Summary
En avanceret mikroskop, der tillader hurtig og høj opløsning vil imaging isolerede plasma membranen og de omkringliggende intracellulære volumen, blive præsenteret. Integration af spinning disk og total interne reflection Fluorescens mikroskopi i én installation tillader live imaging eksperimenter til høje anskaffelses priser op til 3,5 s pr billedstak.
Abstract
I levende celler indebærer processer såsom vedhæftning dannelse omfattende strukturelle ændringer i plasma membranen og kraterets celle. For at visualisere disse meget dynamiske begivenheder, to komplementære lysmikroskopi teknikker, der giver mulighed for hurtig billeddannelse af levende prøver blev kombineret: spinning disk mikroskopi (SD) for hurtig og høj opløsning volumen optagelse og total interne reflection Fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi for præcise lokalisering og visualisering af plasmamembran. En omfattende og komplet imaging protokol bliver vist for at lede gennem prøveforberedelse, mikroskop kalibrering, billede dannelse og erhvervelse, hvilket resulterer i flerfarvet SD-JOHANNAS live imaging serien med høj spatio-temporal opløsning. Alle nødvendige billedet efterbehandling skridt til at generere multi-dimensional live imaging datasæt, dvs registrering og kombinationen af de individuelle kanaler, leveres i en selvstændig skriftlig makro for open source-software ImageJ. Billeddannelse af fluorescerende proteiner under indledningen og modning af adhæsion komplekser, samt dannelsen af actin cytoskeletal netværket, blev brugt som et bevis på princippet for denne nye fremgangsmåde. Kombinationen af høj opløsning 3D mikroskopi og JOHANNAS forudsat en detaljeret beskrivelse af disse komplekse processer inden for cellulære miljø og samtidig præcise lokalisering af membran-associerede molekyler blev fundet med en høj signal til baggrund ratio.
Introduction
Vores dage, lysmikroskopi teknikker giver høj/super opløsning imaging i faste og levende model i rivende udvikling. Super-opløsning teknikker såsom stimuleret emission udtynding (STED), struktureret belysning mikroskopi (SIM) og foto-aktivering lokalisering mikroskopi (PALM) eller direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM), henholdsvis, er kommercielt tilgængelige og aktiverer billeddannelse af subcellulært strukturer viser detaljer næsten på det molekylære plan1,2,3,4,5,6. Men disse tilgange stadig har begrænset anvendelighed for live imaging eksperimenter, hvor store mængder skal visualiseres med flere billeder pr anden erhvervelse hastighed. Sorter af stærkt dynamiske processer reguleret via plasma membran, fx endo- / exocytose, vedhæftning, migration eller signalering, forekommer med høj hastighed inden for store cellulære mængder. For nylig, for at fylde dette hul, en integreret mikroskopi teknik var foreslåede kaldet spinning disk-JOHANNAS (SD-JOHANNAS)7. Detaljeret flyvetilladelser JOHANNAS mikroskopi specifikt isolere og lokalisere plasmamembran8,9, mens SD mikroskopi er en af de mest følsomme og hurtig live imaging teknikker til visualisering og sporing af subcellulært organeller i cytoplasma10,11. Kombinationen af begge Billeddannende teknikker i en enkelt installation er allerede blevet realiseret i den forløbne12,13, dog mikroskopet præsenteres her (figur 1) Endelig opfylder kriterierne for at udføre live imaging SD-JOHANNAS eksperimenter af de nævnte processer på 3 billeder pr anden hastighed. Da denne mikroskop er kommercielt tilgængelige, er målet med dette manuskript at beskrive i detaljer og give open source-værktøjer og protokoller for image erhvervelse, registrering og visualisering forbundet med SD-JOHANNAS mikroskopi.
Opsætningen er baseret på en inverteret mikroskop tilsluttet to scan enheder via uafhængige havne - den venstre port er knyttet til SD-enhed og tilbage porten til scannerenheden for JOHANNAS foto-aktivering /-og blegemidler og eksperimenter. Op til 6 lasere (405/445/488/515/561/640 nm) kan bruges til magnetisering. For excitation og afsløring af fluorescens signal, enten et 100 x / NA1.45 olie eller 60 x / NA1.49 olie JOHANNAS mål, henholdsvis, har været ansat. Det udsendte lys er delt af en dichroic spejl (561 nm long-pass eller 514 nm long-pass) og filtreret af forskellige sporgruppe-pass filtre (55 nm bred centreret på 525 nm, 54 nm bred centreret på 609 nm for grøn og rød fluorescens, henholdsvis) placeret foran de to EM-CCD cam epoker. Bemærk venligst at mere tekniske detaljer om opsætningen er opført i Zobiak et al. 7. i JOHANNAS konfiguration, SD-enhed er flyttet ud af den lette vej inden for circa 0,5 s så at de samme to kameraer kan bruges til påvisning, giver mulighed for hurtigere at skifte mellem de to billeddiagnostiske modaliteter sammenlignet med ca 1 s, der blev rapporteret i seneste13 < /C2 >. Denne funktion gør det muligt dual channel samtidige erhvervelse, således 4 kanaler SD-JOHANNAS imaging på tidligere uovertruffen hastighed og nøjagtighed kan udføres. Derudover er tilpasning mellem SD og JOHANNAS billeder unødvendig. Justering af billede mellem de to kameraer, har imidlertid skal kontrolleres før du starter eksperimentet og korrigeres om nødvendigt. I den følgende protokol, blev en registrering korrektion rutine gennemført i en selvstændig skriftlig ImageJ makro. Derudover var makroen primært designet til at tillade en samtidige visualisering af SD- og JOHANNAS datasæt trods deres forskellige dimensionalitet. Selve softwaren erhvervelse ikke give disse funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af celler
- To dage før eksperimentet, seed 3 * 105 HeLa eller NIH3T3 celler i 2 mL af fuld vækstmediet pr. brønd af et 6-godt cellekultur plade. Sikre, at celler håndteres i en laminar flow hætte i hele denne protokol.
- En dag før eksperimentet, forberede Transfektion reagenser efter fabrikantens anvisninger eller en empirisk bestemt protokol, f.eks.:
- Fortyndes 1 µg af RFP-Lifeact og 1 µg for YFP-Vinculin i alt 200 µL nedsat serum medium. Vortex Transfektion reagens kort, tilføje 4 µL til 200 µL DNA og vortex igen. Inkuber Transfektion mix for 15-20 min. ved stuetemperatur.
- Tilføje hele Transfektion mix dråbevis direkte til cellerne. Blandes ved omrystning pladen og læg det tilbage i inkubatoren.
- På dagen for eksperimentet, forberede prøven live imaging:
- Forberede en 10 µg/mL opløsning af fibronektin i PBS til pels glasoverfladen af en 35 mm glas bund fad. Brug kun høj kvalitet 0,17 mm glas coverslips til optimal JOHANNAS ydeevne og undgå plastik bund retter. Forlade løsningen på glasoverfladen, for 30 min ved stuetemperatur, derefter fjerne det og lad fadet lufttørre.
- Fortynde en 0,1 µm multi fluorescerende perler løsning til en tæthed på 1,8 x 109 partikler per mL destilleret vand og tilføje løsning for 30-60 s fibronektin-belagt glas overflade. Fjerne straks løsningen og lad fadet lufttørre.
Bemærk: Dette trin er kun nødvendigt hvis JOHANNAS flyet skulle findes før såning celler og/eller at erhverve en 2-farve referenceafbildning til perle-baserede billede registrering. - Fremstilles en 0,1 M opløsning af ascorbinsyre (AA) og fortyndes til en endelig koncentration på 0,1 mM i vækstmediet (AA-medium). Sted løsning i et 37 ° C vandbad.
Bemærk: Brug fluorescens-optimeret cellekulturmedium hvis det er muligt, sådan som phenolred-fri og (ribo-) flavin-reduceret medium. AA er en anti-oxiderende agent, der kan reducere fototoksiske effekter under live imaging14. Vi har testet det med succes i denne analyse, dvs. flere celler syntes sund under betingelser end uden AA tilsætning. Dog blev pH af mediet sænket af 0,17 pH-enheder. - Cellerne vaskes med 2 mL PBS, tilsæt 250 µL Trypsin-EDTA og vente, indtil cellerne er helt løsrevet (2-3 min i et 37 ° C inkubator). Resuspend celler omhyggeligt i 1 mL pre varmede AA-medium med en pipette og tilføje det til 4 mL AA-medium i en 15 mL celle kultur tube. Placer cellesuspension med en lidt åbnede låget i en inkubator, indstillet til 37 ° C og 5% CO2 i nærheden af mikroskopet.
- Tilsæt 1 mL pre varmede AA-medium til bunden glasskål og placere det i indehaveren af forvarmet mikroskop (se næste afsnit).
2. live imaging
- Start miljøkontrol af mikroskop til at opnå en stabil 37 ° C, 5% CO2 og fugtigt atmosfære.
Bemærk: Her, en lille scene top inkubation kammer har været brugt at tilladte stabil indstillinger inden for ca. 15 min. større væksthuse vil har brug for mere tid til at opnå stabile forhold. - Fix alle erhvervelse indstillinger på mikroskopet, før cellesuspension anvendes:
- Angiv tidsintervallet til 30 s og varighed til 60-90 min. aktivere autofokus funktionen af den hardware-baseret auto-fokus for hvert tidspunkt (værdien "1").
- Justere kamera eksponering samt gevinst og laser power for hver kanal. Gevinst høj niveauer, lav eksponeringstid og lav laser power er anbefalelsesværdigt at reducere foto-toksicitet.
Bemærk: Dataene præsenteres her blev erhvervet med 200 ms eksponering, få niveau 500 og 20% laser power, der er lig med excitation intensiteter 0,5 W/cm² for 488 nm og 1 W/cm² for 561 nm, henholdsvis. - Indstille z-stakken for spinning-disk kanaler til 10 µm med 0,4 µm afstand. De-aktivere z-stakke for JOHANNAS kanaler. Sæt bunden-forskydning til "0", dvs det laveste flyet bliver fokus position af hardware auto-fokus.
- Aktivere funktionen multi-punkt "fase holdninger".
Bemærk: Op til 3 positioner kan registreres i en 30 s tidsinterval.
- Finde de fluorescerende perler med epi-fluorescerende belysning på okulære eller på computerskærmen, og derefter aktivere én JOHANNAS kanal og indstille indfaldsvinklen til en værdi, der angiver JOHANNAS belysning. Aktivér auto-fokus ved at trykke på knappen på panelet mikroskop og justere fokus med offset hjulet. Erhverve en 2-farve datasæt, dvs JOHANNAS-488 og JOHANNAS-561, for efterfølgende perle-baserede image registrering (se punkt 3.1).
- Valgfrit: For at sikre JOHANNAS belysning, tilføje et par microliters af frit flydende fluorescerende flerfarvet perler suspension (se punkt 1.3.2.). Aktivere den levende opfattelse af en JOHANNAS kanal og øge indfaldsvinklen. Ikke-tilhænger perler vil forsvinde ud over den kritiske vinkel, at sikre en korrekt JOHANNAS belysning8.
- Bland cellesuspension igen af invertere det lukkede rør 2 - 3 gange, og anvende 1 mL af celler til billedbehandling fadet.
- Hurtigt finde dobbelt-transfekteret celler med lavt niveau epi-fluorescerende belysning. Center celler i live kamera preview ved lysfelt belysning og Markér positionen. Find en anden 1-2 punkter af interesse og gemme dem til listen over stillinger.
Bemærk: I begyndelsen, cellerne nemt kan frigøre fase færdsel, dermed sæt 4-5 positioner og re-check alle før du starter billede erhvervelse. Bagefter, kassere 1-2 positioner. - Start dataopsamling ved at klikke på knappen "Sekvens".
3. billedet efterbehandling i ImageJ
- For at generere en registrering-free hyperstack i FIJI15, har været skrevet en makro med navnet "SD-TIRF_helper", der kan anvendes til 2-4 kanal SD-JOHANNAS timelapse datasæt. Gem filen "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" i FIJIS sub-omslag "makroer" og køre makroen ved at klikke på kommandoen "Plugins > makroer > Kør...".
- Hvis farvekanalerne behøver registrering korrektion, Vælg indstillingen og oprette en ny perle-baseret registrering reference (landmark fil) eller bruge en eksisterende fil, der blev oprettet før.
Bemærk: Turboreg plugin16 vil blive anvendt til fluorescens perler reference billeder. Installere plugin i FIJI software overensstemmelse med generelle retningslinjer for plugin installationer. - Importere data med bio-formater importør og vælge hyperstack som en mulighed for gennemsyn. Indlæse billedet datasæt, skal du vælge SD-serien i det første skridt, og JOHANNAS-serie i det andet trin. FIJI vil vise data sorteret efter kanal og fase position, dvs normalt alle SD-kanaler og alle JOHANNAS-kanaler dukke op som et hyperstack for hver etape position, der er valgt.
Bemærk: Import af Data er muligt fra forskellige filtyper, for eksempel TIFF-serien eller platform-afhængige fil typer såsom * nd. Filtypen skal anerkendes kun, hvis det ikke blev eksporteret af erhvervelse software som uafhængige, komprimering-mindre TIFF-format. - Anvende registrering korrektion til de respektive kanaler ved at indlæse filen forudbestemte vartegn.
- Vælg den ønskede farve look-up table (LUT) for hver kanal, SD- og JOHANNAS og flette dem ind i en enkelt, multi-dimensionelle hyperstack.
Bemærk: Under behandlingen af JOHANNAS kanaler føjes en række af z-fly med nul intensitetsværdierne oven på bunden flyet, der stemmer overens med antallet af z-fly i SD datasæt. Dette trin er vigtigt for visualisering af den endelige hyperstack. Denne metode er korrekte, da dybden af JOHANNAS belysning (mindre end 200nm7) er mindre end z-trin af SD stack (400 nm).
- Hvis farvekanalerne behøver registrering korrektion, Vælg indstillingen og oprette en ny perle-baseret registrering reference (landmark fil) eller bruge en eksisterende fil, der blev oprettet før.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vise potentialet i SD-JOHANNAS imaging, en assay blev udviklet der skal afsløre den spatio-temporale organisation af celle-matrix vedhæftning komplekser og deres interaktion med cytoskelettet under cellulære vedhæftning. Derfor tilhænger HeLa eller, alternativt, NIH3T3 celler blev transfekteret med YFP-Vinculin og RFP-Lifeact for 18-24 h, trypsinized og seedet på fibronektin-belagt glas bund retter. Disse cellelinjer blev valgt for deres udtalt cytoskelettet og højere robusthed i live imaging eksperimenter imod, for eksempel, primærelementer. De kunne ikke modstå imaging i meget følsomme betingelse, som de er efter trypsin behandling. På mikroskopet, YFP/RFP-udtrykker celler blev udvalgt og vedhæftning proces observeret under en 60min time-lapse (figur 2 og film 1 og 2). Denne specifikke assay er sjældent og ikke klart blevet beskrevet i litteraturen17,18. Derudover er vedhæftning dannelse for det meste blevet undersøgt i fx migrere celler19,20. Således, vi havde brug at tilpasse denne metode (cellelinie, belægning, medium, sammensætning) for at udføre eksperimenter beskrevet i denne hvidbog.
Som forventet, celler var runde-formet i begyndelsen og kun svagt tilhænger, mens membran fremspring sensing miljøet og gøre kontakt med underlaget. Celle-matrix kontakter styrkes hurtigt efter dannelsen af såkaldte spirende sammenvoksninger20,21 (figur 2A, JOHANNAS-488 kanal, tid point 0-4,5 min.). Sidstnævnte er spot-lignende, Vinculin-positive strukturer på den ventrale side af cellen. Strukturerne, der var klart synlige i JOHANNAS billeder. I begyndelsen af adhæsion dannelse, actin var jævnt fordelt i cellen og lokalisere ikke til disse tidlige komplekser (figur 2A, SD-561 kanal). I løbet af tid, vedhæftning komplekser udvidet og modnet til fokale sammenvoksninger (figur 2 c). Disse aflange strukturer var overvejende tilsyneladende i periferien af cellen (tal 2A + B) og resulterede fra styrker, der blev udøvet af acto-myosin fibre. Disse fibre begyndte at oprette forbindelse til vedhæftning komplekser, dermed trække dem mod celle centrum og overtalelse, styrkelse af celle-matrix sammenvoksninger samt bundling af actin fibre21. Tilsyneladende, cellen også fladtrykt som følge af actin netværk dannelse (figur 2A, XZ view). SD-imaging lydisolerede for at være metoden valg her, som det er tilladt visualisere denne proces med høj følsomhed, rumlige opløsning og fra en komplet perspektiv. I en tidligere betænkning17, kunne JOHANNAS alene kun lade spekulere om oprindelsen af perifere sammenvoksninger, der henviser til, at SD-JOHANNAS imaging klart afsløret sin forening med filopodia (figur 2B, tidspunkt 17 min, hvid pilespids). Faktisk blev actin fibre opstå centripetally fra focal sammenvoksninger synlig efter 27 min (figur 2B, gul pilespids).
Indstillingerne erhvervelse af disse eksperimenter, dvs erhvervelse hastighed, excitation intensitet og detektor gevinst, skal dog vurderes omhyggeligt. Interval på 30 s/tidspunkt, aktivering multi point erhvervelse, synes at være ideel, mens stråling intensiteten af excitation laser (mellem 0,5-1 W/cm²) skal tages under kritisk behandling. Figur 2D viser en celle på en anden placering i det samme eksperiment, der mislykkedes at vedhæfte til underlaget. Det kan være muligt at fototoksiske effekter påvirket af cellen her, biologi, som til sidst resulterede i membranen boblende efter circa 60 min, sandsynligvis ligner apoptose (Movie 2). Dette igen tydeligt hvor følsomme celler kan reagere på fototoksicitet, og at det er vigtigt at finde en god balance mellem mængden af lys sat i og de oplysninger, der bliver taget. At reducere laser power, kan antallet af billeder i en z-stakken eller øge gevinsten være den rigtige strategi for nedbringelse af fototoksicitet. Alle disse indstillinger, men bør justeres på et niveau, der stadig giver mulighed for at opnå tilstrækkelig opløsning og signal til støjforhold, gør det muligt for at udtrække kvantitative oplysninger fra registreres tid bortfalder.
Figur 1: skematisk tegning af SD-JOHANNAS setup. A. SD tænkelig tilstand: de 6 forskellige laser linjer (405/445/488/515/561/640nm, grønne linjer) er koblet ind i Konfokal scanning enhed (CSU), passerer gennem SD (position "IN") og en tom filter kube i mikroskop krop (MIC). Fluorescens emission fra prøvemateriale (SPEC) er projiceret gennem pinholes SD og split af forskellige dichroic spejle, fx for grøn/rød eller gul/cyan samtidige erhvervelse, på to forskellige EM-CCD kameraer (C1 og C2). Fluorescens filtre er placeret foran kameraerne (ikke vist). B. JOHANNAS tænkelig tilstand: laser linjer er koblet ind i JOHANNAS scanner (JOHANNAS). En multi-line stråledeler i MIC dirigerer stråle til modellen og udledning lyse omgår SD ("OUT") for maksimeret transmission. Fluorescens er opdaget af de samme kameraer og emission filtre beskrevet i A. Dette tal er blevet ændret fra Zobiak mfl. 7 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative resultater af celle spredning og vedhæftning dannelse ved hjælp af SD-JOHANNAS mikroskopi. A. dobbelt-transfekteret HeLa celler udtrykker RFP-Lifeact (rød, SD-561 kanal) og YFP-Vinculin (grøn, JOHANNAS-488 kanal) var trypsinized og re seedede på fibronektin-belagt glas coverslips. Vedhæftning dannelse bliver synlig, startende med små spirende sammenvoksninger (Vinculin-positive steder) fra 0 minutter, at udvikle sig til større focal sammenvoksninger efter ca 5 minutter. Kortikale actin er tilsyneladende efter ca. 10 minutter og strækker sig i periferien af cellerne (Se rammer på 12 og 24,5 minutter). B. den forstørret visning af boxed regionen i en (ramme på 45 minutter) skildrer celle spredning og overgangen fra spirende til fokale sammenvoksninger samt filopodia-associerede sammenvoksninger (hvid pilespids) og stress fiber dannelse (Se rammen på 27 minutter, gul pilespids). C. Kymograph af den stiplede gul streg i A. D. (Foto-) Toksiske virkninger på celler eller ellers usunde celler kan lade dem undlader at vedhæfte til underlaget. Imaging betingelser skal evalueres kritisk for at udelukke fototoksicitet. Skalalinjen = 5 µm (i A og D) og 2 µm (i B og C). Visningerne XZ i A og D er de retvinklede projektioner udvundet fra de stiplede hvide linjer trukket deri (bunden = substrat). Billederne var lineært kontrast-forbedret og median-filtreret med en 3 x 3 kerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: 3D-genopbygning af timelapse sekvens i Fig. 2A. Billede sekvensen var gengivet med 3D imaging software. Varighed: 42,5 min. erhvervelse sats: 2 dual-channel SD-JOHANNAS stakke pr. minut (56 billeder i alt) blev erhvervet. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Movie 2: filmen af timelapse sekvens i Fig. 2 C. Varighed: 60 min. erhvervelse sats: 2 dual-channel SD-JOHANNAS stakke pr. minut (56 billeder i alt) blev erhvervet. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papir blev præsenteret den første vellykkede gennemførelse af SD og JOHANNAS mikroskopi i en konfiguration, der er egnet til at udføre levende celle imaging eksperimenter, dvs høje anskaffelses priser såsom 2 SD-JOHANNAS billedstakke pr. minut på 3 forskellige Stadium positioner, svarende til i alt 168 frames (circa 3 billeder pr. sekund), blev anskaffet. Få SD-JOHANNAS mikroskoper, der blev beskrevet tidligere12,13, primært mangel på tilstrækkeligt højt imaging hastighed at følge cellulære processer i 3D, hvor en tidsmæssig opløsning på mindre end 2 s pr billedstak er ofte nødvendig. Præsenteres opsætningen kan opnå imaging rum op til 0,78 billedstakke pr. sekund, og satser på 3,5 s pr store billedstak i live eksperimenter behandlende 3D vesikel dynamics har været demonstreret7. Derudover havde tidligere SD-JOHANNAS mikroskoper kun én detektor per imaging tilstand, reducere yderligere hastighed for multi-kanal erhvervelser. Teknisk set, i disse systemer en split-konfigurationen kunne gennemføres der også tillader simultan dual-farve erhvervelse med et enkelt kamera. Dette ville dog tillade billeddannelse af kun halvdelen af synsfeltet. Andre metoder til at producere flerdimensionale datasæt med høj spatio-temporal opløsning som widefield imaging kombineret med deconvolution eller 3D super-resolution mikroskopi, dvs 3D SIM eller gitter lys ark mikroskopi22, 23, kan være gyldige alternativer. Dog deconvolution-baseret tænkelig nemt kan indføre billede artefakter i lavt signal-støj-forholdet erhvervelser (som det ofte er tilfældet under live, imaging programmer), og super-opløsning 3D live imaging er stadig en teknisk uddybende og udfordrende opgave. I præsenteret realiseringen af en avanceret SD-JOHANNAS setup7, blev fordel taget af en SD-enhed, der tillader flytning dual-disk og uden registrering sti. Denne konfiguration giver to store fordele: for det første de samme to kameraer kan bruges til at registrere SD og JOHANNAS signal, hvilket resulterer i en høj præcision overlapning mellem disse to kanaler. Det andet pinholes af spinning disk ikke blokerer nogen emissions lys når opererer i JOHANNAS erhvervelse mode (for flere detaljer, se figur 1B), hvilket øger udskillelsesgrad vigtigt for høj-følsomme live imaging. Derfor er denne optiske konfiguration gunstig for gennemførelsen af enhver form for JOHANNAS mikroskopi (f.eks. variabel eller fast vinkel belysning) til eksisterende SD-mikroskoper, der giver mulighed for omgåelse SD-enhed. Desuden brugte JOHANNAS scanneren kan køres i såkaldte time sharing mode, hvor to JOHANNAS kanaler kan registreres samtidigt (som vist i Zobiak mfl. 7), hastighedsoverskridelser længere op erhvervelse af multi-kanal data.
En af de største fordele ved beskæftiger JOHANNAS er, at med denne metode, er det muligt at lokalisere med højeste præcision signalet kommer fra cellemembranen i løbet af et liv celle imaging eksperiment. Ja, mens en metode som SIM giver en bedre z-skæring og dermed bedre isolering af cellemembranen i faste prøver, i levende celle imaging eksperimenter i eksponentiel stigende/faldende af fluorescens signalet fra organeller nærmer sig / forlader grænsefladen JOHANNAS tilladt mere specifikke og præcise lokalisering af cellemembranen. Lokalisering præcision, selv om de ikke stadig kvantificeret, lover at være mange folder mindre end 150-200 nm, dvs den rumlige vifte af feltet evanescence.
I øjeblikket er en begrænsning af metoden den nødvendige tid til fjerne spinning disk enhed fra den lette vej og begynde at JOHANNAS erhvervelse, dvs. 0,5 s. Denne forsinkelse begrænser det mindste tidsinterval mellem to på hinanden følgende erhvervelser. Teknisk, bør det være muligt at reducere denne forsinkelse gennem omgåelse disk med fx galvo-spejle og dermed reducere den samlede erhvervelse pr. SD-JOHANNAS cyklus. Også kan nyere generation kameraer tillade reduceret eksponering gange på højt signal / støj-forhold. Dermed, de samlede resultater af denne opsætning kan forbedres stadig relevant ved opgradering af hardware-komponenter. Fra den billeddiagnostiske synspunkt, men der er flere andre måder at minimere erhvervelse tid (i prioriteret rækkefølge): undgå flere positioner, reducere z-stakhøjde, øge z-afstand, minimere eksponeringstiden (øge gain og eventuelt bruge Binning), forkorte afstanden mellem erhvervelse positioner, aktivere auto-fokus kun hvert n'te gang punkt (n > 1). På trods af faktiske begrænsninger, hvis alle disse parametre evalueres omhyggeligt, er det muligt at bruge SD-JOHANNAS imaging til sporing og lokalisering, hurtigt flytte cellulære blærer, som præsenteres i Zobiak et al. 7.
Desuden, i dette papir en protokol, der beskriver erhvervelse rutine på en single-channel SD-JOHANNAS datasæt blev præsenteret. Hjælp af den angivne makro, kan rå data eksporteres i en enkelt TIFF-fil, der indeholder alle SD- og JOHANNAS kanaler. Billede registrering er i sig selv ikke nødvendigt; Det er imidlertid vigtigt, at begge kameraer er præcist afstemt med hensyn til hinanden. Resterende pixel forskydninger (oversættelse og rotation) kan opdages og korrigeres inden for den angivne makro. Korrektion algoritme gør brug af en multikanal reference billede af fluorescerende perler, der skal optages lige før du starter eksperimentet. I den resulterende fil, er JOHANNAS planet placeret på laveste niveau efterfulgt af et nummer af nul intensitet fly, der matchende dimensionalitet af SD-kanal. Derfor, det er vigtigt at erhverve dataene, som skitseret i protokollen, hvor det afbildede JOHANNAS flyet ligner den nedre ende af z-stakken til SD-kanal.
Endelig systemet kunne potentielt en SIM-modul eller forlænge den for nylig indførte multi-vinkel TIRFM24,25 til yderligere stigning den rumlige opløsning. Dog kan stigende af rumlige opløsning opnås, ifølge den nuværende stade, kun på bekostning af en langsommere imaging hastighed. For alle levende celle, imaging eksperimenter, hvor det er afgørende at lokalisere strukturer på plasmamembran omend opretholde høje rumlige opløsning af den resterende mængde, cellulære, er den her beskrevne SD-JOHANNAS setup en nem at integrere, let tilgængelige løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker meget det videnskabelige samfund af University Medical Center Hamburg-Eppendorf for at støtte os med prøver til evaluering. Nemlig, vi takker Sabine Windhorst for NIH3T3 celler, Andrea Mordhorst for YFP-Vinculin og Maren Rudolph for RFP-Lifeact.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
