Summary
Расширенные микроскопов, которые позволяют быстро и с высоким разрешением изображений, изолированные плазматической мембраны и окружающие внутриклеточных объем, будет представлен. Интеграция спиннинг микроскопии флуоресцирования внутреннее отражение диска и всего в одной установки позволяет жить изображений эксперименты на приобретение высокой ставки до 3.5 сек на стек изображений.
Abstract
В живых клетках процессы, такие как формирование адгезии включать широкие структурные изменения в плазматической мембраны и внутренних ячейки. Для того, чтобы визуализировать эти весьма динамических событий, были объединены два взаимодополняющих световой микроскопии методы, которые позволяют быстро изображений живых образцов: спиннинг диск микроскопии (SD) для записи объем быстро и с высоким разрешением и полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF) для точной локализации и визуализации плазматической мембраны. Всеобъемлющей и полной визуализации протокол будет показан для руководящих через пробоподготовки, калибровки микроскопа, формирования изображений и приобретения, что приводит к многоцветные SD-TIRF живой серии изображений с высоким разрешением пространственно временной. В макросе самостоятельной письменной предусмотрено все необходимое изображение после обработки шаги для создания многомерной живой визуализации наборов данных, т.е. регистрации и сочетание отдельных каналов, с открытым исходным кодом ImageJ. Изображения флуоресцентных белков во время посвящения и созревания адгезии комплексов, а также формирование актина цитоскелета сети, была использована как доказательство принципа для этот новаторский подход. Сочетание 3D микроскопия высокого разрешения и TIRF содержится подробное описание этих сложных процессов в пределах клеточной среды и, в то же время, точной локализации мембраны связанных молекул, обнаружены с высоким Соотношение сигнал фон.
Introduction
Наших дней, световой микроскопии методы обеспечения высокой/супер резолюции изображений в фиксированной и живой образец быстро развиваются. Суперразрешением методы, такие как стимулировали выбросов истощения (интереса), структурированные освещения микроскопии (SIM) и фото активации локализации микроскопии (PALM) или прямой стохастических оптических реконструкции микроскопии (буря), соответственно, являются коммерчески доступных и включение изображений внутриклеточных структур, показывая детали почти на молекулярном уровне1,2,3,4,5,6. Однако эти подходы имеют ограниченную применимость для живых изображений экспериментов, в которых большие объемы нужно быть визуализированы с несколько кадров в секунду скорость приобретения. Разновидности весьма динамических процессов, регулируется через плазматическую мембрану, например Эндо- / экзоцитоз, адгезии, миграции или сигнализации, происходят с высокой скоростью в пределах крупных сотовых томов. Недавно для того, чтобы заполнить этот пробел, интегрированный микроскопии техника была предлагаемая называется спиннинг диска TIRF (SD-TIRF)7. В деталях TIRF микроскопии позволяет специально изолировать и локализовать плазматической мембраны8,9, в то время как SD микроскопии является одним из наиболее чувствительных и быстро жить методы визуализации для визуализации и отслеживания внутриклеточных органелл в цитоплазме10,11. Сочетание обоих методы визуализации в одиночной установки уже был реализован в прошлом12,13, однако, Микроскоп, представленные здесь (рисунок 1) наконец отвечает критериям для выполнения живых изображений SD-TIRF эксперименты из вышеупомянутых процессов в 3 кадров в секунду скорость. Поскольку этот Микроскоп является коммерчески доступных, цель этой рукописи — описать в деталях и предоставлять открытым исходным кодом инструменты и протоколы для захвата изображений, регистрации и визуализации, связанный с SD-TIRF микроскопии.
Установки на основе инвертированным микроскопом, подключенных к блокам два сканирования через независимых порта - левый порт связан с блоком SD и задней порт блок сканера для TIRF и фото активации / отбеливания экспериментов. До 6 лазеры (405/445/488/515/561/640 Нм) могут быть использованы для возбуждения. Для возбуждения и обнаружения сигнала флуоресценции, либо 100 x / NA1.45 масло или 60 x / NA1.49 масло TIRF цели, соответственно, были заняты. Испускаемого света расколот дихроичное зеркало (561 Нм Лонг Пасс или 514 Нм Лонг pass) и фильтруется различными полосовые фильтры (55 Нм широкий центрированного 525 Нм, 54 Нм широкий центрированного 609 Нм для зеленой и красной флуоресценцией, соответственно) перед двумя EM-CCD камеры Эра. Пожалуйста, обратите внимание, что более подробные технические сведения об установке перечислены в Zobiak и др. 7. в TIRF конфигурации SD блок перемещается из света путь в течение около 0,5 s так, что же две камеры могут быть использованы для обнаружения, позволяя быстрое переключение между двумя визуализации формы, по сравнению с около 1 s, что было сообщено в прошлом13 < /C2 >. Эта функция позволяет одновременное приобретение двойного канала, таким образом 4 канала SD-TIRF изображений на ранее непревзойденную скорость и точность могут быть выполнены. Кроме того выравнивание между SD и TIRF образов ненужной. Выравнивание изображения между двумя камерами, однако, должна проверяться перед началом эксперимента и исправления в случае необходимости. В следующий протокол в макросе самостоятельной письменной ImageJ был реализован обычной регистрации коррекции. Кроме того макрос был главным образом позволяют одновременное визуализация SD - и TIRF наборов данных, несмотря на их различные размерности. Приобретение программного обеспечения, сама не представила эти возможности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеток
- За два дня до эксперимента, семян 3 * 105 HeLa или NIH3T3 клетки в 2 мл полного роста среднего за хорошо пластины 6-ну культуры клеток. Убедитесь, что клетки обрабатываются в Ламинарный шкаф на протяжении настоящего Протокола.
- Один день до эксперимента, подготовьте трансфекции реагентов в соответствии с рекомендациями изготовителя или эмпирически определяется протоколом, например:
- Разбавьте 1 мкг ЗП-Lifeact и 1 мкг рекламы ЯФП-Vinculin в общей сложности 200 мкл сокращение сыворотке среды. Вихревой трансфекции реагент кратко, мкл 4 200 мкл ДНК и вихрь снова. Инкубируйте трансфекции смесь для 15-20 минут при комнатной температуре.
- Добавьте смесь всего трансфекции каплям непосредственно к клеткам. Mix встряхнув тарелку и поместите его обратно в инкубаторе.
- В день эксперимента Подготовьте образец для живых изображений:
- Подготовка 10 мкг/мл раствора фибронектин в PBS для покрытия поверхности стекла 35 мм стекла дно тарелки. Используйте только высококачественные 0,17 мм стекла coverslips для оптимальной производительности TIRF и избежать пластика дно блюда. Оставьте раствор на поверхности стекла, за 30 мин при комнатной температуре, затем удалите ее и просушите пусть блюдо.
- Разбавить раствор мульти флуоресцентные бусины 0,1 мкм плотность 1.8 x 109 частиц на мл в дистиллированной воде и добавьте в решение для 30-60 s фибронектин покрытием стеклянной поверхности. Немедленно удалите решение и пусть блюдо воздушно-сухой.
Примечание: Этот шаг необходим, только если TIRF плоскости должно быть найдено до заполнения ячеек или приобрести 2-цветный эталонный образ для регистрации на основе бисера образ. - Приготовляют раствор аскорбиновой кислоты (AA) 0,1 М и разбавляют до конечной концентрации 0,1 мм среднего роста (AA-средний). Поместите раствор в ванну воды 37 ° C.
Примечание: Используйте оптимизированные флуоресценции клеток питательной среды, если это возможно, такие как phenolred бесплатный и Флавин снижение среднего (Рибо-). АА является анти окисляющий агент, который может уменьшить фототоксических эффекты во время живых изображений14. Мы проверили это успешно в этом assay, т.е. больше клеток появился здоровый на условиях, применяемых чем без добавления AA. Однако рН среды была снижена на 0,17 единицы pH. - Вымыть клетки с 2 мл PBS, 250 мкл трипсина-ЭДТА и ждать, пока клетки являются полностью отсоединяется (2-3 мин в инкубаторе 37 ° C). Ресуспензируйте клетки тщательно в 1 мл предварительно разогретую AA-средний с пипетки и добавить его в 4 мл AA-средний в трубы культуры клеток 15 мл. Место суспензию клеток с слегка открытой крышкой в инкубаторе, равным 37 ° C и 5% CO2 неподалеку от Микроскоп.
- Добавить 1 мл предварительно разогретую AA-средний блюдо дно стекла и поместите его в держатель подогретую микроскопа (см. следующий пункт).
2. живой изображений
- Запуск экологического контроля микроскоп для достижения стабильной 37 ° C, 5% CO2 и влажной атмосфере.
Примечание: Здесь, палата верхней инкубации маленькую сцену был использован разрешенных стабильные параметры в течение примерно 15 минут больше инкубаторы потребуется больше времени для достижения стабильных условий. - Исправить все приобретения параметры в Микроскоп, перед применением суспензию клеток:
- Задать интервал времени до 30 s и продолжительностью до 60-90 мин активировать автоматический пистолет фокус функция аппаратного авто фокус на каждый момент времени (значение «1»).
- Настройка экспозиции камеры и выгоды, а также мощности лазера для каждого канала. Высокие уровни усиления, низким воздействия времени и мощности лазера низкой рекомендуется уменьшить фото токсичность.
Примечание: Данные, представленные здесь была приобретена с 200 мс экспозиции, получить уровень 500 и 20% мощности лазера, которая равна интенсивности возбуждения 0.5 Вт/см² для 488 нм и 1 Вт/см² для 561 Нм, соответственно. - Установка z стек каналов спиннинг диск до 10 мкм с шагом 0,4 мкм. Деактивировать z стеки каналов TIRF. Смещение в нижней части-«0», т.е. плоскости низкие будет фокус позиции оборудования авто фокус.
- Активируйте функцию многоточечный «этап позиции».
Примечание: До 3 позиции могут быть записаны в интервале времени 30 s.
- Найти флуоресцентные бусины с epi дневного освещения на окуляр или на экране компьютера, затем активировать один канал TIRF и задать угол освещения в значение, которое обозначает TIRF освещения. Активировать в авто фокус, нажав на кнопку на панели микроскоп и настроить фокус с помощью смещения колесика. Приобрести 2-цветной набор данных, то есть TIRF-488 и TIRF-561, для регистрации последующих шарик-изображений (см. пункт 3.1).
- Необязательно: Чтобы TIRF освещения, добавьте несколько микролитров свободно Плавающая подвеска флуоресцентные разноцветные бусы (см. пункт 1.3.2.). Активировать живой просмотр канала TIRF и увеличить угол освещения. Non сторонник шарики исчезнут за критический угол, обеспечивая правильное освещение TIRF8.
- Перемешать суспензию клеток снова, инвертирование закрытой трубе 2 - 3 раза и применять 1 мл клеток к визуализации блюдо.
- Быстро найти двойной transfected клеток с низкого уровня epi дневного освещения. Центр ячейки в окне предварительного просмотра живой камеры, используя яркие области освещения и отметьте положение. Найти еще 1-2 точек интереса и сохранить их в списке positions.
Примечание: В начале, клетки легко можно отсоединить благодаря сценическое движение, поэтому 4-5 позиций и перепроверить все перед началом захвата изображений. После этого отказаться от позиции 1-2. - Начало сбора данных, нажав на кнопку «Последовательности».
3. После обработки в ImageJ
- Чтобы создать без регистрации hyperstack в Фиджи15, была написана макрос с именем «SD-TIRF_helper», которые могут применяться для 2-4 канала SD-TIRF timelapse наборов данных. Сохраните файл «SD-TIRF_helper_JoVE.ijm» в Фиджи подпапки «макросы» и запустите макрос, щелкнув на команде меню «Плагины > Макрос > Run...».
- Если цветовые каналы регистрации коррекции, выберите вариант и создать новую ссылку регистрации на основе бисера (ориентир-файл) или использовать существующий файл, который был создан раньше.
Примечание: Turboreg плагин16 будет применяться к флуоресцирования бусины исходных образов. Установите плагин в Фиджи программное обеспечение согласно общие руководящие принципы для установки плагина. - Импорт данных с био форматы импорта и выбрать hyperstack как вариант просмотра. Загрузить набор данных изображения, выберите SD-серии в первый шаг и TIRF-серии на втором шаге. Фиджи будет отображать данные, отсортированные по канала и стадии позиции, т.е. обычно все SD-каналы и все TIRF-каналы показывают как один hyperstack для каждой стадии позиции, который был выбран.
Примечание: Импорт данных из различных типов файлов, например TIFF-серии или зависящих от платформы файлов типы, такие как * .nd. Тип файла не могут быть признаны только, если он не был экспортирован на приобретение программного обеспечения как независимые, сжатия менее TIFF формат. - Применить коррекцию регистрации по соответствующим каналам, загрузив файл заранее достопримечательности.
- Выберите желаемый цвет просмотровые таблицы (LUT) для каждого канала SD - и TIRF и объединить их в единый, многомерные hyperstack.
Примечание: Во время обработки TIRF каналов, количество z самолетов с нулевыми значениями интенсивности добавляются поверх нижней плоскости, совпадает с числом z самолеты в наборе SD. Этот шаг важен для визуализации окончательной hyperstack. Эта методология является правильным, поскольку глубина TIRF освещения (менее7200нм) меньше, чем размер z шаг SD стека (400 Нм).
- Если цветовые каналы регистрации коррекции, выберите вариант и создать новую ссылку регистрации на основе бисера (ориентир-файл) или использовать существующий файл, который был создан раньше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того, чтобы показать потенциал изображений SD-TIRF, assay был разработан, должен раскрыть пространственно временной организации комплексов адгезии клеток матрица и их взаимодействие с цитоскелета во время клеточной адгезии. Таким образом сторонник HeLa или, альтернативно, NIH3T3 которую клетки были transfected с рекламы ЯФП-Vinculin и ЗП-Lifeact за 18-24 ч, trypsinized и посеян на фибронектин покрытием стекла дно блюда. Эти клеточные линии были выбраны для их произносится цитоскелета и более высокой надежности в живых изображений эксперименты, отличие, например, Главные ячейки. Те не могут выдерживать изображений в очень чувствительных состоянии, как они после лечения трипсина. В Микроскоп рекламы ЯФП/ППП выражая клетки были отобраны и адгезии процесса наблюдается в течение 60 мин промежуток времени (рис. 2 и фильмы 1 и 2). Этот конкретный assay редко и четко не был описан в литературе17,18. Кроме того формирования адгезии главным образом изучено в например мигрирующих клеток19,20. Таким образом нам необходимо адаптации этой методологии (линия клетки, покрытие, средний, композиция), для того, чтобы проводить эксперименты, описанные в этом документе.
Как и ожидалось, клетки были круглые в начале и только слабо приверженцев, тогда как мембрана выступы зондирования окружающей среды и делает контакт с подложкой. Ячейки матрицы контакты быстро укрепить после формирования так называемых зарождающейся спайки20,21 (рисунок 2A, TIRF-488 канала, время точки 0-4,5 мин). Последние являются спот как, Vinculin положительных структур на вентральной стороне клетки. Структуры были четко видны на снимках TIRF. В начале формирования адгезии, актина равномерно распределены в ячейке и сделал не локализовать в этих ранних комплексы (рис. 2A, SD-561 канал). В течение времени комплексы сцепления расширен и созрела для фокуса спаек (рис. 2 c). Эти удлиненные структуры были преимущественно очевидны на периферии клетки (цифры 2A + B) и в результате сил, которые были оказываемое acto миозина волокон. Эти волокна начал подключиться к адгезии комплексов, тем самым потянув их к центру ячейки и вызывая укрепление ячейки матрицы спайки, а также планшеты актина волокна21. По-видимому клетки также плоский результате актина формирование сети (рисунок 2A, вид XZ). SD-изображений оборудована быть методом выбора здесь, поскольку это позволяет визуализировать этот процесс с высокой чувствительностью, пространственное разрешение и с точки зрения полной. В предыдущем докладе17TIRF только может только пусть спекулировать о происхождении периферийных спайки, тогда как SD-TIRF изображений четко показали свои ассоциации с filopodia (Рисунок 2B, момент 17 мин, белые стрелки). Действительно актина волокна centripetally переживших фокуса спайки стал видимым после 27 мин (Рисунок 2Б, желтая стрелка).
Однако приобретение параметры этих экспериментов, т.е. приобретение скорость, увеличение интенсивности и детектор возбуждения, должны тщательно оцениваться. Интервал 30 s/timepoint, благоприятных multi точка приобретение, как представляется, быть идеальным, а интенсивность излучения лазерного возбуждения (между 0,5-1 Вт/см²) необходимо принимать под критического рассмотрения. 2D фигура отображает ячейки в другую позицию в том же эксперимент, который не удалось присоединить к подложке. Это возможно, что фототоксических эффекты затрагивают биологии клетки здесь, который наконец привели к мембране восходящей после около 60 мин, возможно напоминающие апоптоз (фильм 2). Это еще раз ясно как чувствительные клетки могут реагировать Фототоксичность и что оно очень важно найти хороший баланс между количеством света, положить в и информации, принимаемых. Уменьшение мощности лазера, количество изображений в z стек или увеличивая прибыль может быть правильную стратегию для сокращения Фототоксичность. Все эти параметры, однако, должна быть скорректирована на уровне, который по-прежнему позволяет добиться достаточно резолюции и соотношение сигнал-шум, позволяет извлечь из записанных замедленная количественную информацию.
Рисунок 1: схема, чертеж установки SD-TIRF. A. SD изображений режим: 6 различных лазерных линий (405/445/488/515/561/640nm, зеленые линии) соединены в конфокальный сканирующий блок (ХСС), проходя через SD (позиция «В») и пустой фильтр куб в организме микроскоп (MIC). Флуоресценции выбросов от образца (SPEC) прогнозируется через проколы SD и Сплит различных дихроичных зеркал, например зеленый/красный или желтый/голубой Одновременное приобретение, на два разных EM-CCD камеры (C1 и C2). Флуоресценции фильтры помещаются перед камерами (не показан). B. TIRF изображений режим: лазерные линии соединены в TIRF сканер (TIRF). Многострочные пучка сплиттер в ВПК направляет луч образца и излучение света обходит SD («OUT») для максимальной передачи. Флуоресценции обнаружения же камеры и выбросов фильтров описано в а. Этот рисунок был изменен с Zobiak и др. 7 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель результаты формирования распространения и адгезии клеток с помощью микроскопии SD-TIRF. A. двойной transfected клеток HeLa, выражая ЗП-Lifeact (красный, SD-561 канал) и рекламы ЯФП-Vinculin (зеленый, TIRF-488 канал) были trypsinized и вновь посеяны на фибронектин покрытием стекла coverslips. Адгезии формирования становится легко видимой, начиная с небольших зарождающейся спаек (Vinculin позитивных пятна) на 0 минут, которые развиваются в больше фокуса спайки после около 5 минут. Корковых актина очевидной после около 10 минут и простирается на периферии клетки (см. кадры на 12 и 24,5 минут). Б. увеличенное изображение в штучной упаковке региона (рамка 45 минут) изображает распространения клеток и переход от нарождающейся для фокуса спайки, а также связанные filopodia спаек (белая стрелка) и образование волокна стресса (см рама на 27 минут, Желтая стрелка). C. кимограф пунктирной желтой линии, нарисованной в A. D. (Фото-) Токсическое воздействие на клетки или иным образом нездоровых клеток может позволить им не удастся прикрепить к подложке. Должны оцениваться критически для того чтобы исключить Фототоксичность изображений условия. Шкалы бар = 5 мкм (в A и D) и 2 мкм (B и C). В A и D являются ортогональной проекции, извлеченные из пунктирные белые линии, нарисованные в нем мнения XZ (снизу = субстрата). Изображения были линейно контраст расширение и фильтруют медиана с ядром 3 x 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: 3D-реконструкция timelapse последовательности в рис. 2A. Последовательность изображений было вынесено с 3D визуализации программного обеспечения. Продолжительность: 42,5 мин приобретение скорость: были приобретены 2 двухканальная SD-TIRF стеки в минуту (56 кадров в общей сложности). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм 2: фильм timelapse последовательности на рис. 2 C. Продолжительность: 60 мин приобретение скорость: были приобретены 2 двухканальная SD-TIRF стеки в минуту (56 кадров в общей сложности). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом документе было представлено первое успешное осуществление микроскопии SD и TIRF в конфигурации подходит для проведения живых клеток экспериментов и изображений, т.е. приобретение высокой ставки как 2 SD-TIRF стеки изображений в минуту в 3 различными этап позиции, соответствующие в общей сложности 168 фреймов (около 3 кадров в секунду), были приобретены. Несколько SD-TIRF Микроскопы, которые были описаны ранее12,13, главным образом отсутствием достаточно высокой скорости визуализации следовать клеточных процессов в 3D, в котором временное разрешение менее 2 сек на стек изображений часто необходима. Представлены установки можно добиться изображений до 0,78 стеки изображений в секунду, а темпы 3,5 сек на большое изображение стека в живой экспериментов были следственный 3D везикул динамика продемонстрировал7. Кроме того предыдущий Микроскопы SD-TIRF был только один детектор за изображений режим, дальнейшее сокращение скорости для многоканальных приобретений. Технически в тех системах, которые Сплит Просмотр конфигурации могут быть реализованы, также позволяет одновременное приобретение двухцветный с одной камеры. Это, однако, позволило бы изображений только половина из поля зрения. Другие методы для производства многомерных наборов данных с высоким разрешением пространственно временных, такие, как widefield изображений в сочетании с деконволюция или 3D супер резолюции микроскопии, то есть 3D SIM или решетка свет лист микроскопии22, 23, может быть действенными альтернативами. Однако, на основе деконволюция изображений можно легко ввести артефакты изображения в низкий сигнал шум коэффициент поглощения (как это часто случается во время живут визуализации приложений), и до сих пор технически elaborative суперразрешением 3D live изображений и сложной задачей. В представленной реализации передовых SD-TIRF установки7преимущество было принято SD устройства, что позволяет перемещение двойной диск и выходить из пути обнаружения. Эта конфигурация дает два основных преимущества: во-первых, же две камеры могут использоваться для обнаружения, SD и TIRF сигнала, что приводит к высокой точности совпадения этих двух каналов. Во-вторых, проколов на вращающийся диск не блокируют свет выбросов при работе в режиме приобретения TIRF (для более подробной информации, см. рис. 1B), тем самым увеличивая эффективность сбора важных для высокочувствительные живых изображений. Следовательно этот оптических конфигурации благоприятные для реализации любого рода TIRF микроскопии (например , фиксированной или переменной угол освещения) в существующих SD-Микроскопы, которые позволяют, минуя блок SD. Кроме того, используемые TIRF сканера можно запустить в режиме так называемые режиме разделения времени, где два TIRF каналы могут быть записаны одновременно (как показано в Zobiak и др. 7), ускоряя дальше вверх на приобретение многоканальных данных.
Один из самых больших преимуществ использования TIRF это, с этой методологией, можно локализовать с высочайшей точностью сигнала, исходя из клеточной мембраны в течение жизни клеток, визуализации эксперимент. Действительно, в то время как методологии как SIM обеспечивает лучше z секционирование, и таким образом лучше изоляции клеточной мембраны в фиксированной образцов, в живой клетке изображений эксперименты экспоненциального увеличения/уменьшения флуоресценции сигнала от органеллы приближается / оставляя TIRF интерфейс допускается более конкретной и точной локализации клеточной мембраны. Точность локализации, хотя не все еще количественно, обещает быть много складок меньше, чем 150-200 Нм, т.е. пространственный спектр Эванесенс поля.
В настоящее время ограничение метода является время, необходимое для снимите блок диска спиннинг с пути света и начать приобретение TIRF, т.е. 0.5 сек. Эта задержка ограничивает минимальный интервал времени между двумя подряд приобретений. Технически это должно быть возможным сократить задержки через обход диск с например гальво зеркала и уменьшая общую приобретения такт SD-TIRF. Кроме того новые поколения камер может позволить раз снижение воздействия на высокое соотношение сигнал шум. Таким образом общая производительность этой установки может по-прежнему уместно улучшена путем модернизации аппаратных компонентов. С точки зрения обработки изображений, однако, существует несколько других способов, чтобы свести к минимуму время приобретения (в порядке убывания): избежать несколько позиций, уменьшить высоту z стека, увеличить z интервалов, свести к минимуму время экспозиции (увеличение получить и возможно использовать биннинга), сократить расстояние между позициями приобретения, активировать автоматический пистолет фокус только каждая точка n й раз (n > 1). Несмотря на фактические ограничения если все эти параметры тщательно оцениваются, это можно использовать SD-TIRF изображений для отслеживания и локализации быстроподвижные сотовой везикулы, как представлены в Zobiak и др. 7.
Кроме того в этом документе протокол, который описывает приобретение процедуру набора данных SD-TIRF один канал был представлен. Используя предоставленные макрос, исходные данные могут быть экспортированы в одном TIFF-файл, содержащий все каналы SD - и TIRF. Регистрация изображения является само по себе не обязательно; Однако важно, что обе камеры точно выровнены друг относительно друга. Оставшиеся пиксель смены (перевод и вращение) можно обнаружить и исправить в пределах предоставленного макрос. Алгоритма коррекции делает использование многоканальных эталонного образа флуоресцентные бисера который должен регистрироваться только до начала эксперимента. В результирующем файле TIRF самолет находится на низком уровне, последовал ряд нулевой интенсивности самолетов, которые соответствуют их размерность SD-канала. Таким образом важно для получения данных, как указано в протоколе, где плоскости фотосъемка TIRF напоминает нижний конец z стека для SD канал.
И наконец системы может быть потенциально продлен SIM модуля или недавно представила Multi-угол TIRFM24,25 до дальнейшего увеличения пространственного разрешения. Однако увеличение пространственного разрешения может быть достигнуто, согласно текущей состояние искусства, только за счет медленнее изображений скорости. Для всех живых клеток, визуализации эксперименты, в которых важно локализовать структур на плазматической мембране, хотя и поддержания высокого пространственного разрешения оставшихся клеточного объема здесь описывается установка SD-TIRF это легко интегрировать, легко доступны решение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы сильно благодарю научного сообщества из университета медицинский центр Гамбург-Эппендорф за поддержку нас с образцами для оценки. А именно мы благодарим Sabine Windhorst для NIH3T3 клеток, Андреа Mordhorst для рекламы ЯФП-Vinculin и Рудольф Maren для ЗП-Lifeact.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
