Summary
Denne protokol beskriver de generelle processer og kvalitetskontrol kontrol nødvendig for at forberede droplet-baseret, høj overførselshastighed enkelt celle RNA-Seq præparater sunde voksne pattedyr enkelt celler. Sekventering parametre, tilbydes Læs justering og downstream encellede bioinformatic analyse også.
Abstract
Analyse af enkelt celle genekspression på tværs af tusindvis af individuelle celler i et væv eller mikromiljø er et værdifuldt redskab til at identificere celle sammensætning, forskelsbehandling af funktionel stater og molekylær veje underliggende observerede væv funktioner og dyrs adfærd. Isolering af intakt, sund enkelt celler fra voksne pattedyr væv for efterfølgende downstream enkelt celle Molekylær analyse kan dog være udfordrende. Denne protokol beskriver de generelle processer og kvalitetskontrol kontrol er nødvendige for at opnå høj kvalitet voksen enkelt celle præparater fra nervesystemet eller hud der aktiveret efterfølgende upartiske enkelt celle RNA sekvensering og analyse. Retningslinjer for downstream bioinformatic analyse er også tilgængelige.
Introduction
Med udviklingen af high throughput enkelt celle teknologi1,2 og fremskridt i brugervenlige bioinformatik værktøjer over det sidste årti3opstået et nyt felt af høj opløsning gen expression analyse- encellede RNA sekventering (scRNA-Seq). Studiet af enkelt celle genekspression blev først udviklet til at identificere heterogenitet inden for definerede cellepopulationer, såsom i stamceller eller kræftceller, eller til at identificere sjældne populationer af celler4,5, som var uopnåelig ved hjælp af traditionelle bulk RNA sekventering teknikker. Bioinformatic værktøjer har aktiveret identifikation af roman delpopulationer (Seurat)2, visualisering af celler langs en psuedotime plads (Monocle)6, definition af aktiv signaling netværk inden for eller mellem populationer ( NATURSKØNNE)7, forudsigelse af forsamlingen af single-celler i en kunstig 3D space (Seurat, og mere)8. Med disse nye og spændende analyser tilgængelige til det videnskabelige samfund bliver scRNA-Seq hurtigt-den nye standard metode til gen expression analyse.
Trods det enorme potentiale i scRNA-FF., kan tekniske skillsets kræves for at producere en ren datasæt og præcist fortolke resultaterne være udfordrende for nytilkomne. En grundlæggende, men omfattende protokol, startende fra isolering af enkelt celler fra hele primære væv til visualisering og præsentation af dataene til offentliggørelse her præsenteres (figur 1). Først, isolering af sunde enkelt celler kan anses for udfordrende, som forskellige væv varierer i deres grad af følsomhed over for enzymatisk fordøjelse og efterfølgende mekanisk dissociation. Denne protokol giver vejledning i fremgangsmåden isolation og identificerer vigtige kvalitetskontrol checkpoints under hele processen. Andet forståelse kompatibilitet og krav mellem enkelt celle teknologi og næste generation sequencing kan være forvirrende. Denne protokol giver retningslinjer for at gennemføre en brugervenlig, droplet-baserede encellede stregkodesystem platform og udføre sekvensering. Endelig, computerprogrammering er en vigtig forudsætning for analysere encellede transkriptom datasæt. Denne protokol indeholder ressourcer for at komme i gang med programmeringssproget Rasmussen og giver vejledning i implementering af to populære scRNA-Seq-specifikke R pakker. Sammen, kan denne protokol guide nyankomne i udfører scRNA-Seq analyse for at opnå klare og fortolkelige resultater. Denne protokol kan tilpasses de fleste væv i musen, og vigtigere kunne ændres til brug med andre organismer, herunder humane væv. Vil være nødvendigt med korrektioner afhængig af væv og brugeren.
Der er flere overvejelser at huske mens efter denne protokol; herunder, 1) efter alle kvalitetskontrol retningslinjer i trin 1 og 2 i denne protokol er anbefales for at sikre en levedygtig fælles cellesuspension af alle celler i stikprøven af interesse samtidig sikre nøjagtige samlede celle nummer tæller (sammenfattet i figur 2 ). Når dette er opnået, og hvis alle de betingelser, der er optimeret følges, kvalitetskontrol trin kan være faldet (til at spare tid - bevare RNA kvalitet og reducere celle tab). Bekræfter vellykket isolation af høj rentabilitet enkelt celler fra vævet af interesse stærkt anbefale før nogen nedstrøms behandling. 2) da nogle celletyper er mere følsomme end andre til stress, kan overdreven dissociation teknikker uforvarende bias befolkning, derfor confounding downstream analyse. Blid dissociation uden unødvendige cellulære klipning og fordøjelsen er kritisk for at opnå høje cellulære udbytter og en nøjagtig repræsentation af vævssammensætning. Shear styrker forekomme i ændring, FACS og resuspension skridt. 3) som med enhver RNA arbejde, er det bedst at indføre som lidt ekstra RNase i stikprøven som muligt under forberedelse. Dette vil hjælpe med at opretholde høj kvalitet RNA. Bruge ribonuklease-inhibitor løsninger med skylning til ren værktøjer og udstyr, ikke der er RNase-fri, men undgå DEPC-behandlet produkter. 4) udføre præparater så hurtigt som muligt. Dette vil hjælpe opretholde høj kvalitet RNA og reducere celledød. Afhængig af væv dissektion længde og animalske nummer, overveje starter flere dissektioner/præparater samtidig. 5) forberede celler på is, når muligt at opretholde høj kvalitet RNA, reducere celledød og langsom celle signalering og transcriptional aktivitet. Omend iskold forarbejdning er ideel til de fleste celletyper, udfører visse celletyper (fx, neutrofiler) bedre når forarbejdet ved stuetemperatur. 6) undgå calcium, magnesium, EDTA og DEPC-behandlet produkter under celle forberedelse.
Protocol
Alle protokoller er beskrevet her er i overensstemmelse med og godkendes af University of Calgary's Animal Care udvalg.
1. tage væv (dag 1)
- Aflive mus med en overdosis af natrium pentobarbital (i.p., 50 mg/kg) eller eventuelt efter Dyreetik protokol. Derefter Fjern uønskede hår fra ryg og ben af musen, og ethanol-sterilisere region af dissektion.
- Dissekere væv eller mikromiljø af interesse. For denne protokol bruger vi hud og nerve væv til at demonstrere generalizability af droplet stregkodesystem-baserede enkelt celle transcriptomics efter voksent væv dissociation.
- Iskiasnerven, bruge detaljerede protokollen fandt på Stratton et al. 9. kort, skære huden væk fra ryg/ben af mus hind regionen. Gøre et snit langs længden af låret med en steril skalpel klinge. Bruge fine pincet og saks til at afsløre og fjerne iskiasnerven.
- For tilbage huden, bruge detaljerede protokollen fandt på Biernaskie et al. 10. kort, dissekere dorsale tilbage huden ved at gøre indsnit fra skulder til skulder, gump og ned bag ved hjælp af fine pincet og saks. Skære huden i tynde skiver (0,5 cm tykkelse) ved hjælp af en steril skalpel klinge.
- Vask væv 2 gange med iskold HBSS, og fjern uønskede bindevæv, fedtdepoter eller snavs under et dissekere mikroskop.
- For huden dermis kun, flyde skiver i dispase (5 mg/mL, 5 U/mL) i HBSS for 30-40 min. ved 37 ° C. Kirurgisk adskille epidermis fra dermis. Kassér epidermis eller yderligere afstand ved hjælp af trypsin hvis af interesse.
- Hakkekød prøve i 1-2 mm stykker ved hjælp af en steril skalpel vinger og sætte i frisk optøet 2 mg/mL koldt collagenase-IV enzym (2 mg/mL, 125 CDU/mg, i F12 media).
- Nerve, bruge ~ 500 µL pr. 2 x ischiadicus nerver. Til huden, brug ~ 8 mL pr. 1 x musen tilbage hud.
Bemærk: Væv bør være fuldt neddykket i opløsningen collagenase-IV. Det er afgørende at enhver fordøjelse-enzymer er håndteres, oplagres og forberedt korrekt. Hvis enzymer er tilbage ved stuetemperatur i længere tid, vil encellede isolation kræve overdreven mekanisk ændring og nedsætte cellers levedygtighed. Collagenase-IV kan også gøres op i celle kultur medier hvor cellernes levedygtighed er mest optimale. Men dette kunne ændre enzymaktivitet eller transcriptional signatur så bør optimeres af brugeren.
- Nerve, bruge ~ 500 µL pr. 2 x ischiadicus nerver. Til huden, brug ~ 8 mL pr. 1 x musen tilbage hud.
- Inkuber prøven i enzym i et 37 ° C i 30 min med blid ryster hver 10 min. En shaker placeret ved 37 ° C er også et passende alternativ.
- Hakkede med en P1000 pipette 20 - 30 gange på 30 min efter enzym supplement.
- Gentag ændring hvert 30 min, indtil opløsning vises overskyet og bidder af væv er i vid udstrækning adskilles.
Bemærk: Sikre fuld frigivelse af celler (figur 2b, 2 c). For at bekræfte fuld frigivelse, plade celler med Nuc blå (2 dråber pr. 1 mL) og efter 20 min, tjekke under mikroskop for at sikre, at alle kerner er forbundet med enkelt celler i stedet for snavs. Det er afgørende at kontrollere graden af celle overgang inden for en given eksperiment for hver vævstype eller tilstand. I fibrotisk væv (dvs., kronisk skade) eller uskadt voksen væv varierer frigivelse af celler dramatisk fra akut skade eller embryonale væv. Dette er især vigtigt, fordi visse celletyper er mindre tilbøjelige til at frigive fra væv end andre, således fortrinsvis undtagen dem celler fra downstream analyse.- For nerve, adskille væv til 0,5-1,5 timer samlede. For huden, adskille væv til 2 timer alt (i den sidste time af inkubation, tilføje DNase (1 mg/mL) til en hudprøve).
- Filtrer to gange med en 40 µm filter. Skyl filteret med iskold 1% BSA/HBSS.
- Der centrifugeres ved 260 x g i 8 min. Fjern supernatanten.
- Resuspenderes celle i HBSS indeholdende 1% BSA ved hjælp af en wide-bore tip, og Anbring på is. Resuspension volumen er baseret på væv volumen (800 mg våd vægt for hud = 800 µL volumen; 10 mg våd vægt for nerver = 100 µL volumen).
- Eventuelt starte med en lav resuspension volumen og derefter justere efter behov baseret på strømningshastighed (hændelser pr. sekund) på FACS sorteringsanlæg. Den mest effektive form tæthed (maksimere antallet af celler, der opsamlet mens minimalizing tid) til samlinger er 3.000-7.000 hændelser/sekund.
- Hvis du bruger levedygtighed farvestof, tegne en subaliquot for en unstained kontrol. Tilføj derefter 1:15,000 levedygtighed farvestof (stock: 20.000 nM/µL) til stikprøve (1,3 nM/µL endelige koncentration) ved hjælp af en wide-bore tip for at reducere klipning.
Bemærk: Det er afgørende for at kontrollere, om graden af celledød inden for en given eksperiment for hver vævstype eller tilstand. Nogle celletyper i en stikprøve er mere tilbøjelige til at dø end andre dermed udelukkes fortrinsvis fra downstream analyse.- Inkuber prøve med levedygtighed farvestof i 5-10 min. på køl i mørke. Derefter tilsættes 4 mL iskold 1% BSA/HBSS til prøven. Der centrifugeres ved 260 x g for 8 min til at fjerne overskydende levedygtighed farvestof. Behandle subaliquot med ingen levedygtighed hårfarve unstained kontrol på samme måde.
2. isolering af rentable og sunde celler (dag 1)
- Sørg for, at funktionen FACS følger passende fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) parametre.
- Forberede FACS maskine på forhånd for at sikre, at det er klar, når den endelige centrifugeres i trin 1 er fuldført, og sikre, at indsamling rum holdes kolde ved hjælp af isblokke.
- Brug følgende parametre: Flow-hastighed: 1,0 (svarer nogenlunde til 10 µL/min); Filter: 1,5 ND; Dyse størrelse: 100 µm; Forward scatter: 80-180 V (Skift som nødvendigt for at skelne mellem størrelsen af begivenhederne); Side scatter: 150-220 V (Skift som nødvendigt for at kunne skille granularitet/form af begivenhederne); Laser: 100-400 V (Skift som nødvendigt for at skelne levedygtighed farvestof positive vs negative begivenheder & Tjek dette mod nogen levedygtighed farvestof kontrol); Porte: Skift som nødvendigt for at sikre, at alle celler er indsamlet. Se figur 2d-2 g.
Bemærk: FACS parametre er stærkt afhængige af celletyper og sorteringsanlæg ansat og skal derfor være optimeret af brugeren.
- Forberede 15 mL smal-nederste rør med 8 mL iskold 1% BSA/HBSS for eksempel samlinger. Statisk inde i røret og overfladespænding kan påvirke samling effektivitet. Invertere rør før samlinger at sikre grænseflade mellem overfladen af væske og indersiden af røret er fugtig.
Bemærk: Hvis arbejder med meget lav celle numre, justere til lille samling fartøj som passende. - Når alle celler er indsamlet, centrifugeres prøve på 260 x g for 8 min.
Bemærk: Inden centrifugering, tilsættes 1% BSA/HBSS til vask/skubbe celler ned fra side overfladen og inverter/mix røret umiddelbart efter FACS. - Resuspend celle pellet i 1% BSA/HBSS og holde på is. Den maksimale volumen pr. stikprøve, der er kompatibel med trin 3 behandling er 33,8 µL, så sikre, at endelige fortynding/resuspension cellevolumen er hensigtsmæssigt at opnå ideelle celle nummer i 33,8 µL. Andre fortynding media valgmuligheder for dette trin (og alle tidligere fortyndinger på 1% BSA/HBSS) omfatter DMEM, og op til 40% serum, men undgå calcium, magnesium eller EDTA indeholdende reagenser.
- Forlade celler på isen for en minimal mængde tid. Ideelt skal medarbejder forberede alle udstyr og reagenser til de følgende trin (trin 3) under sidste skridt i trin 2.
- Celle forberedelse kritiske kontrol
- Bekræfte skøn over celle numre fra FACS. Afhængigt af vævstype og dissociation kan længder, murbrokker og celler være meget ens i størrelse og form. Således, medmindre en fluorescerende reporter bruges, FACS kan ikke udelukke alle rester. Det anbefales, at en endelig celletal efter FACS collection er udført for at forstå, hvilken procentdel af begivenheder (ifølge FACS) er i virkeligheden celler for en given forberedelse (fig. 2 g). Udføre celletal ved hjælp af en hemocytometer eller automatiseret celle counter (Gentag to gange) og beregne den procentdel af levedygtige celler, som repræsenterer de samlede arrangementer indsamlet efter FACS maskine.
- Validere celle forberedelse. Validere, ingen store partikler (> 100 µm) er til stede, da de kan tilstoppe udstyr i downstream trin. Utilstrækkelig fjernelse af vragdele kan risikerer tilstopning af encellede mikrofluid chip. Plade resterende celler med Nuc blå (som ovenfor) for at sikre ingen store snavs fragmenter er stede. Dette vil også give mulighed for bekræftelse at cellerne er ental (dvs.ikke stikker sammen) at give tillid at downstream enkelt celle genetisk analyse repræsenterer enkelt celler i stedet for flere celler.
- Beslutte på celle numre til sekvens: der er et stort udvalg af voksen væv-afledte celle numre pr. stikprøve, der kan indlæses i systemet med op til 8 prøver, der kan køres ad gangen. Forfatterne har indlæst overalt fra 500-50.000 celler pr. prøve og fået god kvalitet scRNA-Seq datasæt. Mere diskussion om den mest hensigtsmæssige celle numre at indlæse kan findes i afsnittet diskussion. Det endelige output af sekventeret celle tal afhænger stærkt af single-celler isoleret kvalitet. Indlæsning af 10.000 voksne væv-afledte celler kan returnere overalt fra 1.000 til 4.000 sekventeret celler (10-40% afkast). Hvis du er interesseret i sekventering høj celle numre (~ 10.000 celler, det maksimale antal anbefales til dette system), vil derefter lastning 25.000-100.000 celler være påkrævet.
3. GEM (Gel perle i Emulsion) Generation og stregkodesystem (dag 1)
Bemærk: Trin 3-6 i denne protokol er designet til at bruges sammen med de mest almindelige microdroplet-baserede encellede platform, fremstillet af 10 X Genomics. Detaljerede retningslinjer for trin 3 og 4 er skitseret i producentens protokol (henvis til krom enkelt celle 3' protokol)11,12 og skal følges i forbindelse med denne protokol. For de bedste resultater, skal være afsluttet trin 3 umiddelbart efter dissociation (trin 1) og celle isolation (trin 2) skridt på dag 1 i denne protokol.
- Forberede chip ifølge producentens protokol 11,12. Denne microdroplet-baserede encellede platform bruger teknologi at prøver ~ 750.000 stregkoder separat indeksere hver celle transkriptom. Dette opnås ved at inddele celler i Gel perle i emulsioner (ædelstene) hvor genererede cDNA deler en fælles stregkode. Under perle generation, celler leveres så at fleste (90-99%) af genererede perler indeholder ingen celler, mens resten, for det meste, indeholder en enkelt celle.
- Placer chippen i chip indehaveren.
- Forberede celle master mix på is.
- Tilføje 50% glycerol ubenyttede brønde og tilføje 90 µL af celle master mix til godt 1, 90 µL af gel perler til godt 2 og 270 µL af partitionering olie til godt 3.
- Dække chip med pakningen.
- Indlæse chippen og køre i en enkelt celle controller.
- Skubbe bakken, placerer chippen i bakke, trække skuffen, og tryk på Play. En enkelt celle 3' gel perle i en perle omfatter primere, der indeholder en delvis Illumina R1 sekvens (Læs 1 sekventering primer), en 16 nukleotider (nt) 10 x Barcode, 10 nt unikke molekylære id (UMI), og en poly-dT primer sekvens. I tiden, er gel perler i controlleren frigivet og blandet med celle lysate og master mix.
- Indsamle 100 µL af prøven og sted i en PCR rør.
- Sted PCR rør i pre-sæt PCR maskine og køre PCR ifølge kit. Efter inkubationen perler vil omfatte fuld længde, barcoded cDNA fra poly-adenylated mRNA.
- Efter flugt, placere ved-20 ° C natten over i op til 1 uge før forud til næste trin.
4. oprydning, forstærkning, bibliotek opbygning og bibliotek kvantificering (dag 2 og fremefter)
Bemærk: Detaljerede retningslinjer for trin 4 er skitseret i producentens protokol 11,12, og skal følges i forbindelse med denne protokol.
- Bruge silan magnetiske perler fjerne sidesten biokemiske reagenser/primere fra perle reaktionsblandingen.
- Forstærke fuld længde, barcoded cDNA til at generere tilstrækkelig masse til biblioteket byggeri.
- Vurdere DNA udbytte. Før bibliotek konstruktion, vurdere DNA udbytte af prøven. Dette vil afgøre, hvor mange cykler til brug i downstream PCR trin (prøve indeks PCR under bibliotek opbygning). Afhængigt af RNA indholdet af en given prøve, som kan variere afhængigt af aktivering stater (f.eks., kontrol vs såret, osv.), celletype, og celle udbytte, kan anbefalede cyklus antallet ændre.
- For sekventering ~ 3.000 væv-afledte celler (irrelevant for aktivering stater), forfatterne har fundet der 14 cykler (prøver: ~ 10-100 ng DNA) er standard.
- Bruge en Bioanalyzer til DNA-analyse. Refererer til brugeren Guide13.
- Fragment prøve og vælge størrelsen af DNA. Før bibliotek konstruktion, bruge enzymatisk fragmentering og størrelse udvælgelse protokoller til at indhente passende cDNA amplikon størrelse.
- Forberede bibliotek konstruktion prøve. Mens R1 (Læs 1 primer sekvens) er føjet til molekyler under perle inkubation; P5, P7 (en prøve indeks), og R2 (Læs 2 primer sekvens) tilføjes under bibliotek konstruktion.
- Vurdere DNA udbytte. De fleste sekventering faciliteter kræve indgivelse af endelige biblioteker, der indeholder DNA udbytte og kvalitet oplysninger. Herigennem, opstille bioanalyzer efter færdiggørelsen af den hele protokol og før transport til sekvensering facilitet.
- Gemme prøver på-80 ° C i op til 2 måneder.
- Før sekventering, kvantificere prøver ved hjælp af en DNA kvantificering kit. Dette kan gøres på sekventering facilitet.
5. bibliotek sekventering (dag 3 og fremefter)
Bemærk: Den encellede transkriptom stregkodesystem platform, i denne protokol genererer Illumina-kompatible parret-end biblioteker begynder og slutter med P5 og P7 sekvenser. Selvom minimumsdybde skulle løse celletype identitet kan være så få som 10.000-50.000 læser/celle15,16, anbefales ~ 100.000 læser/celle som et optimalt cost-dækning trade-off for voksne in vivo celler (holde øje nogle celle typer eller minimalt aktiveret celle stater vil nå mætning på 30.000-50.000 læser/celle).
- Transportere cDNA-biblioteker på tøris til en sekvensering facilitet udstyret med en passende Illumina sequencer.
- Oplyse følgende til sekvensering anlæg:
- Giver prøve detaljer: prøve indeks id'er svarende til hvert bibliotek; arter; Genomisk database for primære Forsamling (dvs.GRCm38 for mus); elektroferogrammet viser fragment størrelser fra bioanalyzer (mellem 200 og 9.000 bp); cDNA koncentration (ng/µL) og total bibliotek koncentration (samlede udbytter spænder fra 200-1400 ng); volumen (µL) af prøven.
- Give sekventering anmodninger: kvantificere prøver ved hjælp af en DNA kvantificering kit; adapter/Indekstype (TruSeq DNA); plade type (Eppendorf twin.tec, fuld nederdel - anbefales til DNA); Sequencing technology-bibliotek type (10 x, fuld sekventering instruktioner og cyklus anbefalinger)17.
- Køre lavvandede sekventering (valgfri): studier analysere flere biologiske prøver vil drage fordel af samle prøver (akkumulering) for at generere en enkelt gen-stregkode matrix, der indeholder data fra alle prøver. For at minimere batch virkninger mellem prøver når pooling, skal Læs dybde mellem forskellige biblioteker standardiseres. For at gøre dette, en præcis tilnærmelse af enkelt celle numre er nødvendige. MiSeq sequencer vil give mulighed for lavvandede sekvensering og er en omkostningseffektiv og praktisk måde at få nøjagtig celle skøn.
Bemærk: En køre ved hjælp af en MiSeq SR50 sequencer giver tilstrækkelig dækning for at præcist skøn ca 20.000 celler. Kørslen vil tilnærme antallet af UMI inddrives for hver entydig stregkode. I figur 3a, overskriften for et eksempel (prøve 1,6) output (.csv) er vist, notering stregkoder og dens tilsvarende UMI tæller som fastsat af trygt tilknyttede læser.- Rådføre sig med en stationsbetjent at blive fortrolig med R-programmeringssprog. Henvise til DataCamp tutorials for mere information18.
- Vurdere rå data fra sequenceren ved hjælp af den medfølgende R script som en skabelon19. Rådata refererer til antallet af (UMIS) velkommen knyttet til hver entydig celle stregkode. Scriptet læser en .csv-fil, hvor den første kolonne er en liste af stregkoder og anden kolonne er dens tilsvarende UMI tæller. Dette script vil give et plot (figur 3b) samt det anslåede antal barcoded celler i hver prøve. Justere script for at sikre, at den indtastede antal UMI tæller for en given prøve er i den tredjedel af den første stejle drop. I figur 3bfalder denne albue omkring 225 (UMIS) velkommen svarende til 3.480 barcoded celler.
- Sammenlignes med fuld-dybde sekventering ved hjælp af HiSeq (hvor 3,516 celler blev med held sekventeret, figur 3 c), lavvandede sekventering skøn forudsagt 3.480 celler.
- Enten bruge celle opsving tilnærmelser (fra trin 5.3) eller brug opsving diagrammet findes i producentens protokol20 at planlægge lane distribution til dybere sekvensering. Hver prøve skal modtage sammenlignelige dækning, så hvis lavvandede sekventering afslører at der er forskellige antal celler i hver prøve (som det ofte er tilfældet) derefter lane distribution skal beregnes i overensstemmelse hermed. Én HiSeq flow celle (som består af 8 baner) kan sekvens op til 2,4 milliarder brugerdefinerede parrede ende læser. Eksempel flow celle set-up er præsenteret i figur 3d.
6. behandling læse filer
Bemærk: Sequencing en enkelt celle 3' bibliotek ved hjælp af denne protokol genererer rådata i binære base opkald (BCL) format. Den celle Ranger pakke er brugt til at generere tekst-baserede FASTQ filer fra BCL filer, udføre genomisk og transkriptom linjeføringer, gen tæller, demultiplexing og sammenlægning af prøver. I dette afsnit præsenteres de vigtigste skridt, der giver brugerne mulighed at downloade rå BCL data fra en sekventering facilitet og generere filtreret gen-stregkode matricer klar til downstream bioinformatik.
- Bruge en centraliseret server til at køre programmet. BCL filer, FASTQ filer og de fleste af de downstream Bioinformatik behandling kræver stor regnekraft.
- Downloade alle rå Læs filer på serveren (eller FASTQ-filer, hvis de er tilgængelige).
- Rådføre sig med serveradministrator til at oprette en konto på en central server eller en klynge, og til at blive fortrolig med Unix21.
- Bruge en fetch kommando passer til serverens operativsystem til at downloade alle filer fra sekventering facilitetens server.
- De fleste sekventering faciliteter giver en kommando til at hente filer fra en sikker vej, som kan køres fra kommandolinjen (se eksemplet nedenfor).
- Erstatte "< brugernavnet >" og "< adgangskode >" pladsholdere i kommandolinjen med legitimationsoplysninger leveres.
wget - O - "https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/--no-cookies--nr-check-certifikat - post data ' j_username = username & j_password = adgangskode ' | wget--nr-cookies--nr-check-certifikat - post data ' j_username = username & j_password = adgangskode ' - ci -
- Hvis kun en absolut sti til filerne er fastsat (dvs. https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/), skal du indsætte denne sti i en fetch kommando.
- Unzip filer: Hvis downloadet filer slutter med filtypenavnet ".gz", det er blevet komprimeret ved hjælp af kommandoen "gzip". For at lyne, Kør unzip befale i den befale kø (se eksemplet nedenfor).
gunzip raw_read_files.gz - Download den nyeste version af celle Ranger ind på serveren som en selvstændig .tar22.
-
Kritisk: Forud for overførslen, sikre Linuxsystem opfylder minimumskravene23. Sikre et minimum af 8-core Intel processor med 64 GB RAM og 1 TB ledig diskplads.
Bemærk: Celle Ranger giver præ-bygget menneskelige og gnaver reference transcriptomes. Disse kan ændres ved hjælp af cellranger mkref kommando til at opdage gener som normal god landbrugspraksis24.
-
Kritisk: Forud for overførslen, sikre Linuxsystem opfylder minimumskravene23. Sikre et minimum af 8-core Intel processor med 64 GB RAM og 1 TB ledig diskplads.
- Generere FASTQ filer fra sequencer's base opkald filer (BCLs) ved hjælp af kommandoen cellranger mkfastq.
Bemærk: Programmet vil justere rå læsninger (fra FASTQ filer) til en reference genom og generere gen-celle matricer for downstream analyse. Det bruger STAR aligner, der udfører splicing-aware justering af læser til en reference genom. Kun trygt tilknyttede læser (dvs, læser kompatibel med et enkelt gen annotation) bruges til UMI optælling.- For eksempel, bruge kommandoen cellranger mkfastq:
cellranger mkfastq --id = sample_name \
--Kør = / sti/til/prøve \
--csv=csv_file_containing_lane_sample_index.csv
- For eksempel, bruge kommandoen cellranger mkfastq:
- Køre cellranger Grev FASTQ filer genereres ved hjælp af mkfastq til at generere encellede gen tæller.
- For eksempel, bruge kommandoen cellranger tæller:
cellranger tæller --id = sample_name \
--transkriptom = refdata-cellranger-mm10-1.2.0 \
-fastqs = / absolutte/sti/til/fastq/filer \
-prøve = same_sample_name_supplied_to_cellranger_mkfastq \
-localcores = 30
- For eksempel, bruge kommandoen cellranger tæller:
- Multi bibliotek sammenlægning (valgfri): kombinere prøver, samle cellranger antal udgange med cellranger aggr. Dette resulterer i et enkelt gen-stregkode matrix indeholdende data samles fra flere biblioteker. Eksempel cellranger aggr kommando:
cellranger aggr--id = sample_name \
--csv = csv_with_libraryID_ & _path_to_molecule_h5.csv \
--normalisere = kortlagt
Bemærk: Biblioteker kan aggregeres ved hjælp af tre normalisering tilstande (kortlagt, rå, ingen). Tilknyttede anbefales, da det delprøver højere-dybde biblioteker indtil alle biblioteker har lige sekventering dybde25. - Umiddelbare visualisering/analyse af data, skal du importere filen .cloupe (genereres ved hjælp af cellranger tælle eller cellranger aggr) til 10 x lup celle Browser26.
7. avancerede analyse af scRNA-Seq datasæt
Bemærk: En komplet scRNA-Seq værktøjer database kan findes på scRNA-værktøjer3,27. Nedenfor en ramme for uovervåget celle klyngedannelse bruger Seurat2 og pseudotemporal bestilling, ved hjælp af Monocle6. Selvom meget af dette arbejde kan gøres på en lokal computer, antages i følgende trin det at beregningen vil blive afsluttet ved hjælp af en institutionel server.
- Download den nyeste version af Miniconda ind på serverkonto ved hjælp af Linux platform28.
- Installere den nyeste version af R ved hjælp af conda29.
- Plotte data ved hjælp af den medfølgende Seurat R script som en skabelon30.
Bemærk: Seurat er en R-baserede toolkit, der muliggør kvalitetskontroller, klyngedannelse, differential gen expression analyse, markør gen identifikation, dimensionalitet reduktion og visualisering af scRNA-Seq data. En omfattende beskrivelse af Seurat kodning og tutorials kan findes på Satija Lab hjemmeside31. - Plotte data ved hjælp af den medfølgende Monocle R script som en skabelon32.
Bemærk: Monocle er en anden Rasmussen-baserede toolkit, der giver mulighed for visualisering af udtryk ændringer over pseudotime og identificerer gener underliggende celle skæbne beslutninger. En omfattende beskrivelse af Monocle kodning og tutorials kan findes på monokel websted33. - R-pakker som kBET kan anvendes til at teste og rette batch virkninger som følge af sammenlægning datasæt34.
8. NCBI GEO og SRA indsendelser
Bemærk: Da nem adgang til rå sekventering filer sikre reproducerbarhed og reanalyse, er accessioned bidrag til online offentligt tilgængelige repositories anbefalet eller kræves forud manuskript. National Center for bioteknologi Information's (NCBI) gen Expression Omnibus (GEO) og sekvens Læs arkiv (SRA) er offentligt tilgængelige data depoter til høj overførselshastighed sequencing data35,36.
- Tilmeld dig NCBI'S GEO Submitter konto37.
- Komplet GEO indsendelse, som omfatter tre komponenter samlet i en mappe/mappe (titlen som GEO indsenderen Brugernavn): 1) Metadata record (ét regneark pr. projekt indsendelse); 2) rå datafiler; 3) behandlede datafiler.
- Downloade og udfylde Metadata regneark38. Følgende offentlige GEO indgivelse kan bruges som en guide (GSE100320)39. Placere regnearket i mappen.
- Sted rå datafiler genereret fra cellranger Grev script for alle biblioteker i mappen.
- Sted behandlet Data (filer filtrerede barcodes.tsv, genes.tsv og matrix.mtx) genereret fra cellranger Grev script for alle biblioteker i mappen.
- Bruge GEO submitter FTP serverlegitimationsoplysninger til at overføre mappe, der indeholder alle tre komponenter. Nemlig Linux/Unix brugernes: ncftp, lftp, ftp, sftp, og ncftpput kan bruges.
- Advisér GEO for alle overførsler38.
Representative Results
Repertoire af open source-pakker designet til at analysere scRNA-Seq datasæt er steget dramatisk40 med fleste af disse pakker brug Rasmussen-baserede sprog3. Her, repræsentative resultater ved hjælp af to af disse pakker er præsenteret: vurdering af ukontrollerede gruppering af enkelt celler baseret på genekspression, og bestilling af enkelt celler langs en bane for at løse celle heterogenitet og dekonstruere biologiske processer.
Figur 4 illustrerer brugen af Seurat for forbehandling kvalitetskontroller og downstream Bioinformatik analyse. Først, filtrering og fjernelse af afvigende celler fra analyse er afgørende for kvalitet kontrol. Dette blev gjort ved hjælp af violin (figur 4a) og scatter parceller (figur 4b) til at visualisere procentdelen af mitokondrielle gener, antallet af gener (nGene) og antallet af UMI (nUMI) at identificere celle dubletter og outliers. En celle med en klart afvigende antal gener, UMI eller procentdel af mitokondrielle gener blev fjernet ved hjælp af Seurat s FilterCells funktion. Da Seurat bruger vigtigste komponent (PC) analyse score til klynger celler, bestemmelse af statistisk signifikant pc'er til at omfatte er et kritisk skridt. Albue parceller (fig. 4 c) blev brugt til PC udvalg, i hvilke pc'er plateau standardafvigelse for PC akse blev udelukket. Opløsning af klyngedannelse blev også manipuleret viser at antallet af klynger kan ændres, lige fra 0,4 (lav opløsning fører til færre celle klynger, figur 4 d) til 4 (høj opløsning fører til højere celle klynger, figur 4e ). Med lav opløsning er det sandsynligt, at hver klynge repræsenterer et defineret celletype, hvorimod i høj opløsning kan dette også repræsentere undertyper eller midlertidige stater af en celle population. I dette tilfælde blev med lav opløsning klynge indstillinger brugt til yderligere analysere udtryk heatmaps (ved hjælp af Seurat s DoHeatmap funktion) til at identificere de højst højlig udtrykte gener i en given klynge (figur 4f). I dette tilfælde, blev de højst højlig udtrykte gener identificeret ved at vurdere differential udtryk i en given klynge kontra alle andre klynger kombineret, viser at hver klynge entydigt var repræsenteret ved definerede gener. Derudover kan individuel kandidat gener visualiseres på tSNE arealer ved hjælp af Seurat s FeaturePlot funktion (figur 4 g). Dette tilladt for afkodningen, om der var klynger, der repræsenterede makrofager. Ved hjælp af FeaturePlot, fandt vi, at begge klynge 2 og 4 udtryk for Cd68 - en pan-makrofag markør.
Pakken Monocle blev brugt til bekræfter celle klynger identificeres i Seurat og opbygning af celle baner, eller pseudotemporal bestilling, til at sammenfatte biologiske processer (figur 5). Bestilling af pseudotemporal kan bruges til prøver hvor encellede udtryk profiler forventes at følge en biologisk tidsforløb. Celler kan bestilles langs et pseudotemporal kontinuum at løse mellemliggende stater, bifurcation punkter af to alternative celle skæbner, og identificere genet signaturer underliggende erhvervelse af hver skæbne. For det første, der svarer til Seurat filtrering, dårlig kvalitet celler blev fjernet, således at fordelingen af mRNA på tværs af alle celler var log normal og faldt mellem øvre og nedre grænser, som er identificeret i figur 5a. Derefter bruger Monocle's newCellTypeHierarchy funktion, enkelt celler blev klassificeret og tælles ved hjælp af kendte afstamning markørgener (figur 5b, 5 c). For eksempel, blev celler, der udtrykker PDGF receptor alpha eller Fibroblast specifikke Protein 1 tildelt celle Type #1 til at oprette et kriterium for at definere fibroblaster. Næste, denne befolkning (celle Type #1) blev vurderet til at dechifrere fibroblast baner. For at gøre dette, blev Monokels differentieret GeneTest funktion udnyttet, som sammenlignet de celler, der repræsenterer de ekstreme stater inden for befolkningen og fundet differential gener for bestilling af de resterende celler i befolkningen (fig. 5 d). Ved at anvende mangfoldige læringsmetoder (en type af ikke-lineær dimensionalitet reduktion) på tværs af alle celler, blev et koordinat langs en pseudotemporal sti tildelt. Denne bane blev derefter visualiseres ved celle stat (figur 5e) og pseudotime (figur 5f).
Figur 1: Flow chart. Skridt fra hele dyr forberedelse til at analysere enkelt celle RNA-Seq datasæt til indgivelse af endelige datasæt til et offentligt tilgængelige repository. Gel perler i Emulsion (ædelstene) henviser til perler med barcoded oligonukleotider, som indkapsler tusindvis af enkelt celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: at skabe levedygtige enkelt cellesuspension fra nervevæv. (a) tegneserie oversigt over kvalitetskontroller. (b) celler og snavs med celler stadig indarbejdet i snavs (røde pile). (c) celler frigivet fra vragrester (røde pile). (d) celle isolation af FACS. P0: debris fraktion; P1: celle-lignende fraktion; P3: udelukkelse af duplets; P4: levedygtighed farvestof (Sytox Orange) negative brøkdel. (e) ingen levedygtighed farvestof kontrol. (f) billede af P0 brøkdel der repræsenterer isolerede debris. (g) billede af P4 brøkdel der repræsenterer isolerede levedygtige celler (røde pile). (b) (c) (f) og (g) havde nukleare farvestof tilføjet 20 minutter før billeddannelse. Skala barer: 80 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: lavvandede sekventering forudsiger antal gendannede celler i 10 X forarbejdede prøver. (a) et eksempel (prøve 1,6) på MiSeq-genereret csv notering celle stregkoder og dens tilsvarende UMI tæller som fastsat af trygt tilknyttede læser. b stregkode rang plot for prøven 1,6 viser et betydeligt fald i UMI tælle som en funktion af celle stregkoder. Solid og stiplede linjer repræsenterer cutoff mellem celler og baggrund som bestemt ved visuel inspektion. c celle stregkoder observeret ved hjælp af celle Ranger pipeline indlæg-HiSeq afslører lavvandede sekventering præcist tilnærmet antal celler for eksempel 1,6. (d) et eksempel på en flow-celle set-up baseret på lavvandede sekventering afledt celle skøn. For eksempel 1,6, da lavvandede sekventering forudsagt 3480 celler, 1,17 baner blev tildelt til at sikre > 100.000 læser per celle sekventering dækning i HiSeq. Bemærk: Alle baner skal føje til 100%. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kvalitetskontrol og bioinformatik af encellede RNA-Seq datasæt ved hjælp af Seurat R pakke. a parceller af kvalitetskontrol målinger, som omfatter antallet af gener, antallet af unikke molekylære identifikatorer ((UMIS) velkommen) og procentdelen af udskrifter tilknytning til den mitokondrielle genom. b prøve gen observationsområder afsløre celler med afvigende niveauer af mitokondrie udskrifter og (UMIS) velkommen. c prøven albue plot bruges til ad hoc-bestemmelse af statistisk signifikant pc'er. De stiplede og dot-stiplede linjer repræsenterer cutoff hvor en klar "albue" bliver synlige på grafen. PC dimensioner før denne albue er inkluderet i downstream analyse. (d, e) Graf-baseret celle klynger visualiseret på to forskellige beslutninger i en lav-dimensionelle rum ved hjælp af et tSNE plot. (f) top markørgener (gul) for hver klynge visualiseret på et udtryk heatmap Seurat s DoHeatmap funktionen. (g) visualisere markør udtryk for, for eksempel Cd68 genet repræsenterer makrofager (lilla) ved hjælp af Seurat s FeaturePlot funktion. Dette tyder på at klynge 2 og 4 (i panelet d) af dette datasæt repræsenterer makrofager. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: celle kategorisering og bestilling langs peudotemporal bane ved hjælp af Monocle toolkit. a inspicerer distribution af mRNA (udledes fra UMI tæller) på tværs af alle celler i en prøve. Kun celler med mRNA mellem 0 - ~ 20.000 blev brugt til downstream analyse. (b, c) Tildele og tælle celletyper baseret på kendte afstamning celle markører. For eksempel, celler, der udtrykker PDGF receptor alpha eller Fibroblast specifikke Protein 1 var tilknyttet celle Type #1 repræsenterer pan-fibroblaster Monocle's newCellTypeHierarchy funktionen. Antallet af forskellige celletyper kan visualiseres som et cirkeldiagram (b) og som en tabel (c). (d) ved hjælp af celle Type #1 (fibroblaster) som et eksempel, gener bruges til bestilling af celler kan visualiseres ved hjælp af en scatter plot, der viser gen dispersion vs gennemsnitlige udtryk. Den røde kurve viser cutoff for gener bruges til bestilling af beregnede middelværdi-afvigelse model ved hjælp af Monocle's estimateDispersions funktion. Gener, der opfylder denne cutoff blev brugt til downstream pseudotime bestilling. (e, f) Visualisering af celle baner i en reduceret to-dimensionelle rum farvet af cellens "staten" (e), og af Monocle-tildelt "Pseudotime" (f). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol viser hvordan den passende forberedelse af enkelt celler kan afdække den transcriptional heterogenitet af tusindvis af enkelt celler og diskriminere funktionel stater eller unikke cellulære identiteter i et væv. Protokollen kræver ikke fluorescerende reporter proteiner eller transgene værktøjer og kan anvendes til isolering af enkelt celler fra forskellige væv af interesse herunder fra mennesker; holde i sindet hver væv er unikke og denne protokol vil kræve en vis grad af tilpasning/ændring.
De forskelligartede og yderst dynamisk transcriptional programmer inden for celler har fremhævet værdien af encellede genomforskning. Bortset fra isolere høj kvalitet RNA, en kritisk prøve præparationstrin nødvendige for høj kvalitet datasæt er at sikre at cellerne frigives helt fra væv og celler er sund og intakt. Dette er forholdsvis ligetil for indsamling celler, der er let løst, såsom cirkulerende celler eller væv celler bevares hvor løst, såsom i lymfoide væv. Men det kan være udfordrende for andre voksent væv, på grund af den højt udviklede cellulære arkitektur der strækker sig over store afstande, omkring ekstracellulære matrix og ofte stive cytoskeletal proteiner involveret i at opretholde cellestruktur. Selv med passende dissociation teknikker for fuld frigivelse af celler er der mulige at streng og ofte langvarig behandling kræves ville ændre mRNA kvalitet og celle integritet. Derudover påvirke de høje temperaturer bruges til enzym-assisteret dissociation også transcriptional signaturer29,30. Hensigten med protokollen er at præsentere kvalitetskontrol Kontroller, ved hjælp af væv som voksen myelinerede nerve og den ekstracellulære matrix-rige voksen hud, for at demonstrere, hvordan optimering kan hjælpe med at overvinde disse hindringer.
En vigtig overvejelse ved udformningen af enhver scRNA-Seq eksperiment er valget af sekventering dybde. Sekventering kan være yderst multipleksede og læse dybde kan variere fra at være meget lav, ved hjælp af Drop-Seq2 til op til 5 millioner lyder/celle14 ved hjælp af en fuld-længde RNA-Seq metode som Smart-FF. De fleste scRNA-Seq eksperimenter kan registrere moderat til høj udtryk udskrifter med sekventering så lavt som 10.000 læser/celle, som er normalt tilstrækkelig til celle type klassificering41,42. Lavvandede sekventering dybde er af værdi at spare på udgifterne til sekvensering, når de forsøger at afsløre sjældne cellepopulationer på tværs af komplekse væv hvor tusindvis af celler kan være nødvendigt at trygt tilskrive sjældne populationer. Men lavvandede dybde sekventering er ikke tilstrækkelige, når detaljerede oplysninger om genekspression og processer forbundet med subtile transcriptional signaturer er nødvendige. I øjeblikket anslås det, at det store flertal af gener i en celle er fundet med 500.000 læser/celle, men dette kan variere afhængigt af protokollen og væv Skriv43,44. Mens fuld længde udskrift sekventering omgår behovet for forsamlingen og kan derfor afsløre roman eller sjældne splice varianter, begrænse sekventering omkostningerne ofte skalering sådanne tilgange for at undersøge tusindvis af celler, der omfatter et komplekst væv system. Derimod markeret 3' én celle biblioteker som de, der er beskrevet i denne protokol typisk har lavere kompleksitet og kræver lavvandede sekvensering. Det er vigtigt at bemærke, at biblioteker genereret ved hjælp af den beskrevne protokol kan blive sekventeret på en af fem understøttede sequencere: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 hurtige Run og højkapacitet, 4) NextSeq 500/550 og 5) MiSeq.
En alternativ tilgang til enkelt celle RNA-FF., der reducerer behovet for fine vævs- og håndtering endnu bevarer nogle af fordelene ved enkelt celle RNA-FF., er analysen af RNA fra enkelt kerner45. Denne tilgang giver mulighed for hurtig behandling reducerer RNA nedbrydning, og mere ekstreme foranstaltninger for at sikre tilstrækkelig frigivelse af kerner, og dermed sandsynligvis giver mulighed for en mere sikker erobringen af de transcriptional profiler, der repræsenterer alle celler i et givet væv. Dette giver naturligvis kun en del af det transkriptionel aktivitet inden for en given celle, således alt efter hvad eksperimentel mål er af interesse denne fremgangsmåde måske eller måske ikke være passende.
Udover den fuldstændig karakterisering af cellulære identitet inden for en given væv er en af de mest værdifulde analyser for scRNA-Seq datasæt vurdering af mellemliggende transcriptional stater på tværs 'defineret' cellepopulationer. Disse mellemliggende stater kan give indsigt i lineage relationerne mellem celler inden for identificerede populationer, hvilket ikke var muligt med traditionelle bulk RNA-Seq tilgange. Flere scRNA-Seq bioinformatic værktøjer er nu blevet udviklet for at belyse dette. Sådanne værktøjer kan vurdere processer involveret i, for eksempel, kræftceller skiftes til slutbrugeren muterede/metastatisk stamceller modnes til forskellige terminal skæbner eller immunceller shuttling mellem aktiv og inaktiv stater. Subtile transkriptom forskelle i celler kan også være tegn på lineage bias, nyligt udviklede bioinformatic værktøjer som FateID, kan udlede47. Da sondringer mellem skiftes celler kan være vanskeligt at fastslå givet transcriptional forskellene kan være subtile, dybere sekventering kan være nødvendige46. Dækning af en grundt sekventeret bibliotek kan heldigvis øges, hvis du er interesseret i sondering datasæt yderligere af re-løb biblioteket på en anden flow celle.
Tilsammen giver denne protokol en nem at tilpasse arbejdsproces, der gør det muligt for brugerne at transcriptionally profil hundreder til tusinder af single-celler i et eksperiment. Den endelige kvalitet af en scRNA-Seq datasæt bygger på optimeret celle isolation, flowcytometri, cDNA bibliotek generation og fortolkning af rå gen-stregkode matricer. Med henblik herpå giver denne protokol et samlet overblik over alle vigtige skridt, som nemt kan redigeres for at aktivere undersøgelser af forskellige vævstyper.
Disclosures
Ingen oplysninger
Acknowledgments
Vi anerkender personalet på UCDNA tjenester facilitet, samt dyrs pleje facilitet personalet på University of Calgary. Vi takke Matt Workentine for hans støtte i bioinformatik og Jens Durruthy for hans teknisk support. Dette arbejde blev finansieret af et CIHR tilskud (R.M. og JB), en CIHR nye Investigator Award til J.B. og en Alberta børns sundhed Research Institute Fellowship (js).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Products | |||
| RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
| Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
| Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
| Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
| Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
| Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
| Chromium Single Cell 3' reagents | 10x Genomics | ||
| Equipment | |||
| BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
| Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
| Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
| 10X Controller + accessories | 10x Genomics | ||
| Software | |||
| The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/welcome | |
| Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest | |
| R | https://anaconda.org/r/r |
References
- Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation. Nature. 510, 363-369 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015).
- Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database. bioRxiv:206573. , (2018).
- Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage. Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Stratton, J. A., et al. Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).
- 10X Genomics. User Guides. , Available from: https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/ (2018).
- 10X Genomics. Chromium Single Cell 3' Training Module. , Available from: http://go.10xgenomics.com/training-modules/single-cell-gene-expression (2018).
- Agilent. , Available from: https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135 (2018).
- Kolodziejczyk, A. A. Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation. Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343, 776-779 (2014).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).
- 10X Genomics. Sequencing Requirements for Single Cell 3'. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3 (2018).
- Datacamp. Introduction to R. , Available from: https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r (2018).
- Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
- 10X Genomics. User Guides. , Available from: https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/ (2018).
- UNIX Tutorial for Beginners. , Available from: http://www.ee.surrey.ac.uk/Teaching/Unix/ (2018).
- 10X Genomics. Creating a Reference Package with cellranger mkref. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references (2018).
- 10X Genomics. System Requirements. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements (2018).
- 10X Genomics. Software Downloads. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest (2018).
- 10X Genomics. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization (2018).
- 10X Genomics. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial (2018).
- scRNA-tools. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data. , Available from: https://www.scrna-tools.org/ (2018).
- Conda. Downloading conda. , Available from: https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html (2018).
- Anaconda. r / packages / r 3.5.1. , Available from: https://anaconda.org/r/r (2018).
- Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
- Satija Lab. Seurat - Guided Clustering Tutorial. , https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html (2018).
- Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
- Monocle. , Available from: http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/docs/#constructing-single-cell-trajectories (2018).
- Github. An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).
- Edgar, R. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).
- Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. The sequence read archive. Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).
- NIH. GenBank Submission Portal Wizards. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/ (2018).
- NIH. Submitting data. , Available from: https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/ (2018).
- Shah, P. T., et al. Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function. Cell. 173, 1045-1057 (2018).
- Anon, Method of the Year 2013. Nature Methods. 11, 1 (2013).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144, 3625-3632 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96, 313-329 (2017).
- Zeigenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Janes, K. A. Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method. Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).
- Herman, J. S., Sagar,, Grün, D. FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data. Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).
