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Biology

छोटी बूंद Barcoding-आधारित एकल कोशिका Transcriptomics वयस्क स्तनधारी ऊतकों

Published: January 10, 2019 doi: 10.3791/58709
Automatic Translation
*1,2,3, *2, 2, 2, 1,4, 2, 1,4, 1,2,3
1Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary, 4Department of Clinical Neurosciences, Cumming School of Medicine, University of Calgary
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल सामांय प्रक्रियाओं और गुणवत्ता नियंत्रण छोटी बूंद-आधारित, उच्च प्रवाह एकल सेल आरएनए-Seq तैयारी के लिए स्वस्थ वयस्क स्तनधारी एकल कोशिकाओं की तैयारी के लिए आवश्यक जांच का वर्णन करता है । अनुक्रमण पैरामीटर, संरेखण पढ़ें, और बहाव एकल-कक्ष bioinformatic विश्लेषण भी प्रदान की जाती हैं ।

Abstract

एक ऊतक या microenvironment के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के हजारों भर में एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण कोशिका संरचना की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, कार्यात्मक राज्यों के भेदभाव, और आणविक मार्ग निहित मनाया ऊतक कार्य और पशु व्यवहार । तथापि, बरकरार के अलगाव, स्वस्थ एकल कोशिकाओं बाद के बहाव के लिए वयस्क स्तनधारी ऊतकों से एक सेल आणविक विश्लेषण चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस प्रोटोकॉल सामांय प्रक्रियाओं और गुणवत्ता नियंत्रण तंत्रिका तंत्र या त्वचा है कि बाद में निष्पक्ष एकल सेल आरएनए अनुक्रमण और विश्लेषण सक्षम से उच्च गुणवत्ता वयस्क एकल सेल की तैयारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक जांच का वर्णन करता है । बहाव bioinformatic विश्लेषण के लिए दिशानिर्देश भी दिए गए हैं ।

Introduction

उच्च प्रवाह एकल सेल प्रौद्योगिकी के विकास के साथ1,2 और उपयोगकर्ता के अनुकूल bioinformatics उपकरण में प्रगति पर पिछले3दशक, उच्च संकल्प जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के एक नए क्षेत्र में उभरा है- एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण (scRNA-Seq). एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन पहले परिभाषित कोशिका आबादी के भीतर विविधता की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था, जैसे स्टेम सेल या कैंसर की कोशिकाओं में, या कोशिकाओं की दुर्लभ आबादी की पहचान करने के लिए4,5, जो अप्राप्य थे का उपयोग कर पारंपरिक बल्क आरएनए अनुक्रमण तकनीक । Bioinformatic उपकरण उपंयास उप की पहचान-आबादी (Seurat)2, एक psuedotime अंतरिक्ष (Monocle)6, के भीतर या आबादी के बीच सक्रिय संकेतन नेटवर्क की परिभाषा के साथ कोशिकाओं के क्रम के दृश्य सक्षम है ( दर्शनीय)7, एक कृत्रिम 3 डी अंतरिक्ष में एकल कोशिकाओं के विधानसभा की भविष्यवाणी (Seurat, और अधिक)8. वैज्ञानिक समुदाय के लिए उपलब्ध इन नए और रोमांचक विश्लेषण के साथ, scRNA-Seq तेजी से जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए नए मानक दृष्टिकोण बन रहा है ।

scRNA-Seq की विशाल क्षमता के बावजूद, तकनीकी skillsets एक साफ dataset उत्पादन और सही परिणाम की व्याख्या करने के लिए नए चेहरे के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है की आवश्यकता है । यहां, एक बुनियादी, लेकिन व्यापक प्रोटोकॉल, दृश्य और प्रकाशन के लिए डेटा की प्रस्तुति के लिए पूरे प्राथमिक ऊतकों से एकल कोशिकाओं के अलगाव से शुरू प्रस्तुत है (चित्रा 1) । सबसे पहले, स्वस्थ एकल कोशिकाओं के अलगाव चुनौतीपूर्ण समझा जा सकता है, के रूप में विभिंन ऊतकों एंजाइमी पाचन और बाद यांत्रिक पृथक्करण संवेदनशीलता के अपने अंश में बदलती हैं । यह प्रोटोकॉल इन आइसोलेशन चरणों में मार्गदर्शन प्रदान करता है और प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों को पहचानता है । दूसरा, एक सेल प्रौद्योगिकी और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के बीच अनुकूलता और आवश्यकताओं को समझने भ्रमित किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता के अनुकूल, छोटी बूंद-आधारित एकल-कक्ष barcoding प्लेटफ़ॉर्म को कार्यान्वित करने और sequencing निष्पादित करने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है. अंत में, कंप्यूटर प्रोग्रामिंग एकल-कक्ष transcriptomic datasets का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण पूर्वावश्यकता है । यह प्रोटोकॉल r प्रोग्रामिंग भाषा के साथ प्रारंभ करने के लिए संसाधन प्रदान करता है और दो लोकप्रिय scRNA-Seq-विशिष्ट R पैकेज को कार्यान्वित करने पर मार्गदर्शन प्रदान करता है. एक साथ, इस प्रोटोकॉल scRNA-स्पष्ट, व्याख्यात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए Seq विश्लेषण प्रदर्शन में नए चेहरे गाइड कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल माउस में सबसे ऊतकों को समायोजित किया जा सकता है, और महत्वपूर्ण बात यह मानव ऊतक सहित अंय जीवों के साथ प्रयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है । ऊतक और उपयोगकर्ता के आधार पर समायोजन की आवश्यकता होगी ।

इस प्रोटोकॉल का पालन करते समय ध्यान में रखने के लिए कई विचार हैं; सहित, 1) चरणों में सभी गुणवत्ता नियंत्रण दिशा निर्देशों का पालन 1 और इस प्रोटोकॉल के 2 के लिए ब्याज के नमूने के भीतर सभी कोशिकाओं के एक व्यवहार्य एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है, जबकि सटीक कुल सेल संख्या गिनती सुनिश्चित करने ( चित्रा 2 में संक्षेप ). एक बार यह हासिल की है, और अगर सभी अनुकूलित शर्तों का पालन कर रहे हैं, गुणवत्ता नियंत्रण कदम (समय बचाने के लिए शाही सेना की गुणवत्ता और सेल नुकसान को कम करने) को छोड़ दिया जा सकता है । उच्च व्यवहार्यता के सफल अलगाव की पुष्टि ब्याज के ऊतकों से एकल कोशिकाओं को अत्यधिक किसी भी बहाव प्रसंस्करण से पहले की सिफारिश है । 2) के बाद से कुछ कोशिका प्रकार के तनाव के लिए दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील हैं, अत्यधिक पृथक्करण तकनीक अनजाने में जनसंख्या पक्षपात कर सकते हैं, इसलिए बहाव विश्लेषण की स्थापना । अनावश्यक सेलुलर बाल काटना और पाचन के बिना कोमल पृथक्करण उच्च सेलुलर पैदावार और ऊतक संरचना का एक सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । कतरनी बलों trituration, FACS और resuspension चरणों के दौरान होते हैं । 3) किसी भी आरएनए काम के साथ के रूप में, यह सबसे अच्छा के रूप में तैयार करने के दौरान संभव के रूप में नमूना में थोड़ा अतिरिक्त RNase परिचय । यह उच्च गुणवत्ता आरएनए बनाए रखने में मदद करेगा । स्वच्छ उपकरण और किसी भी उपकरण है कि RNase मुक्त नहीं है, लेकिन DEPC इलाज उत्पादों से बचने के लिए धोने के साथ ribonuclease अवरोधक समाधान का प्रयोग करें । 4) जितनी जल्दी हो सके तैयारी करें । यह उच्च गुणवत्ता आरएनए को बनाए रखने और सेल मौत को कम करने में मदद करेगा । ऊतक विच्छेदन लंबाई और पशु संख्या पर निर्भर करता है, एक ही समय में कई विच्छेदन/तैयारी शुरू करने पर विचार करें । 5) बर्फ पर कोशिकाओं को तैयार उच्च गुणवत्ता आरएनए बनाए रखने के लिए संभव है, कोशिका मृत्यु को कम करने, और धीमी गति से सेल संकेतन और transcriptional गतिविधि. हालांकि, बर्फ शीत प्रसंस्करण सबसे सेल प्रकार के लिए आदर्श है, कुछ सेल प्रकार (जैसे, न्यूट्रोफिल) बेहतर प्रदर्शन जब कमरे के तापमान पर संसाधित । 6) सेल की तैयारी के दौरान कैल्शियम, मैग्नीशियम, EDTA, और DEPC-इलाज वाले उत्पादों से बचें ।

Protocol

सभी प्रोटोकॉल यहां वर्णित के अनुसार और कैलगरी पशु देखभाल समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं ।

1. Dissociating ऊतक (Day 1)

  1. Euthanize चूहों सोडियम pentobarbital की अधिक मात्रा के साथ (आईएफसआई, ५० मिलीग्राम/) या के रूप में उपयुक्त पशु आचार प्रोटोकॉल के अनुसार । फिर माउस के पीछे और पैरों से अवांछित बाल निकालें, और इथेनॉल-विच्छेदन के क्षेत्र निष्फल ।
  2. काटना के ऊतक या microenvironment । इस प्रोटोकॉल के लिए, हम त्वचा और तंत्रिका ऊतकों का उपयोग करने के लिए छोटी बूंद barcoding-आधारित एकल कोशिका transcriptomics निंनलिखित वयस्क ऊतक पृथक्करण की सामान्यता प्रदर्शित करता है ।
    1. sciatic तंत्रिका के लिए, विस्तृत स्ट्रैटन एट अल में पाया प्रोटोकॉल का उपयोग करें । 9. संक्षेप में, त्वचा के पीछे के हिंद क्षेत्र से दूर काट माउस के/ एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड के साथ जांघ की लंबाई के साथ एक चीरा बनाओ । बेनकाब और sciatic तंत्रिका को दूर करने के लिए ठीक संदंश और कैंची का प्रयोग करें ।
    2. वापस त्वचा के लिए, विस्तृत Biernaskie एट अल में पाया प्रोटोकॉल का उपयोग करें । 10. संक्षेप में, काटना कंधे से कंधे तक चीरा बनाने, रुंप में और नीचे ठीक संदंश और कैंची का उपयोग कर वापस नीचे त्वचा पृष्ठीय वापस । एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग पतले स्लाइस (०.५ cm मोटाई) में त्वचा में कटौती ।
  3. 2 बार बर्फ ठंडा HBSS के साथ ऊतक धोने, और एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत अवांछित संयोजी ऊतक, वसा जमा या मलबे को हटा दें ।
    1. त्वचा dermis केवल के लिए, dispase में स्लाइसें फ्लोट (5 मिलीग्राम/एमएल, 5 U/एमएल) HBSS में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30-40 मिनट के लिए । शल्य चिकित्सा dermis से एपिडर्मिस अलग । एपिडर्मिस या आगे अलग कर देना का प्रयोग trypsin का उपयोग कर त्यागें ।
  4. एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर 1-2 मिमी टुकड़ों में कीमा नमूना और ताजा-गल 2 मिलीग्राम/एमएल ठंडा collagenase-IV एंजाइम (2 मिलीग्राम/एमएल, १२५ सीडीयू/मिलीग्राम, F12 मीडिया में) में डाल दिया ।
    1. तंत्रिका के लिए, उपयोग ~ ५०० 2x sciatic नसों प्रति µ एल । त्वचा के लिए, का उपयोग करें ~ 8 1x माउस वापस त्वचा प्रति मिलीलीटर ।
      नोट: ऊतकों collagenase-IV समाधान में पूरी तरह से जलमग्न होना चाहिए । यह महत्वपूर्ण है कि किसी भी पाचन एंजाइमों संभाला, संग्रहीत, और उचित रूप से तैयार कर रहे हैं । एंजाइमों समय की लंबी अवधि के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जाता है, तो एकल सेल अलगाव अत्यधिक यांत्रिक trituration की आवश्यकता होगी और सेल व्यवहार्यता को कम । Collagenase-IV भी सेल संस्कृति मीडिया में बनाया जा सकता है जहां सेल व्यवहार्यता सबसे इष्टतम है । हालांकि, यह एंजाइम गतिविधि या transcriptional हस्ताक्षर बदल सकता है तो उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  5. 30 मिनट के लिए एक ३७ ° c स्नान में एंजाइम में नमूने के साथ कोमल मिलाते हुए हर 10 मिनट में मशीन । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा एक शेखर भी एक उपयुक्त विकल्प है ।
  6. Triturate के साथ एक P1000 pipettor 20-30 बार 30 मिनट के बाद एंजाइम इसके अलावा में ।
  7. दोहराएं trituration हर 30 मिनट तक समाधान प्रकट होता है और ऊतकों का हिस्सा काफी हद तक असंबद्ध हैं ।
    नोट: कक्षों की पूर्ण रिलीज़ सुनिश्चित करें (चित्र 2 बी, 2c). पूर्ण रिलीज की पुष्टि करने के लिए, Nuc ब्लू के साथ प्लेट कोशिकाओं (1 मिलीलीटर प्रति 2 बूंदें) और 20 मिनट के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी नाभिक मलबे के बजाय एकल कोशिकाओं के साथ जुड़े रहे हैं । यह एक ऊतक प्रकार या शर्त के लिए एक दिए गए प्रयोग के भीतर सेल रिहाई की डिग्री की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । fibrotic ऊतक में (यानी, पुरानी चोट) या घायल वयस्क ऊतक, कोशिकाओं की रिहाई के नाटकीय रूप से तीव्र चोट या भ्रूण ऊतक से भिन्न हो जाएगा. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि कुछ प्रकार के सेल को दूसरों की तुलना में ऊतक से रिलीज होने की संभावना कम होती है, इस प्रकार इस संदर्भ में बहाव विश्लेषण से उन कोशिकाओं को छोड़कर ।
    1. तंत्रिका के लिए, अलग कर देना ऊतक 0.5-1.5 घंटे के लिए कुल । त्वचा के लिए, 2 घंटे कुल के लिए अलग कर देना ऊतक (मशीन के अंतिम घंटे में, त्वचा के नमूने के लिए DNase (1 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें ।
  8. ४० µm फ़िल्टर के साथ दो बार फ़िल्टर करें । बर्फ के साथ फिल्टर कुल्ला-ठंडा 1% BSA/HBSS ।
  9. 8 मिनट के लिए २६० x g पर केंद्रापसारक । उसके बाद supernatant निकालें ।
    1. एक विस्तृत बोर टिप का उपयोग BSA 1% युक्त HBSS में सेल गोली resuspend, और बर्फ पर जगह है । resuspension मात्रा ऊतक की मात्रा पर आधारित है (८०० मिलीग्राम गीला वजन त्वचा के लिए = ८०० µ l volume; नसों के लिए 10 मिलीग्राम गीला वजन = १०० µ l volume) ।
    2. वैकल्पिक रूप से, एक कम resuspension मात्रा के साथ शुरू और फिर FACS सॉर्टर पर प्रवाह दर (प्रति सेकंड की घटनाओं) के आधार पर आवश्यक के रूप में समायोजित करें । सबसे कुशल प्रकार घनत्व (एकत्र कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम जबकि minimalizing समय) संग्रह के लिए 3000-7000 घटनाओं/
  10. यदि व्यवहार्यता डाई का उपयोग कर, बाहर एक दाग नियंत्रण के लिए एक subaliquot ले । फिर 1:15000 व्यवहार्यता डाई (स्टॉक: २०,००० एनएम/µ एल) के लिए नमूना (१.३ एनएम/µ एल अंतिम एकाग्रता) एक व्यापक बोर टिप का उपयोग करने के लिए कतरनी कम जोड़ें ।
    नोट: यह एक ऊतक प्रकार या हालत के लिए दिए गए प्रयोग के भीतर कोशिका मृत्यु की डिग्री के लिए जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक नमूने के भीतर कुछ सेल प्रकार और अधिक दूसरों की तुलना में मरने की संभावना है, इस प्रकार है तरजीही बहाव विश्लेषण से बाहर रखा जा रहा है ।
    1. अंधेरे में बर्फ पर 5-10 मिनट के लिए व्यवहार्यता डाई के साथ नमूना मशीन । उसके बाद 4 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा 1% BSA/HBSS के लिए जोड़ें । 8 मिनट के लिए २६० x जी पर केंद्रापसारक अतिरिक्त व्यवहार्यता डाई हटाने के लिए । कोई व्यवहार्यता के साथ subaliquot इलाज एक ही तरीके से दाग नियंत्रण डाई ।

2. अलग व्यवहार्य और स्वस्थ कोशिकाओं (1 दिन)

  1. सुनिश्चित करें कि FACS सुविधा उपयुक्त प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) पैरामीटर निंनानुसार है ।
    1. अग्रिम में FACS मशीन तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह एक बार चरण 1 में अंतिम केंद्रापसारक पूरा हो गया है तैयार है, और सुनिश्चित करें कि संग्रह डिब्बे ठंड बर्फ ब्लॉकों का उपयोग कर रखा है ।
    2. निम्न पैरामीटर का उपयोग करें: प्रवाह दर: १.० (लगभग 10 µ l/ फ़िल्टर: १.५ एनडी; नोजल आकार: १०० µm; फॉरवर्ड स्कैटर: ८०-१८० वी (घटनाओं के आकार को अलग करने के लिए आवश्यक के रूप में परिवर्तन); साइड स्कैटर: १५०-२२० वी (आवश्यक के रूप में परिवर्तन की घटनाओं की दानेदार/ लेजर: १००-४०० V (आवश्यक के रूप में बदलने के लिए व्यवहार्यता डाई सकारात्मक बनाम नकारात्मक घटनाओं को भेद करने के & कोई व्यवहार्यता डाई नियंत्रण के खिलाफ यह जांच); गेट्स: सभी कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक के रूप में परिवर्तन एकत्र कर रहे हैं । 2जी 2 चित्रदेखें ।
      नोट: FACS पैरामीटर सेल प्रकार और सॉर्टर कार्यरत है और इसलिए उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता पर अत्यधिक निर्भर हैं ।
  2. तैयार 15 मिलीलीटर संकीर्ण-बर्फ के 8 मिलीलीटर के साथ नीचे ट्यूबों-ठंडा 1% BSA/HBSS नमूना संग्रह के लिए । स्थिर अंदर ट्यूब और सतह तनाव संग्रह दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं । तरल की सतह और ट्यूब के अंदर के बीच इंटरफेस सुनिश्चित करने के लिए संग्रह से पहले ट्यूबों उलटा नम है ।
    नोट: यदि बहुत कम सेल नंबर के साथ काम कर रहे हैं, उपयुक्त के रूप में छोटे संग्रह पोत को समायोजित करें ।
  3. एक बार सभी कोशिकाओं को एकत्र कर रहे हैं, 8 मिनट के लिए २६० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
    नोट: इससे पहले कि केंद्रापसारक, जोड़ें 1% BSA/HBSS की ओर सतह से नीचे पुश कोशिकाओं और पलटना/FACS के तुरंत बाद ट्यूब मिश्रण ।
  4. 1% BSA/HBSS में सेल गोली resuspend और बर्फ पर रखो । चरण 3 संसाधन के साथ संगत है प्रति नमूना अधिकतम वॉल्यूम ३३.८ µ l है, इसलिए सुनिश्चित करें कि अंतिम सेल कमजोर पड़ने/निलंबन की मात्रा ३३.८ µ l में आदर्श कक्ष संख्या प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है । अंय कमजोर पड़ने के इस चरण के लिए मीडिया विकल्प (और 1% BSA/HBSS में सभी पिछले कमजोर पड़ने) DMEM शामिल हैं, और अप करने के लिए ४०% सीरम, लेकिन कैल्शियम से बचने, मैग्नीशियम, या EDTA युक्त एजेंट ।
    1. समय की एक ंयूनतम राशि के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को छोड़ दें । आदर्श सह कार्यकर्ता चरण 2 के अंतिम चरण के दौरान निंन चरण (चरण 3) के लिए सभी उपकरण और रिएजेंट तैयार करना चाहिए ।
  5. सेल की तैयारी अहम चेक
    1. FACS से प्राप्त कक्ष संख्याओं के अनुमानों की पुष्टि करें । ऊतक प्रकार और पृथक्करण लंबाई, मलबे और कोशिकाओं के आधार पर बहुत आकार और आकार में समान हो सकता है । इस प्रकार, जब तक एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रयोग किया जाता है, FACS सभी मलबे को बाहर नहीं कर सकते । यह सिफारिश की है कि एक अंतिम सेल गिनती के बाद FACS संग्रह की घटनाओं का क्या प्रतिशत समझने के लिए प्रदर्शन किया है (FACS के अनुसार) एक दिया तैयारी के लिए वास्तव में कोशिकाओं में है (चित्रा 2 जी) । एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर (दो बार दोहराने) का उपयोग कर सेल गिनती प्रदर्शन और FACS मशीन के अनुसार एकत्र कुल घटनाओं के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है कि व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना ।
    2. सेल तैयारी मांय करें । सत्यापित करें कि कोई बड़े कणों (> 100 µm) मौजूद है के रूप में वे बहाव चरणों में उपकरण रोकना हो सकता है । मलबे के अपर्याप्त हटाने एकल सेल microfluidic चिप कॉलेस्ट्रॉल जोखिम हो सकता है । प्लेट शेष Nuc नीला (के रूप में ऊपर) के साथ कोई बड़ा मलबा टुकड़े मौजूद है सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं । यह भी पुष्टि है कि कोशिकाओं को एकवचन (यानी, एक साथ चिपके हुए नहीं) के लिए अनुमति देगा विश्वास है कि अनुप्रवाह एकल कोशिका आनुवंशिक विश्लेषण के बजाय कई कोशिकाओं के एकल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है ।
    3. अनुक्रम में कक्ष संख्याओं पर निर्णय लें: वयस्क ऊतक की एक बड़ी रेंज है-नमूने है कि एक समय में चलाया जा सकता है कि अप करने के लिए 8 नमूनों के साथ प्रणाली में लोड किया जा सकता है प्रति कोशिका संख्या व्युत्पंन । लेखकों ५००-प्रति नमूना ५०,००० कोशिकाओं से कहीं भी लोड किया है और अच्छी गुणवत्ता scRNA-Seq डेटासेट प्राप्त की । लोड करने के लिए सबसे उपयुक्त कक्ष संख्याओं के बारे में अधिक चर्चा चर्चा अनुभाग में पाई जा सकती है । अनुक्रम कक्ष संख्याओं का अंतिम आउटपुट पृथक एकल-कक्षों की गुणवत्ता पर काफी निर्भर करता है । १०,००० लोड हो रहा है वयस्क ऊतक-व्युत्पंन कोशिकाओं कहीं भी १,००० से ४,००० अनुक्रम कोशिकाओं (10-40% रिटर्न) के लिए लौट सकते हैं । यदि sequencing उच्च कक्ष संख्याओं (~ १०,००० कक्षों, इस सिस्टम के लिए अनुशंसित अधिकतम संख्या) में रुचि है, तो २५,०००-१००,००० कक्ष लोड करने की आवश्यकता होगी ।

3. मणि (पायस में जेल मनका) जनरेशन और Barcoding (Day 1)

नोट: इस प्रोटोकॉल के चरण 3-6 10x जीनोमिक्स द्वारा निर्मित सबसे आम microdroplet-आधारित एकल-कक्ष प्लेटफ़ॉर्म के साथ संयोजन के रूप में उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं । कदम 3 और 4 के लिए विस्तृत दिशानिर्देश निर्माता के प्रोटोकॉल में उल्लिखित है (क्रोमियम एकल सेल 3 ' प्रोटोकॉल को देखें)11,12 और इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में पालन किया जाना चाहिए । श्रेष्ठ परिणामों के लिए, चरण 3 तुरंत पृथक्करण (चरण 1) और इस प्रोटोकॉल के दिन 1 पर कक्ष आइसोलेशन (चरण 2) चरण के बाद पूर्ण होना चाहिए ।

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार चिप तैयार करें 11, 12. यह microdroplet-आधारित एकल-कक्ष प्लेटफ़ॉर्म तकनीक का उपयोग करता है जो नमूने ~ ७५०,००० बारकोड्स प्रत्येक कक्ष की transcriptome के लिए अलग से अनुक्रमणिका । यह जेल मनका में इमल्शन (जवाहरात) में कोशिकाओं विभाजन जहां उत्पंन सीडीएनए एक आम बारकोड साझा द्वारा हासिल की है । मणि पीढ़ी के दौरान, कोशिकाओं को वितरित कर रहे है इतना है कि उत्पंन रत्न के बहुमत (९०-९९%) कोई कोशिकाओं, जबकि शेष, अधिकांश भाग के लिए, एक ही कक्ष में शामिल हैं ।
    1. चिप धारक में जगह है ।
    2. बर्फ पर सेल मास्टर मिश्रण तैयार करें ।
    3. अप्रयुक्त कुओं के लिए ५०% ग्लिसरॉल जोड़ें और सेल मास्टर मिश्रण के ९० µ एल जोड़ने के लिए अच्छी तरह से 1, ९० जेल मोती के µ एल अच्छी तरह से 2 के लिए, और २७० तेल विभाजन के µ l को ठीक 3 ।
    4. गैसकेट के साथ चिप कवर ।
  2. चिप लोड और एक एकल सेल नियंत्रक में चला रहे हैं ।
    1. ट्रे को बाहर निकालें, ट्रे में चिप लगाएं, ट्रे को वापस लें, और चलाएंदबाएं । एक मणि में एक एकल सेल 3 ' जेल मनका एक आंशिक Illumina R1 अनुक्रम (पढ़ें 1 अनुक्रमण प्राइमर), एक 16 न्यूक्लियोटाइड (nt) 10x बारकोड, एक 10 nt अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (UMI), और एक पाली-डीटी प्राइमरी अनुक्रम युक्त प्राइमरों शामिल हैं । चलाने के दौरान, जेल मोती नियंत्रक में जारी किया और सेल lysate और मास्टर मिश्रण के साथ मिश्रित कर रहे हैं ।
    2. नमूना और एक पीसीआर ट्यूब में जगह के १०० µ एल लीजिए ।
    3. पहले से निर्धारित पीसीआर मशीन में पीसीआर ट्यूब लगाएं और किट के अनुसार पीसीआर चलाएं । गर्मी के बाद, जवाहरात पूर्ण लंबाई, पाली से बारकोड सीडीएनए-adenylated mRNA शामिल होंगे ।
  3. रन के बाद, अगले कदम के लिए पूर्ववर्ती से पहले 1 सप्ताह तक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर जगह ।

4. साफ-अप, प्रवर्धन, पुस्तकालय निर्माण और पुस्तकालय ठहराव (दिन के बाद 2)

नोट: चरण 4 के लिए विस्तृत दिशानिर्देश निर्माता के प्रोटोकॉल 11, 12 में उल्लिखित हैं, और इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में किया जाना चाहिए ।

  1. silane चुंबकीय मोती का प्रयोग करें मणि प्रतिक्रिया मिश्रण से बचे हुए जैव रासायनिक रिएजेंट/
  2. पूर्ण लंबाई बढ़ाना, बारकोड सीडीएनए पुस्तकालय निर्माण के लिए पर्याप्त जन उत्पन्न करने के लिए ।
  3. डीएनए उपज का आकलन करें । पुस्तकालय निर्माण से पहले, नमूना के डीएनए उपज का आकलन करें । यह निर्धारित करेगा कि कितने चक्रों के बहाव पीसीआर कदम में उपयोग करने के लिए (नमूना सूचकांक पीसीआर पुस्तकालय निर्माण के दौरान) । एक दिए गए नमूने की आरएनए सामग्री पर निर्भर करता है, जो सक्रियण राज्यों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं (जैसे, नियंत्रण बनाम घायल, आदि), सेल प्रकार, और कोशिका उपज, अनुशंसित चक्र संख्या बदल सकते हैं.
    1. अनुक्रमण के लिए ~ ३,००० ऊतक-व्युत्पंन कोशिकाओं (सक्रियकरण राज्यों के लिए अप्रासंगिक), लेखकों ने पाया है कि 14 चक्रों (नमूने: ~ 10-100 एनजी डीएनए) मानक है ।
    2. डीएनए विश्लेषण के लिए एक विश्लेषक का प्रयोग करें । उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका13देखें ।
  4. नमूना टुकड़ा और डीएनए के आकार का चयन करें । लायब्रेरी निर्माण करने से पहले, उपयुक्त सीडीएनए amplicon आकार प्राप्त करने के लिए एंजाइमी विखंडन और आकार चयन प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।
  5. पुस्तकालय निर्माण के लिए नमूना तैयार करें । जबकि R1 (1 प्राइमर अनुक्रम पढ़ें) मणि मशीन के दौरान अणुओं को जोड़ा जाता है; P5, P7 (एक नमूना सूचकांक), और R2 (2 प्राइमर अनुक्रम पढ़ें) पुस्तकालय निर्माण के दौरान जोड़ा जाता है ।
  6. डीएनए उपज का आकलन करें । अधिकांश अनुक्रमण सुविधाओं डीएनए उपज और गुणवत्ता की जानकारी शामिल है कि अंतिम पुस्तकालयों के प्रस्तुत करने की आवश्यकता है । इस प्रकार, पूरे प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद और sequencing सुविधा के लिए परिवहन करने से पहले निम्न विश्लेषक चलाएँ ।
  7. 2 महीनों के लिए-८० ° c पर नमूनों की दुकान ।
  8. अनुक्रमण से पहले, एक डीएनए ठहराव किट का उपयोग कर नमूने यों तो । यह sequencing सुविधा पर किया जा सकता है ।

5. पुस्तकालय अनुक्रमण (दिन 3 के बाद)

नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त एकल-कक्ष transcriptome barcoding प्लेटफ़ॉर्म प्रारंभ और P5 और P7 अनुक्रम के साथ समाप्त Illumina-संगत युग्मित-अंत लायब्रेरीज़ जनरेट करता है । हालांकि सेल-प्रकार पहचान को हल करने के लिए आवश्यक ंयूनतम गहराई 10000 – 50000 पढ़ता/सेल15,16, ~ १००,००० पढ़ता/सेल के रूप में सिफारिश की है एक इष्टतम लागत कवरेज व्यापार बंद vivo कोशिकाओं में वयस्क के लिए (ध्यान में रखते हुए कुछ सेल प्रकार या न्यूनतम सक्रिय सेल राज्यों 30000-50000 पढ़ता/सेल) में संतृप्ति तक पहुंच जाएगा ।

  1. एक उपयुक्त Illumina sequencer से सुसज्जित एक sequencing सुविधा के लिए सूखी बर्फ पर परिवहन सीडीएनए पुस्तकालयों.
  2. sequencing सुविधा के लिए निम्न जानकारी प्रदान करें:
    1. नमूना विवरण प्रदान करें: प्रत्येक लायब्रेरी के लिए संगत नमूना अनुक्रमणिका IDs; प्रजातियों प्राथमिक असेंबली के लिए जीनोमिक डेटाबेस (यानी, माउस के लिए GRCm38); electropherogram (२०० और ९,००० बीपी के बीच) से अंश आकार दिखा रहा है; सीडीएनए एकाग्रता (एनजी/µ एल) और कुल पुस्तकालय एकाग्रता (कुल पैदावार रेंज से २००-१४०० एनजी); नमूना की मात्रा (µ एल) ।
    2. अनुक्रमण अनुरोध प्रदान करें: एक डीएनए ठहराव किट का उपयोग कर नमूने यों तो; अनुकूलक/सूचकांक प्रकार (TruSeq डीएनए); प्लेट प्रकार (Eppendorf ट्विन. टेक, पूर्ण स्कर्ट-डीएनए के लिए अनुशंसित); अनुक्रमण प्रौद्योगिकी/पुस्तकालय प्रकार (10x, पूर्ण sequencing निर्देश और चक्र सिफारिशें)17.
  3. उथले अनुक्रमण चलाने (वैकल्पिक): कई जैविक नमूनों का विश्लेषण अध्ययन एक एकल जीन बारकोड मैट्रिक्स सभी नमूनों से डेटा युक्त उत्पन्न करने के लिए पूलिंग नमूनों (एकत्रीकरण) से लाभ होगा. जब पूलिंग नमूने के बीच बैच प्रभाव को कम करने के लिए, विभिन्न लायब्रेरीज़ के बीच पढ़ने की गहराई मानकीकृत किया जाना चाहिए । ऐसा करने के लिए, एकल कक्ष संख्याओं का एक सटीक सन्निकटन आवश्यक है । MiSeq sequencer उथले अनुक्रमण की अनुमति देगा और सटीक सेल अनुमान प्राप्त करने के लिए एक लागत प्रभावी, व्यावहारिक तरीका है ।
    नोट: एक MiSeq SR50 sequencer का उपयोग कर चलाने के लिए पर्याप्त कवरेज प्रदान करता है सही लगभग २०,००० कोशिकाओं का अनुमान । यह रन प्रत्येक अद्वितीय बारकोड के लिए बरामद UMI की संख्या लगभग होगा । चित्र 3ए में, उदाहरण (नमूना १.६) आउटपुट (. csv) का शीर्ष लेख दिखाया गया है, जो आत्मविश्वास से मैप किए गए पठन द्वारा निर्धारित बारकोड्स और इसकी संगत UMI गणनाओं को सूचीबद्ध करता है ।
    1. एक bioinformatician के साथ परामर्श के लिए आर प्रोग्रामिंग भाषा से परिचित हो जाते हैं । अधिक जानकारी के लिए DataCamp tutorials को देखें18।
    2. एक19टेम्पलेट के रूप में प्रदान की आर स्क्रिप्ट का उपयोग sequencer से प्राप्त कच्चे डेटा का आकलन करें. रॉ डेटा प्रत्येक अद्वितीय सेल बारकोड के लिए मैप UMIs की संख्या को संदर्भित करता है । स्क्रिप्ट एक. csv फ़ाइल पढ़ता है जहां पहला स्तंभ बारकोड्स की एक सूची है और दूसरा स्तंभ इसके संगत UMI मायने रखता है । यह स्क्रिप्ट एक भूखंड प्रदान करेगा (चित्र बी) और साथ ही प्रत्येक नमूने में बारकोडिंग कोशिकाओं की अनुमानित संख्या । यह सुनिश्चित करने के लिए स्क्रिप्ट को समायोजित करें कि किसी दिए गए नमूने के लिए UMI की गणना की गई संख्या पहली खड़ी ड्रॉप के एक-तिहाई बिंदु पर है । चित्र बीमें, इस कोहनी २२५ UMIs ३,४८० बारकोड्ड कोशिकाओं के लिए इसी के आसपास गिर जाता है ।
    3. HiSeq का उपयोग कर पूर्ण गहराई अनुक्रमण करने के लिए तुलनीय (जहां ३,५१६ कोशिकाओं को सफलतापूर्वक अनुक्रम, आकृति 3ए थे), उथले अनुक्रमण अनुमान ३,४८० कोशिकाओं की भविष्यवाणी की ।
  4. या तो (चरण ५.३ से) कक्ष पुनर्प्राप्ति सन्निकटन का उपयोग करें या गहरी अनुक्रमण के लिए लेन वितरण की योजना बनाने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल20 में पाया पुनर्प्राप्ति चार्ट का उपयोग करें । प्रत्येक नमूने तुलनीय कवरेज प्राप्त करना चाहिए, इसलिए अगर उथले अनुक्रमण पता चलता है कि प्रत्येक नमूने में कोशिकाओं की संख्या अलग कर रहे है (जो अक्सर मामला है) तो लेन वितरण तदनुसार गणना की जानी चाहिए । एक HiSeq फ्लो सेल (जो 8 गलियों शामिल) २,४००,०००,००० कस्टम युग्मित अंत तक अनुक्रम कर सकते है पढ़ता है । उदाहरण फ्लो सेल सेट अप चित्रा 3 डीमें प्रस्तुत किया है ।

6. संसाधन पढ़ें फ़ाइलें

नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके किसी एकल कक्ष 3 ' लायब्रेरी sequencing अपुष्ट डेटा बायनेरी बेस कॉल (BCL) स्वरूप में जनरेट करता है । सेल रेंजर पैकेज BCL फ़ाइलों से पाठ-आधारित FASTQ फ़ाइलों को उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जीनोमिक और transcriptomic संरेखण प्रदर्शन, जीन गिनती, division, और नमूनों का एकत्रीकरण. इस खंड में, एक अनुक्रमण सुविधा से रॉ BCL डेटा डाउनलोड करने और बहाव bioinformatics के लिए तैयार फ़िल्टर्ड जीन बारकोड मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए उपयोगकर्ताओं को सक्षम महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत किया है ।

  1. प्रोग्राम चलाने के लिए केंद्रीयकृत सर्वर का उपयोग करें । BCL फ़ाइलें, FASTQ फ़ाइलें और बहाव bioinformatics प्रसंस्करण के अधिकांश महत्वपूर्ण प्रसंस्करण शक्ति की मांग ।
  2. डाउनलोड सभी रॉ सर्वर पर फ़ाइलें पढ़ें (या FASTQ फ़ाइलें अगर वे उपलब्ध हैं) ।
    1. सर्वर व्यवस्थापक के साथ परामर्श एक केंद्रीकृत सर्वर या क्लस्टर पर एक खाता स्थापित करने के लिए, और Unix21के साथ परिचित पाने के लिए ।
    2. sequencing सुविधा के सर्वर से सभी फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए सर्वर के ऑपरेटिंग सिस्टम के लिए उपयुक्त कोई फ़ेच आदेश का उपयोग करें ।
      1. अधिकांश अनुक्रमण सुविधाएं कमांड लाइन (नीचे उदाहरण देखें) से चलाया जा सकता है कि एक सुरक्षित पथ से फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए एक आदेश प्रदान करते हैं ।
      2. प्रदान किए गए क्रेडेंशियल्स के साथ आदेश पंक्ति में "< उपयोगकर्ता नाम >" और "< पासवर्ड >" प्लेसहोल्डर बदलें ।
        wget-O-"https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/--नहीं-कुकीज़--नहीं, चेक-सर्टिफिकेट--पोस्ट-डेटा ' j_username = username & j_password = password ' | wget--no-कुकीज़--नहीं, चेक-प्रमाण पत्र--पोस्ट-डेटा ' j_username = उपयोगकर्ता नाम & j_password = पासवर्ड '-ci-
    3. यदि केवल फ़ाइलों के लिए कोई पूर्ण पथ प्रदान किया गया है (यानी https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/), तो इस पथ को फ़ेच आदेश में संमिलित करें ।
  3. खोल दो फ़ाइलें: यदि डाउनलोड की फ़ाइलें एक ". gz" विस्तार के साथ समाप्त होता है, यह "gzip" आदेश का उपयोग कर संकुचित किया गया है । खोलना, चलाने के आदेश पंक्ति में आदेश खोल दो (नीचे उदाहरण देखें) ।
    gunzip raw_read_files gz
  4. डाउनलोड सेल रेंजर के नवीनतम संस्करण के रूप में सर्वर पर एक आत्म निहित । टीआर22.
    1. महत्वपूर्ण: डाउनलोड करने से पहले, सुनिश्चित करें कि Linux सिस्टम ंयूनतम आवश्यकताओं23मिलता है । ६४ GB रैम और 1 टीबी मुक्त डिस्क स्थान के साथ 8-कोर इंटेल प्रोसेसर की एक ंयूनतम सुनिश्चित करें ।
      नोट: सेल रेंजर प्रदान करता है पूर्व निर्मित मानव और मूषक संदर्भ transcriptomes । इन cellranger mkref आदेश का उपयोग करने के लिए GFP24जैसे जीन का पता लगाने के संशोधित किया जा सकता है ।
  5. sequencer की बेस कॉल फ़ाइलें (BCLs) cellranger mkfastq आदेश का उपयोग करने से FASTQ फ़ाइलें उत्पन्न करें ।
    नोट: कार्यक्रम कच्चा पढ़ता (FASTQ फ़ाइलें) से एक संदर्भ जीनोम के लिए संरेखित और बहाव विश्लेषण के लिए जीन सेल मैट्रिक्स उत्पंन होगा । यह स्टार संरेखण का उपयोग करता है कि ब्याह-वाकिफ संरेखण करता है एक संदर्भ जीनोम के लिए पढ़ता है । केवल विश्वास से मैप किया पढ़ता (यानी, एक एकल जीन एनोटेशन के साथ संगत पढ़ता है) UMI गिनती के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ।
    1. उदाहरण के लिए, cellranger mkfastq आदेश का उपयोग करें:
      cellranger mkfastq --id = sample_name \
      --रन =/path/to/sample \
      -csv = csv_file_containing_lane_sample_index. csv
  6. भागो cellranger गिनती FASTQ फ़ाइलों पर mkfastq का उपयोग करने के लिए एकल सेल जीन गिनती उत्पंन उत्पंन ।
    1. उदाहरण के लिए, cellranger count आदेश का उपयोग करें:
      cellranger count --id = sample_name \
      --transcriptome = refdata-cellranger-mm10-1.2.0 \
      --fastqs =/absolute/path/to/fastq/files \
      --नमुना = same_sample_name_supplied_to_cellranger_mkfastq \
      --localcores = 30
  7. बहु पुस्तकालय एकत्रीकरण (वैकल्पिक): नमूनों गठबंधन करने के लिए, पूल cellranger गणना cellranger aggr का उपयोग outputs. एक एकल जीन बारकोड मैट्रिक्स डेटा एकाधिक पुस्तकालयों से परित युक्त में यह परिणाम है । उदाहरण cellranger aggr आदेश:
    cellranger aggr--id = sample_name \
    --csv = csv_with_libraryID_ & _path_to_molecule_h5. csv \
    -सामान्य = मैप किया गया
    नोट: लायब्रेरीज़ तीन सामान्यीकरण मोड (मैप किए गए, raw, कोई नहीं) का उपयोग करके एकत्रित की जा सकती हैं. मैप की सिफारिश की है के रूप में यह उपनमूना उच्च गहराई पुस्तकालयों जब तक सभी पुस्तकालयों के बराबर अनुक्रमण गहराई25है ।
  8. डेटा का तत्काल विज़ुअलाइज़ेशन/विश्लेषण के लिए,. cloupe आउटपुट फ़ाइल (cellranger count या cellranger aggr का उपयोग करके जनरेट किया गया) 10x Loupe सेल ब्राउज़र26में आयात करें ।

7. scRNA-Seq डेटासेट का एडवांस्ड एनालिसिस

नोट: एक पूरा scRNA-Seq उपकरण डेटाबेस scRNA में पाया जा सकता है-उपकरण3,27। नीचे unsupervisित सेल के लिए एक रूपरेखा2 Seurat का उपयोग कर clustering और pseudotemporal Monocle6का उपयोग कर आदेश है । हालांकि इस काम के बहुत एक स्थानीय कंप्यूटर पर किया जा सकता है, निंन चरणों का मानना है कि अभिकलन एक संस्थागत सर्वर का उपयोग कर पूरा हो जाएगा ।

  1. Linux प्लेटफ़ॉर्म28का उपयोग कर सर्वर खाते पर Miniconda का नवीनतम संस्करण डाउनलोड करें ।
  2. conda29का उपयोग कर R का नवीनतम संस्करण स्थापित करें ।
  3. 30टेम्पलेट के रूप में प्रदान की गई Seurat R स्क्रिप्ट का उपयोग कर डेटा प्लॉट ।
    नोट: Seurat एक आर आधारित टूलकिट कि गुणवत्ता नियंत्रण की जांच, clustering, अंतर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, मार्कर जीन पहचान, आयामी कमी, और scRNA-Seq डेटा के दृश्य सक्षम बनाता है । Seurat कोडिंग और ट्यूटोरियल का एक व्यापक विवरण सतीजा लैब31वेबसाइट पर पाया जा सकता है ।
  4. एक३२टेम्पलेट के रूप में प्रदान की गई Monocle R स्क्रिप्ट का उपयोग कर डेटा प्लॉट ।
    नोट: Monocle एक और आर आधारित toolkit कि pseudotime पर अभिव्यक्ति परिवर्तन के दृश्य में सक्षम बनाता है और कोशिका भाग्य निर्णय अंतर्निहित जीन की पहचान है । Monocle कोडिंग और ट्यूटोरियल का एक व्यापक विवरण Monocle वेबसाइट३३पर पाया जा सकता है ।
  5. R-पैकेज जैसे kBET परीक्षण और पूलिंग datasets३४का एक परिणाम के रूप में बैच प्रभाव सही करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

8. NCBI की भू और SRA प्रस्तुतियाँ

नोट: के बाद से कच्चे अनुक्रमण फ़ाइलों के लिए आसान पहुंच सुनिश्चित reproducibility और पुनर्विश्लेषण, accessioned प्रस्तुतियां ऑनलाइन सार्वजनिक रूप से उपलब्ध खजाने की सिफारिश की है या पांडुलिपि प्रस्तुत करने से पहले की आवश्यकता है । राष्ट्रीय जैव प्रौद्योगिकी सूचना (NCBI) जीन अभिव्यक्ति सर्वग्राही (भू) और अनुक्रम पढ़ें पुरालेख (SRA) के लिए केंद्र सार्वजनिक रूप से सुलभ उच्च प्रवाह अनुक्रमण डेटा३५,३६के लिए डेटा खजाने हैं ।

  1. NCBI के भू सबमिटर खाते३७के लिए पंजीकरण करें ।
  2. पूरा भू सबमिशन जिसमें तीन घटक एक निर्देशिका में संकलित शामिल/फ़ोल्डर (भू सबमिटर के उपयोगकर्ता नाम के रूप में शीर्षक): 1) मेटाडाटा रिकॉर्ड (परियोजना सबमिशन प्रति एक स्प्रेडशीट); 2) रॉ डेटा फ़ाइलें; 3) संसाधित डेटा फ़ाइलें ।
    1. मेटाडेटा स्प्रेडशीट३८डाउनलोड और पूर्ण करें । निंनलिखित सार्वजनिक भू प्रस्तुत एक गाइड (GSE100320)३९के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । स्प्रेडशीट निर्देशिका में रखें ।
    2. प्लेस रॉ डेटा निर्देशिका में सभी पुस्तकालयों के लिए cellranger गणना स्क्रिप्ट से उत्पंन फ़ाइलें ।
    3. संसाधित डेटा फ़ाइलें (फ़िल्टर किए गए बारकोड्स. tsv, जीन. tsv, और मैट्रिक्स. mtx फ़ाइलें) निर्देशिका में सभी पुस्तकालयों के लिए cellranger गणना स्क्रिप्ट से उत्पंन प्लेस ।
  3. सभी तीन घटकों वाली निर्देशिका स्थानांतरित करने के लिए भू सबमिटर के FTP सर्वर क्रेडेंशियल्स का उपयोग करें । Linux के लिए/Unix उपयोगकर्ता: ncftp, lftp, ftp, sftp, और ncftpput किया जा सकता है ।
  4. सभी स्थानान्तरण३८के लिए अधिसूचित भू ।

Representative Results

खुला स्रोत scRNA-Seq डेटासेट का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन संकुल की प्रदर्शनियों नाटकीय रूप से वृद्धि हुई है इन संकुल के बहुमत के साथ४० आर आधारित भाषाओं का उपयोग करें3। यहां, प्रतिनिधि इन संकुल के दो का उपयोग कर परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं: एकल कोशिकाओं जीन अभिव्यक्ति पर आधारित का पर्यवेक्षण समूह का आकलन, और एक पथ के साथ एकल कोशिकाओं के आदेश को हल करने के लिए सेल विविधता और जैविक निर्माण प्रक्रियाओं.

चित्रा 4 पूर्व प्रसंस्करण गुणवत्ता की जांच और बहाव bioinformatics विश्लेषण के लिए Seurat के उपयोग को दर्शाता है । सबसे पहले, निस्पंदन और विश्लेषण से deviant कोशिकाओं को हटाने की गुणवत्ता की जांच के लिए आवश्यक है । यह वायलिन (चित्रा 4a) और तितर बितर भूखंड (चित्रा 4b) का उपयोग करने के लिए mitochondrial जीन, जीन की संख्या (nGene), और UMI की संख्या (nUMI) के प्रतिशत कल्पना को सेल दोहरी और outliers की पहचान किया गया । जीन, UMI, या mitochondrial जीन की प्रतिशत की एक स्पष्ट ग़ैर संख्या के साथ किसी भी कोशिका Seurat FilterCells समारोह का उपयोग कर हटा दिया गया था । चूंकि Seurat क्लस्टर कोशिकाओं के लिए प्रमुख घटक (पीसी) विश्लेषण स्कोर का उपयोग करता है, सांख्यिकीय महत्वपूर्ण पीसी का निर्धारण शामिल करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । कोहनी भूखंडों (चित्रा 4c) पीसी चयन के लिए उपयोग किया गया, जिसमें ' पीसी अक्ष के मानक विचलन के पठार से परे पीसी ' बाहर रखा गया । clustering के संकल्प भी है कि समूहों की संख्या में परिवर्तन किया जा सकता है हेरफेर किया गया था, ०.४ से लेकर (कम सेल क्लस्टर, चित्रा 4dके लिए अग्रणी) से 4 (उच्च सेल क्लस्टर के लिए अग्रणी संकल्प, चित्रा 4e ). कम रिज़ॉल्यूशन पर, यह संभव है कि प्रत्येक क्लस्टर एक निर्धारित कक्ष प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि उच्च रिज़ॉल्यूशन में यह किसी कक्ष की जनसंख्या के उपप्रकार या संक्रमणकालीन राज्यों का भी प्रतिनिधित्व कर सकता है । इस उदाहरण में, निंन-रिज़ॉल्यूशन क्लस्टर सेटिंग्स का उपयोग किया गया अभिव्यक्ति heatmaps (Seurat के DoHeatmap फ़ंक्शन का उपयोग करके) का विश्लेषण करने के लिए किसी दिए गए क्लस्टर (चित्र 4f) में सबसे अत्यधिक व्यक्त जीन की पहचान करने के लिए । इस उदाहरण में, सबसे उच्च व्यक्त जीन सभी अंय समूहों बनाम एक दिया क्लस्टर में अंतर अभिव्यक्ति का आकलन द्वारा की पहचान की गई, प्रदर्शन है कि प्रत्येक क्लस्टर विशिष्ट परिभाषित जीन द्वारा प्रतिनिधित्व किया गया था । इसके अतिरिक्त, व्यक्तिगत उंमीदवार जीन Seurat के FeaturePlot समारोह (चित्रा 4g) का उपयोग कर tSNE भूखंडों पर visualized किया जा सकता है । यह समझने के लिए अनुमति दी कि क्या क्लस्टर्स मैक्रोफेज का प्रतिनिधित्व किया । FeaturePlot का उपयोग करते हुए हमने पाया कि दोनों क्लस्टर 2 और 4 Cd68-एक पान मैक्रोफेज मार्कर व्यक्त कर रहे थे ।

Monocle पैकेज Seurat में पहचाने गए corroborating सेल क्लस्टर के लिए उपयोग किया गया था, और सेल पथ के निर्माण के लिए, या pseudotemporal आदेश, जैविक प्रक्रियाओं को दोहराऊंगा करने के लिए (चित्रा 5). Pseudotemporal आदेश एक जैविक समय पाठ्यक्रम का पालन करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं, जहां एकल सेल अभिव्यक्ति प्रोफाइल नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कोशिकाओं को मध्यवर्ती राज्यों, दो वैकल्पिक सेल भाग्य के विभाजन अंक के समाधान के लिए एक pseudotemporal सातत्य के साथ आदेश दिया जा सकता है, और जीन हस्ताक्षर प्रत्येक भाग्य की अंतर्निहित अधिग्रहण की पहचान । सबसे पहले, Seurat निस्पंदन के समान, गरीब गुणवत्ता वाले कोशिकाओं को हटा दिया गया था कि सभी कोशिकाओं में mRNA के वितरण सामांय लॉग इन किया गया और ऊपरी और निचले सीमा के बीच गिर के रूप में चित्रा 5में पहचान की । फिर, Monocle के newCellTypeHierarchy समारोह का उपयोग कर, एकल कोशिकाओं को वर्गीकृत किया गया और ज्ञात वंश मार्कर जीन का उपयोग कर गिना (चित्रा 5b, 5c). उदाहरण के लिए, PDGF रिसेप्टर अल्फा या Fibroblast विशिष्ट प्रोटीन 1 व्यक्त कोशिकाओं fibroblasts परिभाषित करने के लिए एक कसौटी बनाने के लिए सेल प्रकार #1 को सौंपा गया था. अगला, इस जनसंख्या (कक्ष प्रकार #1) को fibroblast पथ को समझने के लिए मूल्यांकन किया गया था । ऐसा करने के लिए, Monocle के अंतर GeneTest समारोह का उपयोग किया गया था, जो जनसंख्या के भीतर चरम राज्यों का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं की तुलना में और जनसंख्या में शेष कोशिकाओं के आदेश के लिए अंतर जीन पाया (चित्रा 5d) । द्वारा कई गुना सीखने की विधि (गैर का एक प्रकार रैखिक आयामी कमी) सभी कोशिकाओं में, एक pseudotemporal पथ के साथ समंवय को सौंपा गया था । यह पथ तो सेल राज्य (चित्रा 5e) और pseudotime (चित्रा 5f) द्वारा visualized था ।

Figure 1
चित्र 1: फ़्लो चार्ट । पूरे जानवर तैयारी से कदम एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध भंडार के लिए अंतिम datasets जमा करने के लिए एकल सेल आरएनए-Seq डेटासेट का विश्लेषण करने के लिए । पायस में जेल मोती (रत्न) बारकोड oligonucleotides जो एकल कोशिकाओं के हजारों encapsulate के साथ मोतियों को देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: तंत्रिका ऊतक से व्यवहार्य एकल सेल निलंबन बनाना । (क) गुणवत्ता नियंत्रण जाँच के कार्टून अवलोकन. (ख) कोशिकाओं और मलबे अभी भी मलबे में शामिल कोशिकाओं के साथ (लाल तीर) । (ग) मलबे से जारी कोशिकाओं (लाल तीर) । (घ) FACS द्वारा कोशिका अलगाव. P0: मलबा भिन्न; P1: कक्ष की तरह भिंन; p: duplets का बहिष्करण; पी 4: व्यवहार्यता डाई (Sytox नारंगी) नकारात्मक अंश । (ङ) कोई व्यवहार्यता डाई नियंत्रण । (च) P0 अलग मलबे का प्रतिनिधित्व अंश की छवि । (जी) अलग व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व पी 4 अंश की छवि (लाल तीर) । बी सी (च) और (छ) परमाणु डाई था इमेजिंग से पहले 20 मिनट जोड़ा । स्केल बार्स: ८० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: उथले अनुक्रमण 10x संसाधित नमूनों में बरामद कोशिकाओं की संख्या का अनुमान है । (a) एक उदाहरण (नमूना १.६) MiSeq-जनित csv लिस्टिंग सेल बारकोड और उसकी इसी UMI गिनती के रूप में आत्मविश्वास से मैप किया पढ़ता द्वारा निर्धारित । (ख) नमूना १.६ के लिए बारकोड रैंक भूखंड सेल बारकोड के एक समारोह के रूप में UMI गिनती में एक महत्वपूर्ण गिरावट से पता चलता है । धराशायी और ठोस लाइनें दृश्य निरीक्षण द्वारा निर्धारित के रूप में कोशिकाओं और पृष्ठभूमि के बीच कटऑफ प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग) सेल रेंजर पाइपलाइन पोस्ट-HiSeq का उपयोग कर मनाया कक्ष बारकोड का पता चलता है उथले अनुक्रमण सही नमूना १.६ के लिए कक्षों की संख्या अनुमानित । (घ) एक प्रवाह-सेल सेट-अप का एक उदाहरण उथले अनुक्रमण व्युत्पंन सेल के अनुमान के आधार पर । नमूना १.६ के लिए, के बाद से उथले अनुक्रमण ३४८० कोशिकाओं की भविष्यवाणी की, १.१७ गलियों सुनिश्चित करने के लिए > 100000 पढ़ता HiSeq में सेल अनुक्रमण कवरेज प्रति असाइन किए गए थे । नोट: सभी गलियों १००% से जोड़ना होगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Seurat आर पैकेज का उपयोग कर एकल सेल आरएनए-Seq डेटासेट की गुणवत्ता नियंत्रण और bioinformatics. (क) गुणवत्ता नियंत्रण मेट्रिक्स के भूखंडों जिसमें जीन की संख्या, अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (UMIs) की संख्या, और mitochondrial जीनोम को मानचित्रण का प्रतिशत शामिल है । (ख) नमूना जीन भूखंडों mitochondrial टेप और UMIs के deviant स्तर के साथ कोशिकाओं का पता लगाने । (ग) नमूना कोहनी साजिश सांख्यिकीय महत्वपूर्ण पीसी के तदर्थ निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया । धराशायी और डॉट-धराशायी लाइनों कटऑफ जहां एक स्पष्ट "कोहनी" ग्राफ में स्पष्ट हो जाता है प्रतिनिधित्व करते हैं । इस कोहनी से पहले पीसी आयाम बहाव विश्लेषण में शामिल हैं । (डी, ई) ग्राफ आधारित सेल एक कम आयामी एक tSNE भूखंड का उपयोग कर अंतरिक्ष में दो विभिंन प्रस्तावों पर कल्पना समूहों । (च) Seurat के DoHeatmap फ़ंक्शन का उपयोग कर हीटमैप अभिव्यक्ति पर विज़ुअलाइज़ की गई प्रत्येक क्लस्टर के लिए शीर्ष मार्कर जीन (पीला). (छ) की visualizing मार्कर अभिव्यक्ति, उदाहरण के लिए, Cd68 जीन का प्रतिनिधित्व मैक्रोफेज (बैंगनी) Seurat FeaturePlot समारोह का उपयोग कर । यह पता चलता है कि क्लस्टर 2 और 4 (कक्ष d में) इस dataset के मैक्रोफेज का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सेल वर्गीकरण और Monocle toolkit का उपयोग peudotemporal पथ के साथ आदेश । (a) किसी नमूने में सभी कक्षों में mRNA (UMI से अनुमानित) के वितरण का निरीक्षण करना. 0-~ २०,००० के बीच mRNA के साथ केवल कक्ष अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए उपयोग किए गए थे । (ख, ग) निर्दिष्ट और गिनती सेल प्रकार ज्ञात वंश सेल मार्करों के आधार पर । उदाहरण के लिए, PDGF रिसेप्टर अल्फा या Fibroblast विशिष्ट प्रोटीन 1 व्यक्त कोशिकाओं सेल प्रकार के लिए सौंपा गया #1 Monocle के newCellTypeHierarchy समारोह का उपयोग कर पैन-fibroblasts का प्रतिनिधित्व. भिंन कक्ष प्रकारों की संख्या पाइ चार्ट (b) के रूप में और तालिका (c) के रूप में विज़ुअलाइज़ की जा सकती है । (घ) एक उदाहरण के रूप में कक्ष प्रकार #1 (fibroblasts) का उपयोग करना, जीन आदेश कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल एक तितर बितर साजिश है कि जीन फैलाव बनाम मतलब अभिव्यक्ति का प्रदर्शन का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । लाल वक्र Monocle estimateDispersions समारोह का उपयोग कर मतलब विचरण मॉडल द्वारा परिकलित आदेश के लिए इस्तेमाल किया जीन के लिए कटऑफ से पता चलता है. जीन है कि इस कटऑफ को पूरा बहाव pseudotime आदेश के लिए इस्तेमाल किया गया । (ङ, च) कक्ष के "राज्य" (ई) द्वारा रंगीन एक कम दो आयामी अंतरिक्ष में सेल पथ के दृश्य, और Monocle द्वारा सौंपा "Pseudotime" (एफ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है कि कैसे एकल कोशिकाओं की उचित तैयारी एकल कोशिकाओं और भेदभाव कार्यात्मक राज्यों या एक ऊतक के भीतर अद्वितीय सेलुलर पहचान के हजारों की transcriptional विविधता उजागर कर सकते हैं । प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन या ट्रांसजेनिक उपकरण की आवश्यकता नहीं है और मनुष्यों से उन सहित ब्याज के विभिंन ऊतकों से एकल कोशिकाओं के अलगाव के लिए लागू किया जा सकता है; प्रत्येक ऊतक अद्वितीय है और इस प्रोटोकॉल को ध्यान में रखते हुए समायोजन के कुछ डिग्री/

कक्षों के भीतर विविध और अति गतिशील transcriptional कार्यक्रमों ने एकल-कक्ष जीनोमिक्स के मूल्य पर बल दिया है. उच्च गुणवत्ता वाली आरएनए को अलग करने के अलावा, उच्च गुणवत्ता वाले डेटासेट के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण नमूना तैयारी चरण यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाएं ऊतक से पूरी तरह से जारी की जाएं और वह कोशिकाएं स्वस्थ और अक्षुण्ण हों । यह अपेक्षाकृत सीधे आगे कोशिकाओं है कि आसानी से जारी कर रहे हैं, ऐसे परिसंचारी कोशिकाओं के रूप में या ऊतकों में जहां कोशिकाओं को ढीला बनाए रखा है, जैसे लसीकावत् ऊतकों में, को इकट्ठा करने के लिए है । लेकिन यह अंय वयस्क ऊतकों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, अत्यधिक विकसित सेलुलर वास्तुकला बड़ी दूरी फैले, extracellular मैट्रिक्स और अक्सर-कठोर cytoskeletal प्रोटीन सेल संरचना बनाए रखने में शामिल की वजह से । यहां तक कि कोशिकाओं की पूरी रिलीज के लिए उपयुक्त पृथक्करण तकनीकों के साथ, वहां क्षमता है कि कठोर और अक्सर लंबी प्रसंस्करण mRNA गुणवत्ता और कोशिका अखंडता में परिवर्तन होगा आवश्यक है । इसके अलावा, उच्च तापमान एंजाइम सहायता पृथक्करण के लिए इस्तेमाल भी transcriptional हस्ताक्षर29,30प्रभावित करते हैं । प्रोटोकॉल के इरादे के लिए गुणवत्ता नियंत्रण की जांच वर्तमान है, जैसे myelinated वयस्क तंत्रिका और extracellular मैट्रिक्स अमीर वयस्क त्वचा के रूप में ऊतकों का उपयोग कर, कैसे अनुकूलन के लिए इन बाधाओं को दूर करने में मदद कर सकते है प्रदर्शन ।

एक प्रमुख विचार जब किसी भी scRNA-Seq प्रयोग डिजाइन अनुक्रमण गहराई का विकल्प है । अनुक्रमण अत्यधिक मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है और पढ़ें गहराई बहुत कम किया जा रहा ड्रॉप-Seq2 का उपयोग करने के लिए अप करने के लिए ५,०००,००० पुस्तकें/14 एक पूर्ण लंबाई आरएनए-Seq विधि जैसे स्मार्ट-Seq का उपयोग कर से भिंन हो सकते हैं । अधिकांश scRNA-Seq प्रयोगों के रूप में १०,००० पढ़ता/सेल, जो आमतौर पर सेल प्रकार वर्गीकरण४१,४२के लिए पर्याप्त है के रूप में कम sequencing के साथ मॉडरेट करने के लिए उच्च अभिव्यक्ति टेप का पता लगा सकते हैं । उथले अनुक्रमण गहराई मूल्य की है अनुक्रमण लागत पर बचाने के लिए जब जटिल ऊतकों भर में दुर्लभ कोशिका आबादी का पता लगाने की कोशिश कर रहा है जहां कोशिकाओं के हजारों विश्वास परमशॆवर दुर्लभ आबादी के लिए आवश्यक हो सकता है । लेकिन उथले गहराई अनुक्रमण पर्याप्त नहीं है जब जीन अभिव्यक्ति और सूक्ष्म transcriptional हस्ताक्षर के साथ जुड़े प्रक्रियाओं पर विस्तृत जानकारी आवश्यक है । वर्तमान में, यह अनुमान है कि एक सेल में जीन के बड़े बहुमत ५००,००० के साथ पाया जाता है पढ़ता/सेल, लेकिन यह प्रोटोकॉल और ऊतक प्रकार४३,४४के आधार पर भिंन हो सकते हैं । जबकि पूर्ण लंबाई की प्रतिलिपि अनुक्रमण विधानसभा के लिए की जरूरत है दरकिनार और कर सकते हैं, इसलिए, उपंयास या दुर्लभ ब्याह वेरिएंट का पता लगाने, sequencing लागत अक्सर इस तरह के एक जटिल ऊतक प्रणाली शामिल कोशिकाओं के हजारों की जांच करने के लिए दृष्टिकोण स्केलिंग सीमा । इसके विपरीत, 3 ' टैग एकल सेल पुस्तकालयों इस प्रोटोकॉल में वर्णित लोगों के रूप में आम तौर पर कम जटिलता है और आमूलचूल अनुक्रमण की आवश्यकता होती है । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पुस्तकालयों वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न पांच समर्थित sequencers में से एक पर अनुक्रम किया जा सकता: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq २५०० तेजी से चलाने और उच्च उत्पादन, 4) NextSeq 500/550, और 5) MiSeq.

एकल सेल आरएनए-Seq के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, कि नाजुक ऊतक और सेल हैंडलिंग के लिए की जरूरत को कम कर देता है अभी तक एकल कोशिका आरएनए-Seq के लाभों में से कुछ का कहना है, एकल नाभिक४५से आरएनए के विश्लेषण है. इस दृष्टिकोण और अधिक तेजी से आरएनए गिरावट को कम करने के प्रसंस्करण की अनुमति देता है, और अधिक चरम उपायों नाभिक की पर्याप्त रिहाई सुनिश्चित करने के लिए, और इस तरह की संभावना एक दिया ऊतक के भीतर सभी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व transcriptional प्रोफाइल का एक और अधिक विश्वास कब्जा के लिए अनुमति देता है । यह जाहिर है, केवल transcriptional गतिविधि के एक हिस्से को दिए गए सेल के भीतर मौजूद प्रदान करते हैं, इस प्रकार क्या प्रयोगात्मक उद्देश्यों ब्याज की इस दृष्टिकोण हो सकता है या उचित नहीं हो सकता है पर निर्भर करता है ।

एक दिए गए ऊतक के भीतर सेलुलर पहचान के पूर्ण लक्षण वर्णन के अलावा, scRNA-Seq डेटासेट के लिए सबसे मूल्यवान विश्लेषणों में से एक ' ' परिभाषित सेल आबादी ' भर में मध्यवर्ती transcriptional राज्यों का आकलन है. इन मध्यस्थ राज्यों की पहचान की आबादी है, जो पारंपरिक सामूहिक आरएनए-Seq दृष्टिकोण के साथ संभव नहीं था भीतर कोशिकाओं के बीच वंश संबंधों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । कई scRNA-Seq bioinformatic उपकरण अब इस स्पष्ट को विकसित किया गया है । इस तरह के उपकरण में शामिल प्रक्रियाओं का आकलन कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, कैंसर एक oncogenic/मेटास्टेटिक राज्य में संक्रमण की कोशिकाओं, स्टेम विविध टर्मिनल भाग्य या सक्रिय और quiescent राज्यों के बीच की प्रतिरक्षा कोशिकाओं में परिपक्व कोशिकाओं । कोशिकाओं में सूक्ष्म transcriptome मतभेद भी वंश पूर्वाग्रहों का संकेत हो सकता है कि, हाल ही में FateID तरह विकसित bioinformatic उपकरण,४७का अनुमान कर सकते हैं । संक्रमण कोशिकाओं के बीच भेद के बाद से transcriptional मतभेद दिया पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है सूक्ष्म हो सकता है, गहरी अनुक्रमण आवश्यक हो सकता है४६. सौभाग्य से, एक उथले अनुक्रम पुस्तकालय के कवरेज में वृद्धि की जा सकती है यदि डेटासेट की जांच में रुचि फिर से एक और फ्लो सेल पर पुस्तकालय चल रहा है ।

एक साथ लिया, इस प्रोटोकॉल एक आसान करने के लिए अनुकूलन कार्यप्रवाह है कि उपयोगकर्ताओं को एक प्रयोग के भीतर एकल कोशिकाओं के हजारों transcriptionally प्रोफ़ाइल सैकड़ों करने के लिए सक्षम बनाता है प्रदान करता है । एक scRNA-Seq डेटासेट के अंतिम गुणवत्ता अनुकूलित सेल अलगाव, प्रवाह cytometry, सीडीएनए पुस्तकालय पीढ़ी, और कच्चे जीन बारकोड मैट्रिक्स की व्याख्या पर निर्भर करता है । इस अंत करने के लिए, इस प्रोटोकॉल सभी महत्वपूर्ण कदम है कि आसानी से विविध ऊतक प्रकार के अध्ययन को सक्षम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है की एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करता है ।

Disclosures

कोई खुलासे नहीं

Acknowledgments

हम UCDNA सेवाओं की सुविधा में समर्थन स्टाफ स्वीकार करते हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैलगरी विश्वविद्यालय में पशु देखभाल सुविधा स्टाफ । हम अपने bioinformatics समर्थन और जेएनएन Durruthy के लिए अपने तकनीकी समर्थन के लिए मैट Workentine धंयवाद । यह काम एक CIHR अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था (R.M. और J.B.), J.B. के लिए एक CIHR नए अन्वेषक पुरस्कार, और एक अलबर्टा बच्चों के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान फैलोशिप (J.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Products
RNAse out Biosciences 786-70
Pentobarbital sodium Euthanyl 50mg/kg
HBSS Gibco 14175-095
Dispase 5U/ml StemCell Technologies 7913 5 mg/ml
Collagenase-4 125 CDU/mg Sigma-Aldrich C5138 2 mg/ml
DNAse Sigma-Aldrich DN25 10mg/ml
BSA Sigma-Aldrich A7906
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes VWR 89039-666
Sytox Orange Viability Dye Molecular Probes 11320972 1.3 nM/µl
Nuc Blue Live ReadyProbes Invitrogen R37605
Agilent 2100 Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents Agilent 5067-4626
Kapa DNA Quantification Kit Kapa Biosystems KK4844
Chromium Single Cell 3' reagents 10x Genomics
Equipment
BD FACSAria III BD Biosciences
Agilent 2100 Bioanalyzer Platform Agilent
Illumina® HiSeq 4000 Illumina
Illumina® MiSeq SR50 Illumina
10X Controller + accessories 10x Genomics
Software
The Cell Ranger 10x GENOMICS support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/welcome
Loupe Cell Browser 10x GENOMICS support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest
R https://anaconda.org/r/r

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जीवविज्ञान अंक १४३ एकल कोशिका आरएनए-Seq वयस्क Transcriptome आरएनए FACS
छोटी बूंद Barcoding-आधारित एकल कोशिका Transcriptomics वयस्क स्तनधारी ऊतकों
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Stratton, J. A., Sinha, S., Shin,… More

Stratton, J. A., Sinha, S., Shin, W., Labit, E., Chu, T. H., Shah, P. T., Midha, R., Biernaskie, J. Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues. J. Vis. Exp. (143), e58709, doi:10.3791/58709 (2019).

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