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Biology

Quantification des leucocytes évacuation via les vaisseaux lymphatiques de peau Murine et tumeurs

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58704
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Ici, nous montrons les méthodes in vivo la quantification d’évacuation de leucocytes de naïve, enflammée et peau murine maligne. Nous effectuons une comparaison entre deux modèles : transdermique FITC application et in situ photoconversion. En outre, nous démontrent l’utilité de photoconversion pour le suivi des sorties de leucocytes de tumeurs cutanées.

Abstract

Sortie de leucocytes des tissus périphériques aux ganglions lymphatiques de drainage n’est pas seulement essentiel pour la surveillance du système immunitaire et initiation mais contribue aussi à la résolution des réactions des tissus périphériques. Bien qu’une variété de méthodes sont utilisées pour quantifier l’évacuation de leucocytes de tissus non lymphoïdes, périphériques, les mécanismes cellulaires et moléculaires qui gouvernent contextuel évacuation restent mal compris. Nous décrivons ici l’utilisation de photoconversion de in situ pour l’analyse quantitative d’évacuation de leucocytes de peau murine et tumeurs. Photoconversion permet l’étiquetage direct des leucocytes résidant dans les tissus cutanés. Bien que l’exposition de la peau aux ultraviolets provoque local réponses inflammatoires caractérisent par des infiltrats de leucocytes et de la perméabilité vasculaire, dans une comparaison entre application transdermique des traceurs fluorescents, photoconversion spécifiquement marqué les populations de migrateurs cellules dendritiques et activé simultanément la quantification d’évacuation myéloïde et lymphoïde de micro-environnements cutanées et tumeurs. Les mécanismes d’évacuation des leucocytes restent un élément manquant dans notre compréhension de la complexité des leucocytes intratumorale, et donc l’application des outils décrits dans les présentes fournira un aperçu unique de la dynamique de la tumeur des micro-environnements immunitaires à steady state et en réponse à la thérapie.

Introduction

Réponses immunitaires tissus périphériques sont formés non seulement par le recrutement des leucocytes aux sites d’inflammation, mais aussi par des mécanismes qui régulent leur maintien ultérieur. Ainsi, l’immunité protectrice est dictée par cumulatives mécanismes cellulaires et moléculaires qui déterminent si un leucocyte saisit, séjours au sein, ou plutôt migre dans les tissus périphériques via les vaisseaux lymphatiques. Ce qui est important, la propension des leucocytes à la sortie des tissus par les vaisseaux lymphatiques (appelés egress) est liée à leurs fonctions spécialisées. Les cellules dendritiques (DC) acquièrent un comportement migrateur en réponse aux signaux de maturation conduisant au transport de l’antigène et présentation à drainer des ganglions lymphatiques (RAD), un processus qui est nécessaire à l’immunité adaptative1. Nettoyage des cellules myéloïdes, telles que les macrophages et les neutrophiles, servent à dégager des débris d’apoptose par phagocytose. Au cours de l’infection bactérienne, neutrophiles évacuer les tissus et finalement apoptose dans dLNs2 et dans un modèle de colite induite par le DSS, données soutiennent l’hypothèse que l’évacuation des macrophages est nécessaire à la résolution de l’inflammation locale3. Évacuation des neutrophiles et les macrophages se soit produite dans tous les contextes inflammatoires, cependant, est inconnue. Éléments de preuve pour l’évacuation des lymphocytes T du regime4,5,6,7, infectés8et enflammée4,9,10, 11,12 des tissus périphériques, non lymphoïdes indique que les cellules T recirculer activement, même si les signaux sur tissus qui animent cette sortie restent mal compris. Plusieurs études ont identifié les signaux nécessaires à la migration directionnelle vers capillaires lymphatiques de drainage et ultérieures évacuation y compris ligand chemokine (C-C motif) 21 (CCL21) et son récepteur CCR74,11, 13, ligand chemokine (C-X-C motif) 12 (CXCL12) et son récepteur CXCR42,14et sphingosine-1-phosphate (S1P)10,15,16. Toutefois, ces mécanismes ne sont pas actifs dans tous les contextes, et qu’ils déterminent l’évacuation de tous les types de cellules reste une question ouverte. Ce qui est important, plus les mécanismes qui régissent l’évacuation et sa pertinence fonctionnelle dans la maladie exige que quantitative in vivo des méthodes d’analyse.

Plusieurs méthodes ont été utilisées pour quantifier l’évacuation dans plusieurs modèles animaux in vivo , y compris une canulation directe des vaisseaux lymphatiques, transfert adoptif ex vivo étiqueté leucocytes, application transdermique des traceurs fluorescents, injection de particules marquées et in vivo photoconversion17,,18. Canulation directe des vaisseaux lymphatiques afférents de la souris est difficile et limitée chez de petits animaux par les volumes de liquide pouvant être collectées. Ainsi, canulation a largement été effectuée chez les grands animaux (p. ex.., moutons) où de telles manipulations chirurgicales sont pratiques. Ces études fournissent des preuves directes de la présence de cellules lymphoïdes et myéloïdes dans la lymphe10,19,20. En outre, modèles ovins révèlent que l’inflammation aiguë et chronique ont augmenté de présence de lymphocytes dans les ganglions de presque 100 fois10,21.

Transfert adoptif des lymphocytes étiquetées et génétiquement manipulés a surtout révélé que CCR7 est nécessaire pour l’évacuation des CD4+ T les cellules de5,peau enflammée aiguë11, tandis que le prétraitement des lymphocytes avec la petite molécule agoniste des récepteurs S1P, FTY720, inhibe partiellement leur sortie10. Fait intéressant, l’évacuation des lymphocytes transférés de peau chroniquement enflammée est indépendant du CCR710, mais peut exiger partiellement CXCR49. Expériences de transfert adoptif, cependant, livrer des numéros non physiologiques de ex vivo lymphocytes activés et étiquetées dans les tissus par injection, ce qui altère l’environnement biomécanique des tissus et des pressions élevées de fluide interstitielles qui ouvre les capillaires lymphatiques initiaux et modifier leurs propriétés de transport22. Comme alternative, application transdermique d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) en présence ou en absence d’irritants par voie cutanée (e.g., phtalate de dibutyle, DBP) ou infection23,24 permet le suivi des cellules phagocytaires qui s’accumulent à traceurs et de migrent vers dLNs. De même, tumeurs fluorescent étiquetés fournissent un moyen pour assurer le suivi des cellules phagocytaires qui ont englouti la tumeur matière25. Ces méthodes ont donné un important aperçu les mécanismes qui régissent DC sortie13,14,17,26,27 , mais sont incapables de suivre non phagocytaires lymphocytes et, l’interprétation peuvent être compliquées par drainage lymphatique libre du FITC soluble donc étiquetage non migratrice, LN DCs résidents.

Par ailleurs, la microscopie intravitale est un outil puissant qui permet en vivo suivi des populations de leucocytes physiologiquement pertinentes en temps réel28,29. Utilisé en combinaison avec la souris journaliste et axée sur les anticorps in vivo par immunofluorescence labeling, intravitale microscopie a révélé le complexe spatial et la dynamique temporelle d’immunitaire cellulaire traite, y comprises les migrations interstitielle30 , transmigration à travers l’endothélium lymphatique, le passage dans le lumen lymphatique et la migration sur LN entrée28,31. L’adoption généralisée de techniques d’imagerie intravitale est limitée par la dépense, l’expertise nécessaire pour mettre en place et limité le débit pour quantifier plusieurs types de cellules. Encore, les méthodes quantitatives qui analysent la dynamique des populations de couplage tissus avec imagerie intravitale fournira insight mécanistique supplémentaire et important en ce qui concerne les mécanismes de la motilité et la migration vers et au sein de capillaires lymphatiques 18 , 31 , 32.

Par conséquent, en vivo photoconversion a émergé comme une méthode qui permet d’in situ étiquetage, indépendante de l’activité phagocytaire et la quantification d’évacuation leucocytaire physiologique (lorsqu’il est couplé avec la cytométrie en flux) dans le absence ou présence de défi. Les souris Kaede-Tg expriment constitutivement une protéine isolée de stony corail qui présente une fluorescence verte (Kaede vert) jusqu'à ce que l’exposé à la lumière violette, après quoi il convertit irréversiblement à fluorescence rouge (rouge de Kaede)33. Photoconverted cellules peuvent être suivis comme ils sortir de sites tissulaires périphériques et s’accumulent dans dLNs. Ceci et autres34,des modèles de souris similaires et35 ont révélé importante biologie, y compris la sortie constitutive des lymphocytes T régulateurs de peau36, évacuation des lymphocytes B CXCR4 dépendant de plaques de Peyer37 , la mobilisation des cellules de mémoire résidente T sur le peptide re-défier38et de sortir de leucocyte large du tumeur microenvironnements39. Dans les présentes, nous effectuons une comparaison entre photoconversion avec application FITC transdermique dans le contexte d’inflammation cutanée et d’infection afin de permettre une comparaison directe des données existantes avec la méthode et. En outre, nous montrent photoconversion dans les tumeurs implantés et décrire l’efficacité de conversion et évacuation sélective des micro-environnements tumeur. Par conséquent, nous croyons que davantage l’application de ces méthodes est nécessaires pour élucider la biologie critique d’évacuation de leucocytes de tumeurs, ce qui aura des implications importantes pour l’interprétation de complexité de leucocyte intratumorale, immunité anti-tumorale, et réponse au traitement.

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Protocol

Tous les protocoles d’animaux ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme à l’Oregon Health & Science University et d’institutionnels animalier.

1. l’induction de l’Inflammation et de la peinture FITC de souris Pinna

  1. Dans une hotte à flux laminaire, anesthésier une souris C57Bl/6 en utilisant isofluorane vaporisé (induire à isofluorane de 3 à 5 % et de maintenir à 1-3 % isofluorane ; débit d’oxygène à 0,5-1,0 L/min). Assurer le bonne anesthetization en surveillant la perte du réflexe de pédale, mouvements involontaires et baisse du rythme respiratoire.
  2. Jeter une oreille plate avec la face ventrale de l’oreille vers le haut. Pipeter 20 µL de solution FITC 5 % dissous dans l’acétone de 1:1 : dibutyl phtalate (DBP) à la face ventrale du pavillon de l’oreille. Permettre à l’oreille à sécher pendant quelques secondes.
  3. 24h après l’application de la FITC, euthanasier les souris par l’intermédiaire de dioxyde de carbone exposition suivie de dislocation cervicale. Recueillir les pennes oreille dans PBS en séparant les oreilles de la tête à l’aide de ciseaux. Recueillir le dLNs cervicales et inguinales non drainant LNs dans PBS à l’aide de pinces pour séparer le LNs des tissus environnants. Inguinales non drainant LNs servira de témoins négatifs pour la présence de leucocytes /Kaede rouge+ +de FITC. Disposer des carcasses par le protocole de l’établissement.
    Remarque : La photoconversion de post temps optimal pour l’analyse dépendra du type de cellule et les comportements migratoires connus. Les cellules dendritiques, par exemple, peuvent être détectées dans dLNs plus tôt en tant qu’application de DBP post 6 h.

2. l’induction de l’Inflammation et Photoconversion de souris Pinna

  1. Dans une hotte à flux laminaire, anesthésier une souris Kaede-Tg (contexte C57Bl/6) par injection intrapéritonéale de kétamine 80 mg/kg et 10 mg/kg de xylazine dissous dans une solution saline. Assurer anesthetization adéquate tel que décrit au point 1.1 de l’étape.
  2. Jeter une oreille plate avec la face ventrale de l’oreille vers le haut. Pipeter 20 µL d’une DBP : acétone de 1:1 du côté ventral de la pavillon de l’oreille. Permettre à l’oreille à sécher pendant quelques secondes.
  3. Après application de DBP, couper une fente dans un morceau de papier d’aluminium et tirer l’oreille par le biais de la fente pour exposer l’oreille à la source de lumière violette. Plat l’oreille avec la face dorsale, face vers le haut à l’aide de ruban adhésif double-face pour garantir l’oreille sur la feuille.
  4. Positionner l’oreille directement sous la source lumineuse et photoconvert pendant 3 min à l’aide d’une source lumineuse de 405 nm à puissance de 100 mW.
  5. 24h après photoconversion, euthanasier les souris Kaede-Tg et récolter les pennes de l’oreille et LNs cervicales inguinales LNs comme décrit dans l’étape 1.3.
    Remarque : En plus des considérations citées au point 1.3 de l’étape, le taux de prolifération déterminera le moment de l’analyse que cette perte de Kaede rouge se produit dans les cellules à division rapide.

3. vaccine Infection des souris Pinna et FITC Application

  1. Anesthésier une souris C57Bl/6 avec isofluorane vaporisé comme décrit au point 1.1 de l’étape.
  2. Posez la face ventrale de l’oreille plate. Déposer 5 x 106 formant unités (PFU) du virus de la vaccine (VacV) diluée dans 10 µL de PBS sur le pavillon de l’oreille. À l’aide d’une aiguille de calibre 29, piquez le pavillon 25 fois40.
  3. infection après 24h, anesthésier les souris infectées par VacV avec isofluorane comme décrit dans l’étape 1.1 et pipeter 20 µL 5 % FITC dissous dans l’acétone sur la face ventrale de la pavillon de l’oreille. Permettre à l’oreille à sécher pendant quelques secondes.
  4. 24h après l’application de la FITC, euthanasier les souris et recueillir les pennes de l’oreille, LNs cervicales et inguinales LNs comme décrit dans l’étape 1.3.
    Remarque : FITC peut être appliqué à n’importe quel moment point après l’infection pour déterminer DC traite à divers intervalles de 24 h. Nous avons déjà indiqué que les migrations DC à dLNs sont maintenue à des niveaux similaires de jour 1 à 3 post infection41.

4. vaccine Infection des souris Pinna et Photoconversion.

  1. Anesthésier une souris Kaede-Tg avec isofluorane vaporisé comme décrit au point 1.1 de l’étape.
  2. Infecter le pavillon de l’oreille avec VacV comme décrit dans l’étape 3.2.
  3. infection après 24h, anesthésier les souris infectées par le VacV Kaede comme décrit au point 2.1 et effectuer photoconversion comme décrit aux points 2.3-2.4.
  4. 24h après photoconversion, euthanasier les souris et récolter les pennes de l’oreille et LNs cervicales inguinales LNs comme décrit dans l’étape 1.3.
    Remarque : Comme indiqué ci-dessus dans l’étape 3.4, photoconversion peut être administrée à n’importe quel point après infection de temps.

5. oreille et ganglion de traitement pour la cytométrie en flux

  1. Créer des suspensions de cellules simples de pennes oreille : peler dehors les côtés ventrales et dorsales de la penne d’oreille à l’aide de deux paires de pinces à épiler et place à l’intérieur de l’oreille vers le bas dans les puits d’une plaque de 24 puits contenant 1 mg/mL collagénase D et 80 DNase U/mL dilué dans Hank Buffered Saline Solution (HBSS) (contenant Ca2 + et Mg2 +). Incuber à 37 ° C pendant 30 min. presse les tissus digérés à travers un tamis de cellule de nylon de 70 µm.
  2. Créer des suspensions cellulaires unique de LNs : placer le LNs dans le puits d’une plaque de 24 puits contenant 1 mg/mL collagénase D et 80 DNase U/mL dilué dans HBSS. Taquiner open du ganglion lymphatique capsule à l’aide de deux aiguilles de calibre 29 et puis incuber les ganglions lymphatiques à 37 ° C pendant 30 min. presse les tissus digérés à travers un tamis de cellule de nylon de 70 µm.

6. intradermique mélanome tumeur Implantation et Photoconversion.

  1. Raser la fourrure depuis le centre du dos d’une souris de Kaede-Tg à l’aide d’un rasoir électrique.
  2. Placer une aiguille de calibre 29 au centre du dos entre les omoplates gauche et supérieurs droit et injecter par voie intradermique 5 x 105 cellules tumorales (diluées dans 50 µL de solution saline) dans la peau de souris Kaede-Tg. Les tumeurs doivent être positionnés avec soin pour assurer un drainage lymphatique aux ganglions spécifiés (c.-à-d., gauche et droite brachiale LNs pour les tumeurs placés au milieu de la partie supérieure du dos). Évitez de placer la tumeur au-dessus de rad, car cela peut entraîner photoconversion directe de la LNs par le biais de la tumeur de la peau /.
  3. Laissez les tumeurs atteigne la taille désirée (100-650 mm3).
  4. Un jour ayant précédé le prélèvement de tissus, anesthésier une souris Kaede-Tg comme décrit en 2.1 et raser tout nouvellement repousse fourrure autour de la tumeur.
  5. Découper un trou circulaire dans le papier d’aluminium et tirez la tumeur par exposer la tumeur à la source de lumière. Découper le trou légèrement plus petit que la tumeur afin d’empêcher la tumeur de retomber dans le trou et minimiser la conversion de la peau adjacente, non-tumeur.
  6. Position de la tumeur directement sous la source lumineuse et photoconvert pendant 5 min à l’aide d’une source lumineuse de 405 nm à la puissance 200 mW.
  7. 24h après photoconversion, euthanasier les souris comme décrit dans l’étape 1.3. Recueillir les tumeurs, dLNs brachiale et inguinales non drainant LNs dans PBS. Coupez les tumeurs de la peau environnante, à l’aide de ciseaux et enlevez LNs comme décrit dans l’étape 1.3.

7. tumeur et ganglion de traitement pour la cytométrie en flux

  1. Créer des suspensions de cellules du même les tumeurs : Émincer les tumeurs avec des ciseaux dans des puits d’une plaque de 24 puits contenant 1 mg/mL collagénase D et 80 DNase U/mL dilué dans HBSS. Incuber à 37 ° C pendant 1 h. presse les tissus digérés à travers un tamis en nylon de 70 µm.
  2. Créer la suspension monocellulaire de ganglions lymphatiques comme décrit au point 5.2.

8. les anticorps coloration pour la cytométrie en flux

  1. Après digestion des tissus dans des suspensions de cellules du même, effectuer des techniques de coloration de cytométrie en flux standard pour étiqueter les cellules avec des marqueurs d’intérêt. En bref, déposer 2 x 106 cellules dans une plaque de 96 puits. Incuber les échantillons avec bloc Fc (1 µg/mL) pendant 20 min sur glace ; laver deux fois avec le tampon de FACs (albumine sérique bovine en 1 % dans du PBS). Ajouter live/dé tache (dilué dans du PBS) dans les échantillons et incuber pendant 15 minutes sur la glace ; laver deux fois avec le tampon de FACs. Incuber les anticorps primaire (Table des matières), dilué dans un tampon FACs pendant 30 min sur glace ; laver deux fois avec le tampon de FACs.
    Remarque : Kaede vert et Kaede fluorescence rouge chevauche avec des fluorophores FITC et PE ; FITC et anticorps conjugués PE ne peuvent donc, être utilisés en combinaison avec les protéines de Kaede.
  2. Après coloration, exécuter les exemples sur un cytomètre en flux. Vous pouvez également fixer les cellules avec 2 % PFA.

9. analyse en cytométrie en flux

  1. Régler le FITC (Kaede vert) et le canal de PE (Kaede rouge) tensions PMT à 70-80 % de la plage totale (centre de population à environ 104) utilisation ex vivo Kaede vert ou Kaede rouge monochrome splénocytes ou sang.
    Remarque : Ne compensent pas les vert Kaede (FITC) et les canaux de Kaede rouge (PE) car cela se traduira par le grand signal de se propager.
    1. Pour créer des contrôles de Kaede monochrome, recueillir une rate ou le sang d’une souris de Kaede-Tg. Lyse des globules rouges avec le tampon de l’accusé de réception, puis diviser les cellules en deux groupes : non convertis Kaede vert et convertir Kaede rouge.
    2. Pour unicolores Kaede contrôles rouges, suspendre les cellules dans 1 mL de PBS et photoconvert dans une plaque 24 puits pendant 5 min en utilisant des sources lumineuses une 405 nm à une puissance de 100 mW. Ces cellules permet de définir la Kaede vert (FITC) et Kaede rouges tensions PMT sur le cytomètre (étape 9.1).
  2. Après avoir réglé les tensions pour les protéines de Kaede, compenser pour toutes les autres anticorps primaire les taches à l’aide de simple-fluorophore étiqueté perles de compensation selon les instructions du fabricant.
  3. Exécuter les exemples sur un cytomètre en flux pour collecter les données.
    Remarque : La protéine de Kaede est continuellement produite par les cellules. Cela signifie que 24 h après photoconversion, cellules convertis sera double positif pour Kaede vert et protéine de Kaede rouge comme nouvellement synthétisée Kaede (vert) se sont accumulés dans la cellule.
  4. Analyser les données à l’aide du logiciel FlowJo ou un logiciel similaire.

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Representative Results

Tout d’abord, nous avons cherché à reproduire photoconversion résultats publiés dans la littérature pour évaluer l’efficacité et de déterminer l’inflammation associée à la peau de souris. Le pavillon de l’oreille a été exposé à la lumière de mW violet 100 (405 nm) pour 3 min comme décrit plus haut33. Single des suspensions de cellules produites de la peau de l’oreille ou les cervicales dLNs immédiatement après l’exposition révèle une efficacité de conversion de 78 % de tous les CD45+ leucocytes dans la peau avec aucune cellule convertis chez dLNs (Figure 1 a). Pour évaluer la réponse inflammatoire associée à photoconversion, nous avons quantifié le nombre d’infiltration de CD45+ leucocytes dans oreilles convertis 0 et 24h post conversion (Figure 1 b) et les changements aigus dans la perméabilité vasculaire mesurée par dosage42 (Figure 1). de Mile En bref, 200 µL de 0,5 % était bleu Evans par voie intravasculaire injecté 2 h après photoconversion. Les oreilles ont été prélevés 30 min après l’injection et le bleu Evans a été extraite avec la formamide à 55° C (absorbance lue à 610 nm42) pendant 24 h. Les deux CD45+ s’infiltre (24h) et fuite vasculaire (2 h) ont augmenté considérablement après la photoconversion, ce qui indique que même à cette courte exposition, photoconversion lui-même peut avoir une incidence la réponse inflammatoire du tissu-spécifique. Comparaison de CD45+ s’infiltre (Figure 1 b) et fuite vasculaire (1,4 µg/oreille ±0, 75) dans VacV infecté oreilles 24h post infection41 fournit un contexte pour l’étendue de l’inflammation causée par les ultraviolets (0,08 µg/oreille ± 0,01).

Même si plusieurs modèles ont été utilisés dans les diverses études pour suivre la sortie de leucocytes de tissus non lymphoïdes, périphériques, on ne sait pas comment ces méthodes comparent dans leur capacité à suivre des populations spécifiques lorsqu’ils sortent de la peau. Par conséquent, nous avons décidé d’effectuer une comparaison directe de face à face des deux méthodes couramment utilisées pour suivre la sortie DC à LNs, FITC photoconversion peinture et in vivo , afin d’évaluer l’efficacité et la spécificité de chaque méthode pour quantitative analyse d’évacuation du DC à l’état stable, au cours de l’inflammation cutanée et de la peau infectée. Pour chaque analyse, la peau a été soumise à l’application FITC transdermique ou exposée à la lumière de nm 100 mW 405 pendant 3 min. les populations de LN DC ont été définies comme CD3ε–CD19–MHCII+CD11c+ et encore divisés en 1) MHCIISalut CD11cint DCs, qui enrichit, pour DCs migrateurs (CAM), les deux CD103+ BATF3-dépendante croix-tous les contrôleurs de domaine et CD11b+ DCs cutanées ; et 2) MHCIIintCD11cSalut DCs, qui enrichit pour DCs résidents (CDR), y compris CD8α+ BATF3-dépendante des présentatrices DCs (Figure 2 a). 24h après application FITC ou photoconversion, les cellules marquées étaient facilement détectables à drainer, mais pas non drainant LNs (Figure 2 b). Pour quantifier l’ampleur de la migration de DC à LNs et en même temps déterminer la spécificité de la méthode pour l’étiquetage des populations migratrices et les populations de LN ne résidentes pas, nous avons quantifié Cam étiquetées et CDR à l’état stable, 24 h après l’application de DBP, et 48 h après scarification VacV (Figure 2). Alors que les deux photoconversion (Kaede) et FITC étiqueté Cam dans toutes les conditions, nous avons observé plus marqués au FITC que Kaede marqué Cam dans dLNs, à l’exception de l’infection à VacV où les deux méthodes quantifié un niveau semblable d’évacuation. En outre, dans le contexte de DBP, FITC étiquetés par ailleurs les populations de rDC où photoconversion est restée propre à Cam (Figure 2). À l’aide de ces deux méthodes, nous avons observé l’évacuation d’environ 200 DCs de VacV infectés par la peau et ce qui est important de noter que ce niveau d’évacuation récapitule les résultats publiés précédemment appliquant FITC transdermique par Loo et al. 41. ainsi, selon le contexte inflammatoire, application FITC transdermique peut augmenter le nombre de DCs étiquetées détectés dans dLNs et résultat dans l’étiquetage des non spécifique des populations de DC LN-résident non migrateurs, tout en photoconversion identifie spécifiquement DCs tomber dans une population de mDC.

Les souris Kaede-Tg ont été utilisées pour quantifier la rétention de leucocyte dans5,33,43 et de sortir du5,6,35,38 cutanée, muqueuse, et les tissus lymphoïdes moins steady state et enflamment des conditions et appliquent aux tumeurs que dans une seule publication où les tumeurs ont été implantés intradermique dans les oreilles de souris et de la photoconverted à petits volumes39. Ainsi, nous avons cherché à évaluer l’utilité d’en vivo photoconversion pour la quantification d’évacuation de leucocytes de tumeurs primaires établis, large pour permettre le test immunologique hypothèse plus loin. Tout d’abord, nous avons implanté MC38 des cellules tumorales par voie intradermique dans souris Kaede-Tg entre les omoplates gauche et droite. Implantables tumeur modèles permettent un positionnement précis des tumeurs pour assurer le drainage lymphatique à LNs connus ; tumeurs placés dans la peau de la partie supérieure arrière principalement de drain à gauche et droite brachiales LNs. Après avoir atteint les 100-150 mm3, les tumeurs étaient photoconverted (10 min, 200 mW) et les tumeurs et dLNs récoltées immédiatement après photoconversion. Analyse par cytométrie révélée importante conversion d’intratumorale CD45+ cellules de Kaede vert+ à Kaede rouge+ (69 % ; Figure 3 a), tandis que ce qui est important, dLNs est restée négative pour les cellules de Kaede rouge+ . La microscopie en immunofluorescence des tumeurs photoconverted YUMM 1,7 a révélé que photoconversion pénètre profondément dans le tissu de la tumeur (> 1 mm ; Figure 3 b). Fait intéressant, la peau et les cellules vasculaires expriment des niveaux élevés de la protéine de Kaede menant à photoconversion haute efficacité de ces types de cellules, comme le montre la Figure 3 b. Cette forte expression de Kaede rouge, il est difficile d’identifier les cellules immunitaires (tous deux non convertis et convertis) à l’aide de la microscopie par immunofluorescence.

Compte tenu de notre intérêt particulier en immunologie de mélanome, nous avons ensuite évalué l’effet de la taille de la tumeur et de la mélanine sur l’efficacité de photoconversion à l’aide de diverses lignées de cellules tumorales murines implantables : MC38 (non pigmentées ligne du cancer colorectal), B16. F10 (ligne de mélanome productrices de mélanine), YUMM 1.1 (ligne de mélanome non pigmentées) et YUMM 1.7 (ligne de mélanome non pigmentées)44. Chacune de ces lignées ont été implantés intradermique en souris Kaede-Tg et photoconverted, comme décrit plus haut à divers volumes de tumeur (50-650 mm3). Les tumeurs ont été récoltés à la suite de la photoconversion et évaluées pour la présence de CD45 Kaede rouge+ leucocytes par cytométrie en flux. Fait intéressant, l’efficacité de photoconversion de CD45+ leucocytes variaient considérablement entre les types de tumeurs et les tailles (Figure 3). CD45+ leucocytes au sein petit (50-150 mm3) tumeurs YUMM 1,7 et 1,1 YUMM démontré la photoconversion plus efficace à 80 % et 60 %, respectivement. Comme les volumes ont augmenté pour ces tumeurs, le taux de conversion alimentaire a diminué à environ 50 % pour les grosses tumeurs (> 600 mm3). La mélanine a eu un impact remarquable sur l’efficacité de photoconversion : photoconversion maximale pour CD45+ cellules productrices de mélanine B16. Tumeurs de la F10 était seulement environ 30 % et a chuté à 10 % que les tumeurs ont atteint des volumes de 400 mm3. Fait intéressant, l’analyse d’intratumorale CD8+ T cellules photoconversion a révélé l’efficacité de ces cellules à près de 80 à 90 % dans les petites tumeurs indépendamment de la production de mélanine (Figure 3D). Pour les tumeurs non pigmentées, CD8+ conversion des lymphocytes T est resté élevé alors que les tumeurs ont atteint des volumes importants, mais a diminué significativement en fonction de la taille quand la mélanine était présente. Ainsi, l’utilité de B16. Les mélanomes murins F10 et autres lignes de mélanome productrices de mélanine, peuvent être limitées aux tumeurs de petites taille (50 mm3), qui est compatible avec la fonction biologique de la mélanine en absorbant la lumière. Pour évaluer la réponse inflammatoire associée à la photoconversion des tumeurs, nous avons quantifié le nombre de CD45+ cellules de tumeurs non convertis et convertir les tumeurs 24h post photoconversion (Figure 3E). Nous avons ne vu aucune différence significative dans le nombre total de CD45+ cellules détectées dans les tumeurs 24 h après la photoconversion par rapport aux tumeurs non convertis.

Nous avons ensuite mesuré l’évacuation de leucocytes de micro-environnements tumeur à l’aide de la souris de Kaede-Tg, qui permet à l’interrogatoire du comportement traite de deux types de cellules myéloïdes et lymphoïdes. MC38 ou YUMM 1.7 cellules tumorales ont été implantés par voie intradermique chez des souris de Kaede-Tg. Les tumeurs ont été photoconverted une fois que les volumes ont atteint entre 100-150 mm3 (5 min, 200 mW) ; dLNs brachiale et inguinales non drainant LNs ont été prélevés 24h après la photoconversion. Intratumorale les populations de leucocytes ont été quantifiées de MC38 et tumeurs YUMM 1.7 implanté dans contrôle de souris C57Bl/6 et recueillies une fois les tumeurs atteint 100-150 mm3. Nous avons évalué la complexité de leucocytes dans les tumeurs et les nouvelles populations par cytométrie en flux : les lymphocytes T (CD3ε+CD4+/-CD8+/-), les cellules B (CD3ε–CD19+), DCs (CD11c+MHCII+CD11b+/- ), neutrophiles (CD11b+MHCII–Ly6G+), les macrophages (CD11b+MHCII++de F4/80) et les monocytes inflammatoires (CD11b+Ly6G–Ly6C+; Figure 4 a). Selon ce même schéma de blocage, nous avons évalué le pourcentage de chaque population de leucocyte dans dLNs qui expriment Kaede rouge indiquant la résidence passée sur microenvironnements tumorale (Figure 4 b). Fait intéressant, alors que les deux MC38 (Figure 4) et tumeurs YUMM 1.7 (Figure 4) ont été principalement infiltrées avec les cellules myéloïdes (DCs, monocytes et macrophages), environ 50 % des cellules qui avaient évacué les deux types de tumeur ont été T lymphocytes (les deux CD4+ et CD8+). En plus de cellules T, nous avons également observé des contrôleurs de domaine, les cellules B, et monocytes au sein des nouvelles populations depuis les tumeurs mais les macrophages et les neutrophiles n’ont pas décelés de chaque type de tumeur. Au total, ces données montrent l’utilité de la souris et Kaede-Tg pour le suivi de nombreuses lignées de leucocytes dans un cadre endogène. En outre, notre analyse indique que la sortie est un processus sélectif, actif qui peut avoir des implications importantes pour déterminer la complexité des leucocytes intratumorale.

Figure 1
Figure 1 : efficacité Photoconversion et associés inflammation de peau murine. Derme murine a été photoconverted pendant 3 min à 100 mW (lumière de 405 nm). (A) flux représentatif parcelles représentant photoconverted (Kaede rouge+) CD45+ cellules d’une oreille non converti et convertir rad cervicale photoconversion immédiatement après. Les populations ont été préalablement fermées sur live, CD45+ unique de cellules. (B) dénombrement de CD45 total+ des cellules dans les oreilles non convertis (-), oreilles recueillis immédiatement après les photoconversion, les oreilles recueillies 24h après photoconversion et oreilles recueilli 24 h après l’infection de VacV (n = 3). (C) test d’un mille a été réalisée pour quantifier la perméabilité vasculaire, immédiatement après l’exposition à une lumière 405 nm (3 min, 100 mW). Une image représentative de la fuite dans la peau d’oreille (à gauche) et la quantification de colorant extrait (à droite) (n = 3). Barres d’erreur représentent SEM. *p< 0,05 et **p< 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : sortie DC de naïf, enflammés et infectés par la peau. (A) système de Gating pour identifier les migrateurs DCs (Cam ; MHCIISalutCD11cint) et résidents DCs (CDR ; MHCIISalutCD11cSalut). (B) écoulement représentant parcelles FITC indiquant+ ou Kaede rouge+ DCs, pré gated sur Cam, des souris infectées par le VacV (RAD) ou controlatéral non drainant LN contrôles. (C) Quantification du nombre de Kaede rouge+ et Cam FITC+ et CDR dans dLNs de l’état stationnaire, DBP-enflammée (24h après application) et VacV infecté peau (48 h après infection). Barres d’erreur représentent SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Photoconversion l’efficacité des micro-environnements tumeur. Les tumeurs ont été photoconverted pendant 10 min à 200 mW (lumière de 405 nm). (A) flux représentatif des emplacements de Kaede vert et rouge non convertis et convertis les tumeurs MC38 et rad brachiale immédiatement après photoconversion de Kaede. Les populations ont été préalablement fermées sur live, CD45+ single-cellules. (B) microcopy d’Immunofluorescence de surgelés, OCT-embedded YUMM 1.7 tumeurs les deux non convertis et photoconverted. Echelle = 200 µm. (C) rendement de Conversion de CD45+ leucocytes et CD8 (D) + lymphocytes dans la production de mélanine (B16. F10) et non pigmentées (MC38, 1.1 YUMM YUMM 1.7). Chaque point représente une souris unique. Énumération (E) de CD45 total+ des cellules dans les tumeurs non convertis et photoconverted tumeurs prélevés 24h après photoconversion (n = 3). Barres d’erreur représentent SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : sortie de leucocytes de micro-environnements tumeur est sélective. (A) système de Gating pour identifier les populations myéloïdes et lymphoïdes MC38 dLNs. (B) écoulement représentant parcelles identification Kaede rouge+ cellules, les cellules myéloïdes et lymphoïdes dans MC38 dLNs 24h après photoconversion. Pourcentages dans les parcelles de flux indiquent la fréquence des cellules de Kaede rouge+ dans la population de leucocyte parent indiquée dans les LNs. (C, D) les proportions relatives d’intratumorale (% de CD45+ cellules) et sont sortis (cellules de Kaede rouge+ % ; dLNs brachiale) leucocytes du MC38 (C, n = 3) et YUMM 1.7 (D, n = 4) tumeurs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Bien que l’évacuation de leucocytes de tissus non lymphoïdes périphériques est essentielle pour l’initiation et la résolution des réponses immunitaires, les mécanismes moléculaires qui régissent l’évacuation sont mal compris. Cette lacune dans les connaissances est en grande partie en raison de la disponibilité d’outils permettant la quantification in vivo. Nous décrivons ici l’utilisation de la souris et à quantifier l’évacuation de leucocyte endogène de la peau et des tumeurs et de fournir une comparaison directe entre peinture FITC dans inflammatoire (Kaede-Tg) et modèles de l’infection. Nous démontrons que, tandis que les deux modèles suivre les populations de DC endogènes, libre écoulement du FITC et mauvaise absorption par les cellules non phagocytaires limite l’utilité de peinture FITC large analyse d’évacuation myéloïde et lymphoïde de tissus non lymphoïdes périphériques y compris tumeurs. Par ailleurs, nous présentons les données indiquant que la sortie de ces tumeurs est sélective et non stochastiques, confirmant ainsi les conclusions présentées par Torcellan et al. 39. les investigations ultérieures des mécanismes régissant l’évacuation de leucocytes de tumeurs peuvent révéler roman aperçu de l’inflammation associées à la tumeur et l’immunité.

Tout d’abord, nous avons évalué l’efficacité du photoconversion en peau murine et son effet sur l’inflammation locale quand en utilisant les paramètres rapportés dans la littérature. L’exposition des oreilles au violet lumineux pendant 3 min à puissance de 100 mW a entraîné photoconversion efficace du CD45+ des cellules dans la peau de l’oreille (78 %) avec aucune conversion en dLNs en aval. Rapports dans la littérature montrent que l’exposition de 3-5 min est idéal pour les tissus cutanés5,33,38. Cependant, cette exposition a conduit à un nombre accru de CD45+ des cellules dans le pavillon de l’oreille 24 h après la conversion et la perméabilité vasculaire indiquant que photoconversion à ces paramètres dans la peau de l’oreille provoque une inflammation locale, qui devrait être pris en compte lorsque interprétation des données. Ensuite, nous avons voulu comparer directement DC traite à LNs utilisant Kaede photoconversion et la plus largement utilisée FITC peinture dosage23,24 , à l’équilibre, au cours de l’inflammation induite par le SPD et les oreilles VacV infecté. Nous avons observé de marquage élevée à FITC traités par rapport à la peau de photoconverted à l’état stationnaire et après un traitement DBP. Application du FITC libre pour la peau peut entraîner drainage direct via les vaisseaux lymphatiques au LNs drainants où résident les populations de DC, qui ne migrent pas (par exemple., CD8α+ DCs), goûter FITC. Conformément à cela, nous avons observé un nombre significatif de CDR avec étiquette FITC avec le SPD irritant. En revanche, Kaede rouge marqué DCs ont été seulement observés dans la suite de population mDC la photoconversion indiquant que photoconversion offre un moyen plus précis d’étiquette Cam. Même au sein de la population de mDC, cependant, nous avons observé Cam quantitativement plus marquée lorsque vous l’utilisez FITC sur photoconversion. Tandis que ceci peut aussi s’expliquer par un drainage FITC gratuit, il est possible que les différences dans la période de l’étiquetage, où la photoconversion peut marquer seulement DCs actuellement résident dans la peau tout en FITC reste dans la peau pendant la durée de la période de 24 h , prend en compte les différences dans l’évacuation de mDC observées. Fait intéressant, dans le contexte de l’infection virale, tant photoconversion que demande FITC relativement égal niveau mesuré des mDC évacuation et quelques FITC+ CDR dans le LNs drainant les oreilles infectées par le VacV. Nous avons récemment rapporté que le drainage lymphatique est significativement réduit l’infection VacV suivante, et ainsi la réduction induite par le virus dans le transport lymphatique peut améliorer la spécificité de la peinture FITC et réduit l’étiquetage des populations résidentes de DC LN31 . Ce qui est important, cet ouvrage met également en évidence le fait qu’au sein de la population de mDC (CD3ε–CD19–MHCIISalutCD11cint), le nombre de contrôleurs de domaine qui ont activement migré sous 24h est une population mineure et donc total mDC les numéros ne sont pas un bon substitut pour la migration active41. Enfin, il est intéressant de noter que nous quantifier systématiquement mDC évacuation à environ 200 cellules pour toute donnée 24h période suivant VacV infection41, tandis que l’évacuation de 1500-2000 DCs des micro-environnements tumeur. Compte tenu de la formidable efficacité de VacV comme une plate-forme de vaccin, particulièrement lorsqu’il est appliqué par scarification45,46,47, il est intéressant de spéculer que c’est la qualité du contrôleur de domaine et peut-être du type de DC présentation de l’antigène, plutôt que la quantité, qui détermine l’immunité protectrice robuste.

Évacuation des leucocytes de micro-environnements tumeur, au-delà de DCs25,48, reste une zone mal étudiée. Les tumeurs sont considérées comme des micro-environnements chroniquement enflammées, si des mécanismes similaires régissent évacuation cellulaire des tissus non malignes et malignes reste inconnue. En outre, si l’évacuation de leucocytes de tumeurs est stochastique ou plutôt sélective aura des implications importantes pour l’interprétation d’accumulation de leucocytes et de rétention dans des micro-environnements tumeur. Ainsi, évacuation des leucocytes de tumeurs peut être essentielle pour comprendre comment les tumeurs soustraire surveillance immunitaire et conduisent à de nouvelles stratégies d’immunothérapie. Ici nous utilisons le modèle d’et Kaede-Tg pour étudier l’évacuation des leucocytes implantables tumeurs cutanées, où peinture FITC ne suffirait pas à étiqueter largement les populations tant myéloïdes et lymphoïdes. Les premières études ont révélé que photoconversion efficacité dans les tumeurs implantés était dépendante aussi bien à la mélanine et la taille de la tumeur. Alors que l’efficacité photoconversion dépose rapidement comme les tumeurs se développent lorsque la mélanine est présente (B16. F10), lignes de tumeur non pigmentées telles que les tumeurs YUMM et MC38 présentent l’efficacité de la conversion plus stable dans tailles de tumeur testés. Fait intéressant, nous avons observé l’efficacité de conversion améliorée dans le CD8+ compartiment à lymphocyte T par rapport à CD45+ cellules, qui se sont avérés a augmenté dans la taille des tumeurs. Il y a probables plusieurs facteurs contribuant à cette observation. Tout d’abord, l’emplacement au sein d’une tumeur affectera l’exposition et donc le rendement de conversion de types de cellules particulières. Lymphocytes T sont trouvent souvent limitée à l’interface de tumeur de la peau dans les modèles de tumeur implantables et peuvent donc être plus facilement photoconverted par rapport à des cellules myéloïdes, infiltrant le parenchyme de la tumeur. Deuxièmement, leucocytes pas tous expriment les mêmes niveaux de la protéine de Kaede49 et donc peuvent pas tous être tout aussi détectée par cytométrie de flux ; Cela peut conduire à abaisser les pourcentages observés de photoconversion lors de l’analyse d’une population plus hétérogène de cellules comme CD45 tous les+ cellules. Enfin, il est important de noter que les données présentées à la Figure 3 a été généré après 10 min d’exposition à la lumière violette. Ce temps d’exposition initiale a été choisi sur base des rapports dans la littérature citant photoconversion fois pour divers organes, y compris la peau, LNs, tissus muqueux et tumeurs5,6,33,35 ,39,43. La seule autre étude employant le système et dans les tumeurs, photoconversion a été réalisée pour 20 min39. Optimisation dans nos mains a révélé l’amélioration de l’efficacité avec un temps d’exposition abrégée de 5 min pour les petits et grands volumes. Il est probable qu’une exposition prolongée conduit à Photoblanchiment de la fluorescence de Kaede, et à ce titre, nos rendements de conversion déclarés peuvent être sous-estimés. Une exposition prolongée peut également entraîner une augmentation associée à photoconversion une inflammation et confondre les résultats de l’étude. Tumeurs photoconverted pendant 5 min a démontré qu'aucune différence significative du nombre d’intratumorale CD45+ ne cellules 24h après photoconversion par rapport aux tumeurs non convertis. En outre, la photoconverted de tumeurs pendant 5 min montré sortie mesurable et reproductible pour les populations tant myéloïdes et lymphoïdes. En conséquence, optimisation individuelle au sein des tissus spécifiques ou de tumeurs d’intérêt est nécessaire pour atteindre des résultats optimaux.

Enfin, nous avons utilisé en situ photoconversion de quantifier l’évacuation de leucocyte endogène des tumeurs implantées dans des souris de Kaede-Tg. À l’aide de deux modèles différents tumeur implantables, non pigmenté, nous avons observé la sortie significative des contrôleurs de domaine, les lymphocytes T et les monocytes. Conforme à l’ouvrage récemment publié39, les deux CD4+ et CD8+ T cellules sont sortis des micro-environnements tumorales ainsi qu’un nombre important de double négation CD3ε+ T des cellules. Au moins, une des composantes de cette population peut-être cellules delta T gamma comme décrit précédemment39, bien que la signification fonctionnelle de cette observation reste à déterminer. Ce qui est important, lorsque nous avons comparé les proportions des leucocytes qui de tumeurs à des proportions relatives des leucocytes présents dans les micro-environnements tumeur, nous avons observé enrichissement de leucocytes dans les nouvelles populations par rapport aux piscines intratumorale dans les deux modèles indiquant la sortie de leucocyte sélective. Notamment, les macrophages et les neutrophiles étaient absents dans les nouvelles populations, bien que les deux types de cellules ont été décrits à évacuation sous conditions enflammés et infectés2,50,,du5152 , 53 , 54 et sont des contributeurs importants à intratumorale leucocytes répertoires39,55,56. Ainsi, l’évacuation de leucocytes de ces tumeurs peut être quantifiée à l’aide de modèles et n’est pas stochastique mais plutôt un processus réglementé et reste une importante et sous-étudié biologie ayant des répercussions importantes pour la compréhension inflammatoire et système immunitaire dynamique dans microenvironnements tumeur à l’état stable et dans la réponse au traitement.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit de divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Marcus Bosenberg qui YUMM 1.1 et lignes de mélanomes murins YUMM 1.7 et Dr. Deborah J. Fowell permettant B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr souris en accord avec RIKEN BRC grâce à la Bio-ressource nationale du MEXT, Japon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo

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Steele, M. M., Churchill, M. J., Breazeale, A. P., Lane, R. S., Nelson, N. A., Lund, A. W. Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors. J. Vis. Exp. (143), e58704, doi:10.3791/58704 (2019).

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