Summary
高速・高分解能を可能にする高度な顕微鏡分離膜と周囲の細胞内のボリュームの両方の画像が表示されます。1 つのセットアップでディスクと全反射蛍光顕微鏡を回転の統合により、3.5 まで高い獲得率でライブ イメージング実験画像のスタック毎秒。
Abstract
生きている細胞では、接着形成などのプロセスは、細胞膜と細胞内で広範な構造変化を伴います。ライブ サンプルの高速イメージングが可能 2 つの相補的な光学顕微鏡技術が結合されたこれらの非常に動的なイベントを視覚化するために: 高速で高解像度のボリューム録音および総内面反射の顕微鏡ディスク (SD) を回転正確な局在と細胞膜の可視化 (TIRF) 蛍光顕微鏡検査。試料作製、顕微鏡校正、画像形成および取得を通じた指導、多色・高時空間的解像度 SD 全反射イメージング ライヴ ・ シリーズの包括的かつ完全なイメージング プロトコルが表示されます。多次元のライブ イメージング データセット、すなわち登録および個々 のチャンネルの組み合わせを生成するためのすべての必要な画像後処理手順は、ImageJ のオープン ソース ソフトウェアの自己書かれたマクロで提供されます。開始時に蛍光タンパク質のイメージングおよび接着複合体の成熟だけでなく、アクチン細胞骨格ネットワークの形成は、この新たなアプローチの原則の証拠として使用されました。高解像度 3 D 顕微鏡や全反射の組み合わせがセルラ環境内および、同時に、高い検出膜準の分子の正確な局在これらの複雑なプロセスの詳細な説明を提供シグナル/バック グラウンド比。
Introduction
日々、固定高/超解像イメージングと生体試料を提供する光学顕微鏡技術は急速に発展します。超解像技術枯渇 (STED) 構造化照明顕微鏡 (SIM) と光活性化ローカリゼーション顕微鏡 (パーム) または直接確率光再建顕微鏡 (嵐) の刺激をそれぞれ、市販分子スケール1,2,3,4,5,6のほとんどの詳細を示す細胞レベル下の構造のイメージングを有効にして。ただし、これらのアプローチは、大量が 2 番目の集録速度あたり複数のフレームを可視化する必要がありますライブ イメージング実験の適用性をまだ制限が。非常にダイナミックなプロセスを介して細胞膜、例えば遠藤 - 規制の品種/エキソサイトーシス、粘着性、移行、シグナル伝達、細胞大量に高速で発生します。最近、このギャップを埋めるために統合された顕微鏡法は提案と呼ばれる回転ディスク-全反射 (SD 全反射)7だった。詳しくは、全反射型顕微鏡特に分離膜8,9をローカライズ、SD 顕微鏡は最も敏感なと高速可視化と追跡のためのイメージング技術をライブすることができます。細胞質10,11細胞小器官。単一のセットアップの両方のイメージング技術の組み合わせが過去12,13で実現されている、ただし、ここ (図 1) に示す顕微鏡は最後にライブ イメージング SD 全反射実験を実行する条件を満たしています。3 コマ/秒のスピードで前述のプロセス。この顕微鏡は市販、この原稿の目標は詳細を説明して、画像の取得、登録、および関連付けられている SD 全反射型顕微鏡可視化のためのオープン ソース ツールやプロトコルを提供することです。
セットアップは、独立したポートを介して 2 つのスキャン ユニットに接続されている倒立顕微鏡に基づいている - の左側のポートは全反射し、光活性化/-漂白の SD ユニット、スキャナー ユニットを背面のポートにリンクされる実験。最大 6 レーザー (405/445/488/515/561/640 nm) 励起に使用することができます。励起とどちらか 100 x 蛍光信号の検出/NA1.45 オイルまたは 60 x/NA1.49 オイル全反射の目的、それぞれ採用されています。放出される光はダイクロイック ミラー (561 nm ロングパスまたは 514 nm ロングパス) によって分割し、様々 な帯域通過フィルターによってフィルター処理 (55 nm 幅 525 を中心とした nm、54 nm 幅 609 を中心とした緑と赤の蛍光の nm それぞれ) 2 つの EM CCD カムの前に置かれました。時代 (年号)。Zobiakらのセットアップに関するより技術的な詳細が表示されていることに注意してください。70.5 年頃内光路から移動された SD ユニット全反射構成で s ように同じの 2 台のカメラは、検出に使用することができます、1 年頃と比較すると 2 つの画像診断装置の高速切り替えをできるように、過去に報告された s13 <。/c2 >。この機能により、デュアル チャネル同時取得、したがって 4 チャンネルは SD 全反射イメージング以前で比類のないスピード、精度を実行することができます。また、SD と TIRF 画像間の位置合わせは必要ありません。2 つのカメラ間のイメージの配置は、ただし、実験を開始する前にチェックし必要に応じて修正あります。次のプロトコル登録修正ルーチンは自己 ImageJ マクロで実装されていました。さらに、マクロに sd と、異なる次元にもかかわらず全反射データセットの同時可視化できるように設計されました。集録ソフトウェア自体は、これらの機能を提供しませんでした。
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Protocol
1. 細胞の調製
- 2 日前の実験はシード 6 も細胞培養プレートのウェルあたり完全な成長媒体の 2 mL で 3 * 105 hela 細胞または NIH3T3 細胞です。このプロトコル全体の層流フードのセルを処理するを確認します。
- 実験の前日は、製造元の推奨事項または経験的に決定されるプロトコル、例えばによるとトランスフェクション試薬を準備します。
- Lifeact RFP の 1 μ g と YFP ビンキュリン 200 μ L 減少血清中の合計で 1 μ g を希釈します。渦のトランスフェクション試薬簡潔に、4 μ L 200 μ L の DNA と渦に再度追加します。室温で 15 〜 20 分のトランスフェクション ミックスを孵化させなさい。
- セルに直接滴下全体トランスフェクション ミックスを追加します。プレートを揺することによって混合し、インキュベーターに戻します。
- 実験の日、ライブ イメージングのサンプルを準備します。
- 35 mm ガラス底皿のガラス表面をコートする PBS におけるフィブロネクチンの 10 μ g/mL の溶液を準備します。最適なパフォーマンスの全反射高品質 0.17 mm ガラス coverslips のみを使用し、プラスチック製の底皿を避けます。常温で 30 分はそれを削除し、空気乾燥させる料理のガラス表面にソリューションを残します。
- 1.8 倍の蒸留水で mL あたり 109粒子の密度に 0.1 μ m マルチ蛍光ビーズ ソリューションを希釈し、フィブロネクチン コート ガラス面に 30-60 秒のためのソリューションを追加します。解決策はすぐに削除、空気乾燥させる料理。
注: この手順は、ビーズによる画像登録の 2 色参照イメージを取得および/または細胞を播種する前に全反射面がある場合にのみ必要です。 - 0.1 M アスコルビン酸 (AA) ソリューションを準備し、0.1 mM 成長培地 (AA 中) の最終濃度に希釈します。37 ° C の水浴にソリューションを配置します。
注: 使用蛍光最適化培可能であれば、このような phenolred-無料 (リボ-) フラビン減少中。AA は、ライブ イメージング14中に光毒性の影響を減らすことができる抗酸化剤です。我々 は、この分析では、すなわち複数のセル登場 AA 添加せずより適用される条件の下で健康的な正常にそれをテストしています。ただし、培地の pH は、0.17 pH 単位で下げられました。 - 2 ml の PBS セルを洗浄して、250 μ L を追加トリプシン-EDTA とセルが完全になるまで待つ戸 (37 ° C の定温器で 2-3 分)。再懸濁しますセル 1 mL に慎重にピペットで AA 中で加温、4 ml AA 培地 15 mL 細胞培養管にそれを追加します。顕微鏡の近くの 37 ° C および 5% の CO2に設定インキュベーターに少し開いた蓋の細胞懸濁液を配置します。
- 1 mL ガラス底皿 AA 中で加温し、事前に加熱された顕微鏡のホルダーを追加 (次の段落を参照)。
2. ライブ イメージング
- 安定した 37 ° C、5% CO2湿気のある大気を達成するために顕微鏡の環境制御を開始します。
注: ここでは、小さなステージ トップ インキュベーション室使用されている約 15 分大きいインキュベーター内で許可されている安定した設定が安定した状態を達成するためにより多くの時間を必要があります。 - 細胞懸濁液を適用する前に、顕微鏡で取得のすべての設定を修正します。
- 時間間隔 30 に設定 s と 60-90 分に期間ごとの時点 (値「1」) でオート フォーカスをハードウェア ベースのオート フォーカス機能をアクティブにします。
- カメラの露出とゲイン、すべてのチャネルのためのレーザー出力の調整します。レベルの高利得、低露光時間と低いレーザー力、写真毒性を減らすためにお奨めします。
注: ここに示すデータは 200 ms 露出に買収されました、488 の 0.5 W/cm ² の励起強度に等しいレベル 500 と 20% レーザー電力利得 nm、1 W/cm ² 561 の nm、それぞれ。 - 0.4 μ m 間隔で 10 μ m に回転ディスク チャネルの z スタックを設定します。ド全反射チャンネル z スタックを有効に。ハードウェアのオート フォーカスのフォーカス位置を「0」、すなわち最低平面になります下オフセットを設定します。
- 多地点機能「ステージ ポジション」をアクティブにします。
注: 30 s の時間で 3 つのポジションまでを記録できます。
- 眼またはコンピューターの画面上にエピ蛍光照明蛍光ビーズを見つけるし、全反射チャネルを 1 つをアクティブにし、照射角を全反射照明を示す値に設定。顕微鏡のパネルでボタンを押してオート フォーカスをアクティブにしてオフセットのホイールとフォーカスを調整します。その後ビーズ画像登録、2 色データセット、つまり全反射 488 と全反射-561 を取得 (を参照してくださいポイント 3.1)。
- オプション: 全反射照明を確保するため、追加自由にフローティングの多色蛍光ビーズ懸濁液の数マイクロリットル (を参照してくださいポイント 1.3.2。)。全反射チャネルのライブビューをアクティブにし、照明角度を大ききます。正しい全反射照明8を確保する臨界角を超えて非付着ビーズが消えます。
- 2-3 回、閉管の反転によって再び細胞懸濁液を混ぜるし、セルの 1 mL をイメージングの皿に適用します。
- 低レベル エピ蛍光照明ダブル transfected セルをすばやく見つけます。明視野照明を使用してライブ カメラのプレビューでセルの中心し、位置をマークします。別 1-2 観光名所を検索し、位置リストに保存します。
注: 初めに、セル簡単に外し舞台上の動きのため、それゆえ 4-5 ポジション設定、できますすべて画像の取得を開始する前に再チェックします。その後、1-2 の位置を破棄します。 - 「順序」ボタンをクリックしてしてデータ集録を開始します。
3. 画像の後処理 ImageJ で
- フィジー15で登録無料の hyperstack を生成するためには、2-4 チャンネル SD 全反射蛍光タイムラプス データセットに適用することができる「SD TIRF_helper」という名前のマクロを書かれています。サブフォルダー「マクロ」、フィジーの「SD TIRF_helper_JoVE.ijm」ファイルを保存し、、メニュー コマンドをクリックして、マクロを実行"プラグイン > マクロ > 実行..."。
- カラー チャンネル登録修正が必要、オプションを選択し新しいビーズ ベースの登録参照 (ランドマーク ファイル) を作成または前に作成された既存のファイルを使用します。
注: turboreg プラグイン16は、蛍光ビーズの参照画像に適用されます。プラグインのインストールの一般的なガイドラインに従って、フィジー ソフトウェアのプラグインをインストールします。 - バイオ形式のインポーターとデータをインポートし、表示オプションとして hyperstack を選択します。画像データセットを読み込み、最初の手順と 2 番目のステップで全反射シリーズの SD シリーズを選択します。フィジーは、チャネルとステージの位置、すなわち通常すべて SD のチャンネルとすべての全反射チャンネルは選択されているすべての段階の位置の 1 つ hyperstack として表示で並べ替えられたデータが表示されます。
注: データのインポート、各種ファイルから可能な限りたとえば TIFF シリーズまたはプラットフォーム依存のファイルの種類のように * .nd。それは独立した、圧縮 TIFF 形式として取得ソフトウェアによってエクスポートされなかった場合にのみ、ファイルの種類を認識できません。 - 事前に決められたランドマーク ファイルを読み込み、それぞれのチャンネルに登録補正を適用します。
- すべての SD と全反射チャネルの希望カラー ルックアップ テーブル (LUT) を選択し、それらをマージして単一の多次元 hyperstack。
注: 強度値がゼロの z 平面の数は全反射チャンネルの処理中に SD データセットで z 平面の数と一致する底面の上に追加されます。この手順は、最終的な hyperstack の可視化が重要です。この方法論が正しければ、全反射照明の深さから SD スタックの z ステップ サイズより小さい (200 nm7未満) は (400 nm)。
- カラー チャンネル登録修正が必要、オプションを選択し新しいビーズ ベースの登録参照 (ランドマーク ファイル) を作成または前に作成された既存のファイルを使用します。
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Representative Results
アッセイ開発されました SD 全反射イメージングの可能性を示すために細胞-マトリックス接着複合体との相互作用、細胞骨格細胞接着過程の時空間的組織を明らかにする必要があります。したがって、付着 hela 細胞、あるいは NIH3T3 細胞は 18-24 時間、YFP ビンキュリンと RFP Lifeact を導入させたトリプシン、フィブロネクチン コート ガラス底培養皿上にシードします。これらの細胞株で選択された彼らの顕著な骨格と高い耐性のライブ イメージング実験対照的にたとえば、一次電池。それらは彼らはトリプシン処理後、非常に敏感な状態でイメージング耐えられない可能性があります。顕微鏡で YFP/RFP 発現細胞が選ばれ、接着工程時に観測された 60 分コマ撮り (図 2および映画の 1 と 2)。この特定のアッセイめったといない明確に記載されている文献17,18.また、癒着形成は、例えば移行細胞19,20に調べられた主。したがって、(細胞ライン、コーティング、媒体、組成) を本稿に記載されている実験を遂行するためにこの方法を適応する必要があります。
細胞膜突起した環境を感知し、先頭と弱く付着だけで丸い形が予想通り、基板との接触。細胞マトリックスの連絡先は、いわゆる初期癒着20,21 (図 2 a、全反射 488 チャンネル、時間ポイント 0 4.5 分) の形成にすぐに強化。後者は、細胞の腹側にスポットのように、ビンキュリン肯定的な構造です。構造は TIRF 画像で明確に表示されていた。癒着形成の初めに、アクチンはセルに均等に分布していたし、これらの初期の複合体 (図 2 a、SD 561 チャンネル) にローカライズしました。時間にわたって、接着複合体と拡大焦点接着斑 (図 2) に成熟します。これらの細長い構造 (図 2 a + B) 細胞の周囲で主に明らかにされ、アクトミオシン分子繊維によって発揮された力に起因します。これらの繊維は、接着複合体、それによってセルの中心に向かって、それらを引っ張って、細胞-マトリックス接着斑としてアクチン繊維21の結束の強化を誘発するのに接続し始めた。どうやら、セルもアクチン ネットワーク形成 (図 2 a、XZ ビュー) の結果として平らにしました。SD 画像は高い感度・分解能と完全な観点から、このプロセスを可視化することでここでは、メソッド防音対策済み。以前の報告書17SD 全反射イメージング実験 (図 2 b、17 分、白い矢印の時点) との関連を明らかにしたに対し単独で全反射して周辺の癒着の起源についての推測をできる必要がありますのみ。確かに、アクチン繊維 centripetally ストレスファイバーから新興見えるようになった (図 2 b、黄色の矢印) 27 分後。
しかし、これらの実験、すなわちのアクイジション ・ スピード、励起強度および探知器の利得の取得設定は慎重に評価する必要があります。30 s/timepoint、有効にするマルチ ポイント獲得の間隔は、励起レーザーの放射強度ながら、最適と思われる (0.5 - 1 W/cm ²) 重要な考慮事項の下で撮影する必要があります。図 2 Dは、基板へのアタッチに失敗した同じ実験で異なる位置にセルを表示します。膜は 60 分、おそらくアポトーシス (映画 2) に似た年頃バブルの後で最終的に起因するここでは、細胞の生物学、光毒性効果に影響可能性があります。どのように敏感な細胞を再度明らかにしたこれは光毒性に対応できる、それが光の量のバランスは、検索と情報が取り出されていることが重要です。レーザー パワーを削減、z スタックまたは利得増加のイメージの数は光毒性を減らすための正しい戦略かもしれない。これらの設定は、しかし、調整してください十分な分解能と信号対雑音比を達成することができますレベルで記録された時間の経過から量的情報を抽出できるように。
図 1: SD 全反射セットアップの図。A. SD 画像モード: 6 異なるレーザー ライン (405/445/488/515/561/640nm、グリーン ライン) は、SD ('の' の位置) と顕微鏡本体 (MIC) に空のフィルター キューブを通過共焦点スキャン単位 (CSU) に結合されています。別のダイクロイック ミラーなど2 つの異なる EM CCD カメラ (C1 と C2) に、赤/緑または黄色/水色の同時集録可能で SD と分割のピンホールを通して (仕様) 標本からの蛍光発光映します。蛍光フィルター、(表示されていません) カメラの前に配置されます。B.全反射イメージング モード: 全反射スキャナー (TIRF) にレーザー ラインが結合されています。マイクのビームスプリッターで複数回線が試料にビームを指示し、放射光をバイパス最大伝送用 SD ('アウト')。蛍光が同じカメラで検出され、排出フィルターに記載されている a.この図は、Zobiakらから変更されています。7この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: SD 全反射蛍光顕微鏡を用いた細胞の広がりおよび接着形成の代表の結果。A. RFP Lifeact (赤、SD 561 チャンネル) と YFP ビンキュリン (緑、全反射 488 チャンネル) を表現するダブル transfected HeLa 細胞がトリプシンおよび再シードにフィブロネクチン コート ガラス coverslips。癒着形成が容易に表示されます、約 5 分後より大きい焦点接着斑へと発展 0 分で小さな新生癒着 (ビンキュリン陽性スポット) から始まります。皮質アクチンを伸ばし (12 と 24.5 分フレームを参照) 細胞の周辺でおよそ 10 分後に感じ取ることができます。B.細胞拡散および焦点に新生癒着と同様に糸状の癒着 (白い矢印) とストレス繊維の形成 (27 分フレームを参照してくださいからの移行 (45 分枠) で箱入りの地域の拡大図を示しています黄色の矢印)。A. D.の描かれた黄色破線のC. Kymograph(写真 -)細胞やそれ以外の場合不健康な細胞毒性作用させることができます基板にアタッチに失敗します。画像条件は、光毒性を除外するために批判的に評価しなければなりません。スケール バー = 5 μ m (a と D)、2 μ m (B と C)。A と D は、そこに描かれた白い点線から抽出した直交射影 XZ ビュー (下基板を =)。画像は直線的造影し、3 x 3 カーネルとメジアン フィルター.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
映画 1: 図 2 a でタイムラプス シーケンスの 3次元再構成します。イメージ シーケンスは、イメージング ソフトウェア 3 D でレンダリングされました。期間: 42.5 分レート: 2 のデュアル チャンネル SD 全反射スタック/分 (合計 56 フレーム) に買収されました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
映画 2: 図 2 c. でタイムラプス シーケンスの映画所要時間: 60 分レート: 2 のデュアル チャンネル SD 全反射スタック/分 (合計 56 フレーム) に買収されました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
本稿で示したライブセル イメージング実験、3 の異なるステージで 1 分あたり 2 SD 全反射画像のスタックなど高い獲得率すなわちを実行に適した構成で SD と全反射顕微鏡の最初の成功の実装合計 (およそ毎秒 3 フレーム)、168 のフレームに対応する位置に買収されました。されたいくつかの SD 全反射顕微鏡は前述12,13、主に、3 D の細胞プロセスに従うことの十分に高いイメージング速度の不足 2 未満の時間分解能画像のスタックあたり s がしばしば必要。提示セットアップは 1 秒あたり 0.78 画像のスタック最大イメージング、3.5 の転送速度を達成できる調査 3 D 小胞ダイナミクスがされているライブの実験で大きな画像のスタック毎秒7を示した。さらに、前の SD 全反射顕微鏡イメージング モードでは、さらに多チャンネル集録速度を下げるあたり 1 つだけ検出器があった。技術的には、分割ビュー構成を実装できるシステムにもできる同時のデュアル カラー取得単一のカメラと。これは、ただし、視野の半分だけの画像を許可でしょう。広視野イメージング デコンボリューションや 3 D 超解像顕微鏡との併用の高時空間的解像度の多次元データセットを生成する他の方法すなわち3 D SIM または格子光シート顕微鏡22,23、有効な代替手段があります。ただし、デコンボリューション ベースのイメージングは簡単に低い信号対雑音比の買収の画像アイテムを導入できます (、それは中ケースではしばしばライブ イメージング アプリケーション)、ライブ イメージング 3 D 超解像は技術的にまだ精緻化とやりがいのある仕事です。高度な SD 全反射設定7の提示の実現の利点は検出パスのうちデュアル ディスクを移動できるの SD ユニットで撮影されました。この構成は、2 つの主要な利点を提供します: 最初に、同じの 2 台のカメラは SD と全反射信号、これらの 2 つのチャンネルの高精度重複の結果を検出する使用ことができます。第二に、回転ディスクのピンホールがないように任意の放射光全反射・ アクイジション ・ モードで動作している場合 (詳細については、図 1 bを参照)、したがって高感度ライブ イメージングの重要なコレクションの効率を向上します。したがって、この光の構成は SD ユニットをバイパス可能な既存の SD 顕微鏡に全反射型顕微鏡 (可変または固定角度照明など) の任意の種類を実装するために好ましい。さらに、使用される全反射スキャナー実行できるいわゆるタイムシェア リングでは、全反射の 2 つのチャンネルを同時に記録できる (Zobiakらに示すよう。7)、スピード違反多チャンネル データ集録をさらにアップします。
全反射を採用の最大の利点の 1 つは、この方法では、イメージング実験生命細胞中に細胞膜からの信号を高い精度でローカライズすることが可能です。SIM を提供より良い z 区分とそのために細胞膜の分離が強化修正ライブセル イメージング実験のサンプル、指数関数的増加/減少細胞小器官に近づいてからの蛍光信号の方法論の中に確かに、/全反射インターフェイスしたまま細胞膜のより具体的かつ正確な局在を許可しました。定位精度がまだ量を示される、150-200 nm より小さい多くの襞をすることを約束すなわちエヴァネッセンス フィールドの空間的範囲。
現在、法の制限は、光路から回転ディスク ユニットを外し、全反射の獲得、すなわち0.5 s を起動に必要な時間です。この遅延は、2 つの連続した買収間の最小時間間隔を制限します。技術的には、それは例えばガルバノ ミラーを使用してディスクをバイパスして、SD 全反射サイクルごとの全体的な獲得の減少からこの遅延を減らすためにできるはずです。また、新しい世代のカメラが、高い信号対雑音比で縮小露光時間を許可します。したがって、このセットアップの全体的なパフォーマンスが、まだ適切にハードウェア コンポーネントをアップグレードすることによって改善できます。イメージングの視点からあるが、(降順) で捕捉時間を最小限に抑えるためのいくつかの他の方法: 複数のポジションを避けるため、z スタック高さを減少、z 間隔、露光時間 (増加を得るため、おそらく使用を最小限に抑える取得位置の間の距離を短縮し、オート フォーカスをアクティブにビニング)、すべての n 番目の時間ポイントのみ (n > 1)。実際制限があるにもかかわらず、それらのすべてのパラメーターを慎重に評価し場合、に、SD 全反射 Zobiakらに提示されている追跡および高速移動の細胞小胞のローカライズのイメージングを使用することが可能です。7。
また、本稿の獲得を記述するプロトコルでシングル チャンネル SD 全反射データセットのルーチンが発表されました。指定されたマクロを使用して、生データはすべて SD と全反射チャンネルを含む単一の TIFF ファイルにエクスポートできます。画像の登録が自体必要ではない;ただし、両方のカメラが互いに対して正確に整列することが重要です。残りのピクセル シフト (翻訳および回転) を検出して修正できる指定されたマクロ内で。補正アルゴリズム実験を開始する前にちょうど記録を持つ蛍光ビーズのマルチ チャネル参照イメージを使用します。結果として得られるファイルに全反射平面は SD チャンネルの次元は一致するゼロの強度面の数字が続く最も低いレベルに設定されます。つまり、データを取得することが重要プロトコルに従ってイメージの全反射平面が SD チャンネルの設定 z スタックの下端に似ています。
最終的にシステムが、可能性がありますが拡張 SIM モジュールまたは最近導入されたマルチ アングル観察24,25さらに空間分解能。ただし、空間分解能の向上を達成できます、遅いイメージング速度を犠牲にしてだけの現在の状態のアートによると。とはいえ、残りの細胞容積の高空間分解能を維持する細胞膜の構造をローカライズする重要な実験の画像すべての生きているセルにここ説明 SD 全反射しては、すぐに利用できる統合がちソリューションです。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
科学界の医療センター ハンブルク大学エッペンドルフ評価用サンプルで私たちを支援するため大いに感謝いたします。すなわち、NIH3T3 細胞、YFP ビンキュリンのアンドレア ・ Mordhorst と RFP Lifeact のマレン ルドルフをザビーネ Windhorst を感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
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