'efficienza di conversione migliorata nel CD8+ scompartimento delle cellule di T rispetto alla CD45+ cellule, che ha rifiutato come tumori è aumentati di formato. Ci sono probabilmente diversi fattori che contribuiscono a questa osservazione. In primo luogo, la posizione all'interno di un tumore avrà un impatto l'esposizione e quindi l'efficienza di conversione di tipi di cellule particolari. Cellule di T sono trovate frequentemente limitato all'interfaccia di tumore di pelle in modelli tumorali impiantabili e così possono essere più facilmente photoconverted rispetto al parenchima del tumore di infiltrazione di cellule mieloidi. In secondo luogo, non tutti i leucociti esprimono gli stessi livelli della proteina Kaede49 e così può non tutti essere ugualmente rilevati mediante citometria a flusso; Questo può condurre per abbassare osservate percentuali di fotoconversione quando si analizza una più eterogenea popolazione di cellule come tutti CD45+ cellule. Infine, è importante notare che i dati presentati nella Figura 3 è stato generato seguente 10 min di esposizione alla luce viola. Questa volta l'esposizione iniziale è stato scelto sulla base dei rapporti nella letteratura citando fotoconversione volte per vari organi tra cui pelle, LNs, tessuti mucosi e tumori5,6,33,35 ,39,43. Solo altro studio che impiegano il sistema di fotoconvertibile in tumori, fotoconversione è stato effettuato per 20 min39. Ulteriore ottimizzazione nelle nostre mani ha rivelato una maggiore efficienza con un tempo di esposizione ridotto di 5 min per piccoli e grandi volumi. È probabile che l'esposizione prolungata conduce al photobleaching di fluorescenza di Kaede, e come tale, nostra efficienze di conversione riportato possono essere sottovaluta. L'esposizione prolungata può anche portare a una maggiore infiammazione associate fotoconversione e confondere i risultati dello studio. Photoconverted tumori per 5 min ha dimostrato che alcuna differenza significativa nel numero di intratumoral CD45+ non cellule 24h dopo fotoconversione rispetto ai tumori non convertiti. Inoltre, la photoconverted di tumori per 5 min ha dimostrato egress misurabile e riproducibile per le popolazioni sia mieloidi e linfoidi. Di conseguenza, ottimizzazione individuale all'interno di specifici tessuti o tumori di interesse è necessario per ottenere risultati ottimali.
Infine, abbiamo usato in situ fotoconversione quantificare egress endogeno del leucocita dai tumori impiantati nei topi di Kaede-Tg. Utilizzando due modelli differenti del tumore impiantabili, non pigmentati abbiamo osservato significativo uscita di DCs, cellule di T e monociti. Coerente con lavoro recentemente pubblicato39, entrambi CD4+ e CD8+ T cellule sboccava da microambienti di tumore insieme a un numero significativo di doppia negazione CD3ε+ T cellule. Almeno un componente di questa popolazione può essere cellule T delta gamma come descritto in precedenza39, anche se il significato funzionale di questa osservazione rimane essere determinato. Cosa importante, quando abbiamo confrontato le proporzioni dei leucociti egressing dai tumori per le proporzioni relative dei leucociti presenti all'interno di microambienti il tumore, abbiamo osservato l'arricchimento del leucocita in popolazioni sboccava relativo intratumoral piscine in entrambi i modelli che indica uscita selettiva del leucocita. In particolare, i macrofagi ed i neutrofili erano assenti in sboccava popolazioni, anche se entrambi i tipi cellulari sono stati descritti per uscita sotto condizioni infiammata e infetto2,50,51,52 , 53 , 54 e sono contributori significativi ai intratumoral del leucocita repertori39,55,56. Così, l'uscita del leucocita dai tumori può essere quantificata utilizzando modelli di fotoconvertibile, non è stocastico ma piuttosto un processo regolato e rimane un'importante e Zito biologia con implicazioni significative per la comprensione infiammatoria e sistema immunitario dinamica in microambienti di tumore allo stato stazionario e in risposta alla terapia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun conflitto di divulgare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Marcus Bosenberg per la fornitura di YUMM 1.1 e linee di melanoma murino YUMM 1.7 e Dr. Deborah J. Fowell per la fornitura di B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr topi in accordo con RIKEN BRC attraverso la Bio-risorsa nazionale di MEXT, Giappone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
References
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