Summary
Un microscope perfectionné permettant de rapides et de haute résolution d’imagerie de la membrane plasmique isolée et le volume intracellulaire environnant, est présenté. L’intégration de la filature de microscopie de fluorescence de réflexion interne disque et total dans un seul montage permet de vivre des expériences d’imagerie à des vitesses d’acquisition élevée jusqu'à 3,5 s par la pile de l’image.
Abstract
Dans les cellules vivantes, les processus tels que la formation d’adhérences impliquent des changements structurels importants dans la membrane plasmique et l’intérieur de la cellule. Afin de visualiser ces événements très dynamiques, on a combiné les deux techniques de microscopie optique complémentaire permettant l’imagerie rapide des échantillons vivants : filature de la microscopie (SD) de disque pour l’enregistrement de volume rapide et haute résolution et de la réflexion totale interne microscopie de fluorescence (FRBR) pour la localisation précise et visualisation de la membrane plasmique. Un protocole d’imagerie complète et s’affichera pour les guider dans la préparation de l’échantillon, l’étalonnage de microscope, formation d’images et acquisition, résultant en une série d’imagerie live avec haute résolution spatio-temporelle du SD-FRBR multicolore. Toutes les étapes de post-traitement image nécessaire pour générer multidimensionnelle datasets imagerie direct, c'est-à-dire l’enregistrement et la combinaison des canaux individuels, sont fournis dans une macro autonome écrite pour le logiciel open source ImageJ. L’imagerie des protéines fluorescentes au cours de l’initiation et la maturation des complexes de l’adhérence, ainsi que la formation du réseau d’actine du cytosquelette, a été utilisé comme une preuve de principe pour cette approche originale. La combinaison de la microscopie 3D de haute résolution et de la FRBR a fourni une description détaillée de ces processus complexes dans l’environnement cellulaire et, en même temps, une localisation précise des molécules associées aux membranes détecté avec une haute rapport de signal-à-fond.
Introduction
Nos jours, les techniques de microscopie optique fournissant l’imagerie haute/super résolution en fixe et spécimen vivant sont développent rapidement. Techniques de super-résolution telles que stimulent d’émission microscopie d’illumination épuisement (STED), structuré (SIM) et la microscopie de photoactivation localisation (PALM) ou microscopie directes de reconstruction stochastique optique (STORM), respectivement, sont disponible dans le commerce et permettent l’imagerie des structures subcellulaires, montrant des détails presque à l’échelle moléculaire1,2,3,4,5,6. Cependant, ces approches ont toujours limité applicabilité pour des expériences d’imagerie live dont grands volumes doivent être visualisés avec plusieurs frames par seconde vitesse d’acquisition. Variétés des processus hautement dynamiques régies par l’intermédiaire de la membrane plasmique, par exemple , endo- / exocytose, d’adhérence, de migration ou de signalisation, se déroulent à haute vitesse dans les grands volumes cellulaires. Récemment, afin de combler cette lacune, une technique de microscopie intégrée a été proposée filature appelé disque-FRBR (SD-FRBR)7. En détail, microscope TIRF permet spécifiquement isoler et localiser la membrane plasmique8,9, tandis que la microscopie SD est parmi les plus sensibles et rapide vivent des techniques d’imagerie pour la visualisation et le suivi des organites subcellulaires dans le cytoplasme10,11. La combinaison des deux techniques d’imagerie en une seule configuration ont déjà été réalisée dans les dernières12,13, cependant, le microscope présenté ici (Figure 1) enfin répond aux critères pour effectuer des expériences de SD-FRBR imageries live des processus susmentionnés à 3 images par seconde vitesse. Ce microscope étant disponible dans le commerce, l’objectif de ce manuscrit est de décrire dans le détail et offrir des outils open source et des protocoles d’acquisition d’images, enregistrement et visualisation associée à la microscopie SD-FRBR.
La configuration est basée sur un microscope inversé raccordé à balayage deux appareils via les ports indépendants - le port gauche est lié à l’unité de la SD et le port arrière pour unité scanner pour FRBR et photo-activation/blanchiment des expériences. Jusqu'à 6 lasers (405/445/488/515/561/640 nm) peut être utilisée pour l’excitation. Pour l’excitation et la détection du signal de fluorescence, soit un 100 x / NA1.45 huile ou x 60 / NA1.49 huile objectif FRBR, respectivement, ont été employées. La lumière émise est divisée par un miroir dichroïque (561 nm de long-pass ou 514 nm de long-pass) et filtrée par divers filtres passe-bande (55 nm de large centrée à 525 nm, 54 nm de large centrée à 609 nm pour la fluorescence verte et rouge, respectivement) placés devant les deux cam EM-CCD enchères électroniques inversées. Veuillez noter que des détails plus techniques sur le programme d’installation sont répertoriés dans Zobiak et al. 7. dans la configuration de la FRBR, l’unité de la SD est déplacée hors du trajet optique dans environ 0,5 s afin que les deux caméras mêmes peuvent être utilisés pour la détection, ce qui permet une commutation plus rapide entre les deux modalités d’imagerie comparées à environ 1 s qui a été rapporté dans le passé13 < /C2 >. Cette fonction permet l’acquisition simultanée de deux canaux, donc 4 canaux SD-FRBR imagerie à précédemment vitesse inégalée et exactitude peut être effectuée. Par ailleurs, l’alignement entre les images SD et FRBR est inutile. Alignement de l’image entre les deux caméras, toutefois, doit être vérifié avant de commencer l’expérience et corrigé si nécessaire. Dans le protocole suivant, une routine de correction d’enregistrement a été mis en œuvre dans une macro autonome écrite d’ImageJ. En outre, la macro a été principalement conçue pour permettre une visualisation simultanée de SD - et datasets FRBR malgré leur dimensionnalité différente. Le logiciel d’acquisition elle-même n’a pas fourni ces fonctionnalités.
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Protocol
1. préparation des cellules
- Deux jours avant l’expérience, les semences 3 * 105 HeLa ou NIH3T3 cellules dans 2 mL de milieu de culture complet / puits d’une plaque de 6 puits culture cellulaire. Veiller à ce que les cellules sont traitées dans une hotte à flux laminaire tout au long de ce protocole.
- Un jour avant l’expérience, préparer les réactifs de transfection selon les recommandations du fabricant ou un protocole déterminé empiriquement, par exemple:
- Diluer 1 µg de DP-Lifeact et 1 µg de YFP-Vinculine dans un total de 200 µL de milieu de sérum réduit. Vortex le réactif de transfection brièvement, ajouter 4 µL à 200 µL ADN et vortex à nouveau. Incuber le mélange de transfection pendant 15-20 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange de transfection toute goutte directement aux cellules. Mélanger en secouant la plaque et le placer dans l’incubateur.
- Le jour de l’expérience, préparation des échantillons pour l’imagerie webcam live :
- Préparer une solution de 10 µg/mL de la fibronectine dans du PBS pour enduire la surface d’un plat de fond de verre de 35 mm. Utiliser seulement haute qualité 0,17 mm verre couvre-objet pour des performances optimales de la FRBR et éviter les plats en plastique fond. Laissez la solution sur la surface du verre pour 30 min à température ambiante, puis retirez-le et laissez la vaisselle sécher à l’air.
- Diluer une solution multi-fluorescent perles de 0,1 µm à une densité de 1,8 x 109 particules / mL dans l’eau distillée et ajouter la solution pendant 30-60 s à la surface de verre enduit de la fibronectine. Retirez immédiatement la solution et laissez la vaisselle sécher à l’air.
Remarque : Cette étape est nécessaire uniquement si le plan de la FRBR devrait être trouvé avant l’ensemencement de cellules ou d’acquérir une image de référence de 2 couleurs pour l’enregistrement d’images axées sur le talon. - Préparer une solution d’acide ascorbique (AA) 0,1 M et le diluer à une concentration finale de 0,1 mM en milieu de culture (AA-moyen). Placer la solution dans un bain-marie à 37 ° C.
Remarque : Utilisez optimisé fluorescence milieu de culture cellulaire si possible, tel que phenolred-free et support réduit flavin (ribo-). AA est un agent anti-oxydants qui peut réduire les effets phototoxiques lors d’imagerie live14. Nous avons testé avec succès il dans ce test, c'est-à-dire plus de cellules est apparus en bonne santé dans les conditions appliquées que sans ajout de AA. Cependant, le pH du milieu a été abaissé de 0,17 unités de pH. - Laver les cellules avec 2 mL de PBS, ajouter 250 µL trypsine-EDTA et attendre jusqu'à ce que les cellules soient totalement détaché (2-3 min dans un incubateur à 37 ° C). Remettre en suspension les cellules soigneusement dans 1 mL préchauffée AA-moyen avec une pipette et ajoutez-le à 4 mL AA-médium dans un tube 15 mL de culture cellulaire. Placez la suspension cellulaire muni d’un couvercle légèrement ouvert dans un incubateur mis à 37 ° C et 5 % de CO2 dans les environs du microscope.
- Ajouter 1 mL préchauffée AA-support à plat le fond en verre et placez-le dans le support du microscope préchauffé (voir paragraphe suivant).
2. live imagerie
- Démarrer le contrôle de l’environnement du microscope pour obtenir une stable de 37 ° C, 5 % de CO2 et une atmosphère humide.
NOTE : Ici, une chambre d’incubation supérieure petite scène a été utilisée qu’autorisées paramètres stables au sein des pépinières d’entreprises plus grandes environ 15 min. faudra plus de temps pour atteindre des conditions stables. - Fixer tous les réglages d’acquisition au microscope avant l’application de la suspension cellulaire :
- Définissez l’intervalle de temps de 30 s et la durée de 60 à 90 min. activent la fonction autofocus de l’auto-focus basée sur le matériel pour chaque point du temps (valeur « 1 »).
- Ajuster l’exposition de l’appareil et gain, ainsi que la puissance du laser pour chaque canal. Gain élevé niveaux, temps d’exposition faible et laser de faible puissance sont recommandables pour réduire la toxicité de la photo.
NOTE : Les données présentées ici a été acquis avec une exposition de 200 ms, gain de puissance de laser niveau 500 et 20 % qui correspond à des intensités d’excitation de 0,5 W/cm² pour 488 nm et 1 W/cm² pour 561 nm, respectivement. - La valeur du z-pile pour les canaux de la filature-disque 10 µm avec 0,4 µm espacement. Désactiver la fonction z-piles pour les canaux de la FRBR. Définissez le décalage inférieur à « 0 », c'est-à-dire le plan le plus bas sera la position de mise au point du matériel auto-focus.
- Activer la fonction multipoint « postes de scène ».
NOTE : Jusqu'à 3 positions peuvent être enregistrées dans un intervalle de 30 s.
- Trouver les perles fluorescentes avec éclairage fluorescent epi à l’oculaire, ou sur l’écran de l’ordinateur, puis activer un canal de la FRBR et régler l’angle d’éclairage à une valeur qui identifie l’illumination de la FRBR. Activer l’auto-focus en appuyant sur le bouton sur le panneau de microscope et ajuster le focus avec la jante a DEPORT. Acquérir un dataset 2 couleurs, c'est-à-dire FRBR-488 et FRBR-561, pour enregistrement subséquent image axée sur le talon (voir point 3.1).
- Facultatif : Pour assurer l’illumination de la FRBR, ajoutez quelques microlitres de suspension perles multicolore fluorescent flottant librement (voir point 1.3.2.). Activer l’affichage en direct d’un canal de la FRBR et augmenter l’angle d’éclairage. Les perles non adhérents vont disparaître au-delà de l’angle critique, assurant une bonne FRBR éclairage8.
- Mélanger la suspension cellulaire encore une fois en inversant le tube fermé 2 - 3 fois et appliquer 1 mL des cellules sur le plat d’imagerie.
- Trouver rapidement les cellules transfectées double avec faible niveau d’illumination épi-fluorescence. Centrez les cellules dans l’aperçu direct de la caméra en utilisant l’illumination du champ lumineux et marquer la position. Trouver un autre 1-2 points d’intérêt et les enregistrer dans la liste de positions.
NOTE : Au début, les cellules facilement peuvent se détacher en raison du mouvement de la scène, donc mettre 4-5 postes et revérifiez tout avant de commencer une acquisition d’images. Ensuite, jeter les positions 1-2. - Commencer d’acquisition de données en cliquant sur le bouton « Sequence ».
3. image post-traitement dans ImageJ
- Pour générer un hyperstack sans inscription dans Fidji15, une macro nommée « SD-TIRF_helper » a été écrit qui peut être appliqué à 2-4 canaux SD-FRBR timelapse datasets. Enregistrez le fichier « SD-TIRF_helper_JoVE.ijm » dans le Fidji est un sous-dossier « macros » et exécutez la macro en cliquant sur la commande de menu « Plugins > Macros > exécuter... ».
- Si les canaux de couleur besoin de correction de l’enregistrement, sélectionnez l’option et créer une nouvelle référence de perle d’enregistrement (fichier de point de repère) ou utiliser un fichier existant qui a été créé avant.
Remarque : Le plugin de turboreg16 s’appliquera à fluorescence perles images de référence. Installer le plugin dans le logiciel de Fidji conformément aux lignes directrices générales pour les installations de plugin. - Importer les données avec l’importateur bio-formats et choisir hyperstack comme une option d’affichage. Charger le dataset de l’image, sélectionnez la série SD dans la première étape et la série FRBR dans la deuxième étape. Fidji affichera les données triées par la position de canal et de la scène, c'est-à-dire normalement tous les canaux SD et tous les FRBR-canaux apparaissent comme un hyperstack pour chaque poste de stade qui a été sélectionné.
NOTE : Importation des données est possible à partir de divers types de fichiers, par exemple types tels que TIFF-série ou fichier dépendant de la plateforme * e. Le type de fichier ne peut être reconnu que si elle n’était pas exporté par le logiciel d’acquisition comme indépendant, sans compression format TIFF. - Appliquer la correction de l’enregistrement pour les canaux en chargeant le fichier de points de repère préétabli.
- Sélectionnez la table de correspondance de la couleur désirée (LUT) pour chaque canal SD - et FRBR et fusionnez-les dans un hyperstack simple, multi-dimensionnel.
Remarque : Pendant le traitement des canaux FRBR, un certain nombre d’avions-z avec des valeurs nulles intensité est ajouté sur le dessus de l’avion de fond qui correspond au nombre de z-avions dans le dataset de la SD. Cette étape est importante pour la visualisation de la hyperstack final. Cette méthodologie est correcte, depuis la profondeur de l’illumination de la FRBR (moins de 200 milles marins7) est plus petite que la taille du z-pas de la pile de la SD (400 nm).
- Si les canaux de couleur besoin de correction de l’enregistrement, sélectionnez l’option et créer une nouvelle référence de perle d’enregistrement (fichier de point de repère) ou utiliser un fichier existant qui a été créé avant.
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Representative Results
Afin de montrer le potentiel de l’imagerie de SD-FRBR, qu'un essai a été développé qui devrait révéler l’organisation spatio-temporelle des complexes d’adhérence cellule-matrice et leur interaction avec le cytosquelette au cours de l’adhésion cellulaire. Par conséquent, adhérent HeLa ou, alternativement, NIH3T3 cellules ont été transfectées avec YFP-Vinculine et DP-Lifeact pendant 18 à 24 heures, trypsinisées et boutonnée sur plats bas de verre enduit de la fibronectine. Ces lignées cellulaires ont été choisies pour leur cytosquelette prononcé et robustesse supérieur dans des expériences d’imagerie live opposés à, par exemple, les cellules primaires. Ceux qui ne pourraient pas résister à imagerie dans un état très sensible, comme ils sont après traitement par la trypsine. Au microscope, les cellules exprimant YFP/DP ont été sélectionnés et le processus d’adhésion observés pendant une durée de 60min time-lapse (Figure 2 et les films 1 et 2). Ce dosage spécifique a rarement et pas clairement été décrits dans la littérature17,18. En outre, formation d’adhérences a principalement étudiée dans par exemple la migration de cellules19,20. Ainsi, nous avions besoin d’adapter cette méthodologie (lignée cellulaire, enduit, medium, composition) afin de réaliser les expériences décrites dans cet article.
Comme prévu, les cellules étaient ronds au début et seulement faiblement adhérentes, alors que saillies de la membrane sont la télédétection de l’environnement et faire contact avec le substrat. Rapidement, les contacts de la cellule-matrice renforcés lors de la formation d’adhérences naissant soi-disant20,21 (Figure 2 a, canal de la FRBR-488, temps points 0 à 4,5 min). Ces derniers sont des structures spot-like, Vinculine séropositifs à la face ventrale de la cellule. Les structures étaient clairement visibles dans les images de la FRBR. Au début de la formation d’adhérences, actine était uniformément répartie dans la cellule et ne pas localiser à ces premiers complexes (Figure 2 a, canal SD-561). Au cours du temps, complexes d’adhérence élargissement et est arrivée à échéance à des adhérences focales (Figure 2). Ces structures allongées sont surtout apparents à la périphérie de la cellule (Figures 2 a + B) et a entraîné des forces qui ont été exercées par des fibres d’acto-myosine. Ces fibres ont commencé à se connecter à des complexes de l’adhérence, ainsi en les tirant vers le centre de la cellule et induisant le renforcement des adhérences cellule-matrice ainsi qu’au groupement d’actine fibres21. Apparemment, la cellule a également aplati à la suite de formation de réseau d’actine (Figure 2 a, vue XZ). SD-imagerie insonorisées pour être la méthode de choix ici, car elle a permis de visualiser ce processus avec la sensibilité élevée, une résolution spatiale et dans une perspective complète. Dans un précédent rapport17, FRBR seule pouvait laisser seulement spéculer sur l’origine des adhérences périphériques, alors que l’imagerie SD-FRBR a clairement révélé sa liaison avec filopodes (Figure 2 b, point 17 min, pointe de flèche blanche dans le temps). En effet, les fibres d’actine qui sortent de façon centripète d’adhérences focales sont devenus visibles après 27 min (Figure 2 b, pointe de flèche jaune).
Toutefois, les paramètres de l’acquisition de ces expériences, la vitesse d’acquisition c'est-à-dire , le gain détecteur et de l’intensité de l’excitation, doivent être soigneusement évalués. L’intervalle de 30 s/validant, porteur multi point acquisition, semble être idéal, tandis que l’intensité de rayonnement du laser excitation (entre 0,5 à 1 W/cm²) doit être prise à l’examen critique. Figure 2D affiche une cellule à une autre position dans la même expérience qu’impossible d’attacher au substrat. Il pourrait être possible que des effets phototoxiques affecté la biologie de la cellule, qui a finalement abouti à membrane bouillonnant après environ 60 min, probablement ressemblant à l’apoptose (film 2). Cela clairement à nouveau les cellules sensibles peut réagir à la phototoxicité et qu’il est important de trouver en qu'un bon équilibre entre la quantité de lumière mis et de l’information étant sortis. Réduire la puissance du laser, le nombre d’images dans une z-pile ou en augmentant le gain pourrait être la bonne stratégie pour la réduction de phototoxicité. Tous ces paramètres, cependant, doivent être réglés sur un niveau qui permet toujours de réaliser suffisamment de résolution et le rapport signal sur bruit, ce qui permet d’extraire des informations quantitatives du laps de temps enregistré.
Figure 1 : schéma de l’installation de SD-FRBR. A. SD mode d’imagerie : les 6 différents laser (lignes 405/445/488/515/561/640nm, vert) sont couplés dans l’unité de balayage confocale (CSU), en passant par la carte SD (position « IN ») et un cube de filtre vide dans le corps du microscope (MIC). Émission de fluorescence de l’échantillon (SPEC) est projetée à travers les trous d’épingle de la SD et de split par différents miroirs dichroïques, par exemple pour l’acquisition simultanée vert/rouge ou jaune/cyan, sur deux caméras différentes d’EM-CCD (C1 et C2). Filtres de fluorescence sont placés devant les caméras (non illustrés). B. mode d’imagerie de la FRBR : les lignes laser sont couplés dans le scanneur FRBR (FRBR). Un séparateur de faisceau de plusieurs lignes dans le MIC dirige le faisceau sur l’échantillon et l’émission lumineuse contourne la SD (« OUT ») pour la transmission maximisée. Fluorescence est détecté par les caméras de mêmes et émission des filtres décrits dans A. Ce chiffre a été modifié par Zobiak et al. 7 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : résultats représentatifs de la formation d’épandage et d’adhérence de cellules SD-TIRF microscopie. A. les cellules HeLa transfectées Double exprimant DP-Lifeact (canal rouge, SD-561) et YFP-Vinculine (canal vert, FRBR-488) étaient couvre-objet en verre trypsine et re-dénoyautés sur fibronectine. Formation d’adhérences devient visible, en commençant par les petites adhérences naissantes (taches Vinculine positif) à 0 minute qui se développent en adhésions focales plus grandes après environ 5 minutes. Actine corticale est apparente après environ 10 minutes et s’étend à la périphérie des cellules (voir images 12 à 24,5 minutes). B. la vue agrandie de la région en boîte (un cadre à 45 minutes) dépeint propagation de cellules et de la transition d’adhérences naissants à focale ainsi que des filopodes associée à des adhérences (flèche blanche) et formation de fibres de stress (voir cadre à 27 minutes, pointe de flèche jaune). C. Kymographes de la ligne jaune pointillée tracée dans a. D. (Photo-) Des effets toxiques sur les cellules ou les cellules malsaines autrement peuvent qu’ils ne parviennent pas à fixer sur le substrat. Conditions d’imagerie doivent être d’une évaluation critique afin d’exclure la phototoxicité. Echelle = 5 µm (a et D) et 2 µm (en B et C). Les points de vue XZ en A et D sont les projections orthogonales extraites les lignes pointillées de blancs dessinés qui y est (bas = substrat). Images sont linéairement contraste accentué et médiane filtré avec un noyau de 3 x 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Movie 1 : reconstruction 3D de la séquence de timelapse dans Fig. 2 a. La séquence d’images a été rendue 3D logiciel d’imagerie. Durée : taux d’Acquisition min. 42,5 : 2 piles de SD-FRBR bicanal / minute (56 images au total) ont été acquises. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Movie 2 : film de la séquence de timelapse sur la Fig. 2, C. Durée : taux d’Acquisition 60 min. : 2 piles de SD-FRBR bicanal / minute (56 images au total) ont été acquises. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Dans le présent document a été présenté la première mise en œuvre réussie de la SD et TIRF microscopie dans une configuration adaptée pour réaliser des expériences d’imagerie de cellules vivantes, c'est-à-dire taux d’acquisition élevée tels que 2 cheminées d’image SD-FRBR / minute à 3 différents stade postes, correspondant à un total de 168 images (environ 3 images par seconde), ont été acquises. Les microscopes de SD-FRBR quelques qui ont été décrits précédemment12,13, principalement le manque de suffisamment haute vitesse d’imagerie à suivre des processus cellulaires en 3D dans lequel une résolution temporelle de moins de 2 s par la pile de l’image est souvent nécessaire. La configuration présentée peut atteindre des taux d’imagerie jusqu'à 0,78 piles d’image par seconde et 3,5 s par pile agrandir en direct expériences d’instruction vésicule 3D dynamique ont été démontré7. En outre, microscopes de SD-FRBR précédentes n'avaient qu’un seul détecteur par imagerie mode, réduire davantage la vitesse d’acquisition multicanaux. Techniquement, dans ces systèmes, qu'une configuration en mode fractionné pourrait être mises en œuvre, qui permet aussi acquisition simultanée de deux couleurs avec une seule caméra. Cela, cependant, permettrait à l’imagerie de seulement la moitié du champ de vision. Autres méthodes pour produire des ensembles de données multidimensionnelles à haute résolution spatio-temporelle, tels que l’imagerie widefield combinés avec la déconvolution ou microscopie 3D de super-résolution, c'est-à-dire 3D SIM ou treillis nappe de lumière microscopie22, 23, peut être des alternatives valables. Cependant, déconvolution basée sur l’imagerie peut introduire facilement des artefacts d’image dans les acquisitions de faible rapport signal-bruit (comme c’est souvent le cas lors de concert applications d’imagerie), et super-résolution 3D live imagerie est toujours un techniquement élaborative et tâche difficile. Dans la réalisation présentée d’une installation de SD-FRBR avancé7, a été mise à profit d’une unité de SD qui permet de déplacer la dans et hors du chemin d’accès détection à double disque. Cette configuration offre deux avantages majeurs : tout d’abord, les deux mêmes caméras peuvent être utilisés pour détecter le signal de la SD et la FRBR, qui se traduit par une haute précision de chevauchement de ces deux canaux. Deuxièmement, les trous du disque tournant ne pas bloquent toute lumière d’émission lors du fonctionnement en mode d’acquisition de la FRBR (pour plus de détails, voir la Figure 1 b), ce qui augmente l’efficacité de captage importante pour l’imagerie en haute sensibilité. Cette configuration optique est donc favorable pour mettre en œuvre tout type de microscope TIRF (p. ex. l’illumination angle variable ou fixe) en SD-microscopes existants qui permettent de contourner l’appareil SD. En outre, le scanner de la FRBR utilisé peut être exécuté en temps partagé ce qu’on appelle mode, où les deux canaux de la FRBR peut être enregistrés simultanément (comme indiqué dans Zobiak et al. 7), excès de vitesse plus haut l’acquisition de données multicanal.
Un des grands avantages d’employer la FRBR est que, avec cette méthode, il est possible de localiser avec la plus grande précision le signal provenant de la membrane cellulaire au cours d’une expérience d’imagerie de cellules de vie. En effet, alors que d’une méthodologie comme SIM fournit une meilleure z-sectionnement et donc meilleure isolation de la membrane cellulaire en fixe des échantillons, dans des expériences d’imagerie de cellules vivantes l’exponentielle augmentation ou diminution du signal de fluorescence des organelles approchant / quitter l’interface de la FRBR a permis la localisation plus précise et spécifique de la membrane cellulaire. La précision de localisation, bien que pas encore quantifié, promet d’être nombreux plis inférieures à 150-200 nm, c'est-à-dire la gamme spatiale du champ evanescence.
Actuellement, une limitation de la méthode est le temps nécessaire pour retirer le trajet de la lumière de l’unité de disque de filature et de commencer à l’acquisition de la FRBR, c'est-à-dire 0,5 s. Ce délai limite l’intervalle minimal entre deux acquisitions consécutives. Techniquement, il devrait être possible de réduire ce délai sans passer par le disque avec par exemple galvo-miroirs et diminuant ainsi l’acquisition globale par cycle de SD-FRBR. Aussi, nouvelles caméras de génération pourraient permettre des temps d’exposition réduit au rapport signal sur bruit élevé. Par conséquent, le rendement global de ce programme d’installation peut être encore pertinemment amélioré en mettant à niveau les composants matériels. Du point de vue d’imagerie, cependant, il y a plusieurs autres façons de réduire au minimum le temps d’acquisition (par ordre décroissant) : Évitez les positions multiples, réduire la hauteur z-pile, augmenter l’espacement-z, minimiser les temps d’exposition (augmentation de gain et éventuellement utiliser binning), réduisez la distance entre les positions de l’acquisition, activer l’autofocus seulement chaque point de la n-ème temps (n > 1). En dépit des limites réelles, si tous ces paramètres sont évalués avec soin, il est possible d’utiliser des SD-FRBR d’imagerie pour le suivi et la localisation de déplacement rapide des vésicules cellulaires, telle que présentée dans Zobiak et al. 7.
Par ailleurs, dans cet article un protocole décrivant l’acquisition routine d’un seul canal SD-FRBR dataset a été présenté. En utilisant la macro fournie, données brutes peuvent être exportées dans un fichier TIFF unique contenant toutes les chaînes SD - et de la FRBR. Enregistrement d’images est en soi pas nécessaire ; Cependant, il est important que les deux caméras sont précisément alignées à l’égard de l’autre. Restant des décalages de pixels (translation et rotation) peut être détectée et corrigée dans la macro fournie. L’algorithme de correction fait usage d’une image de référence multi-canal de perles fluorescentes qui doit être enregistré juste avant de commencer l’expérience. Dans le fichier qui en résulte, le plan de la FRBR est défini au niveau le plus bas, suivie d’un certain nombre de zéro avions d’intensité qui s’adaptent à la dimensionnalité du SD-canal. Par conséquent, il est important d’acquérir les données, comme indiqué dans le protocole, où le plan de la FRBR imagé ressemble à l’extrémité inférieure de la z-pile pour le canal SD.
Enfin le système pourrait être potentiellement étendu par un module SIM ou le multi-angle récemment introduite TIRFM24,25 pour augmenter la résolution spatiale. Toutefois, augmentation de la résolution spatiale peut être obtenue, selon l’état actuel de la technique, qu’au prix d’une vitesse plus lente d’imagerie. Pour tous les cellules vivantes dans laquelle il est crucial de localiser les structures à la membrane plasmique quoique conservant une résolution spatiale élevée du volume cellulaire restant des expériences d’imagerie, la configuration de SD-FRBR décrite ICIE est une facile à intégrer, facilement disponibles solution.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions grandement les scientifiques de l’université médicale centre Hamburg-Eppendorf pour nous soutenir avec des échantillons pour évaluation. À savoir, nous remercions Sabine Windhorst de cellules NIH3T3, Andrea Mordhorst pour YFP-Vinculine et Maren Rudolph pour DP-Lifeact.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
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| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
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