Summary
En avancerad Mikroskop som tillåter snabb och högupplöst kommer avbildning av både isolerade plasmamembranet och omgivande intracellulära volymen, att presenteras. Integrationen av spinning disk och total inre reflektion fluorescensmikroskopi i en setup tillåter levande imaging experiment på hög förvärv priser upp till 3,5 s per bildstapel.
Abstract
I levande celler innebär processer såsom vidhäftning bildning omfattande strukturella förändringar i plasmamembranet och cell inredningen. För att visualisera dessa högdynamiska händelser, två kompletterande ljusmikroskopi tekniker som tillåter snabb avbildning av levande prover kombinerades: spinning disk mikroskopi (SD) för snabb och högupplösta volym inspelning och Totalreflexion fluorescensmikroskopi (Frida) för exakt lokalisering och visualisering av plasmamembranet. En omfattande och komplett protokoll-avbildning visas för guidning provberedning, Mikroskop kalibrering, bild bildandet samt förvärv, vilket resulterar i flerfärgade SD-Frida levande imaging serien plats och tid med hög upplösning. Alla nödvändiga bild efterbehandling steg att generera flerdimensionella levande imaging datamängder, dvs registrering och kombination av de enskilda kanalerna, finns i en egenkomponerad makro för öppen källkod ImageJ. Bildtagning av fluorescerande proteiner under initiering och mognaden av vidhäftning komplex, liksom bildandet av aktin cytoskeletal nätverket, användes som ett bevis på principen för detta nya synsätt. Kombinationen av hög upplösning 3D mikroskopi och Frida som tillhandahålls en detaljerad beskrivning av dessa komplexa processer inom den cellulära miljön och, samtidigt, exakt lokalisering av membran-associerade molekyler upptäcks med en hög signal-till-bakgrund-förhållande.
Introduction
Våra dagar, ljusmikroskopi tekniker som ger hög/super resolution imaging i fasta och levande exemplar utvecklas snabbt. Super-upplösning tekniker såsom stimulerat utsläpp utarmning (STED), strukturerade belysningen mikroskopi (SIM) och foto-aktiveringen lokalisering mikroskopi (PALM) eller direkt stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM), respektive, är kommersiellt tillgängliga och möjliggör avbildning av subcellulära strukturer visar detaljer nästan på molekylär skala1,2,3,4,5,6. Dock har dessa synsätt fortfarande begränsad tillämplighet för levande imaging experiment där stora volymer behöver visualiseras med flera bildrutor per andra förvärv hastighet. Sorter av mycket dynamiska processer regleras via plasmamembranet, e.g. endo- / exocytos, vidhäftning, migration eller signalering, förekomma med hög hastighet inom stora cellulära volymer. Nyligen, för att fylla upp detta tomrum, en integrerad mikroskopi teknik var föreslagna kallas spinning disk-Frida (SD-Frida)7. I detalj tillåter Frida mikroskopi att specifikt isolera och lokalisera den plasmamembran8,9, medan SD mikroskopi är en av de mest känsliga och snabba live imaging tekniker för visualisering och spårning av subcellulär organeller i cytoplasman10,11. Kombinationen av båda imaging tekniker i en enda installation har redan insett i senaste12,13, dock mikroskopet presenteras här (figur 1) Slutligen uppfyller kriterierna för att utföra live imaging SD-Frida experiment av de ovan nämnda processerna på 3 stommen per andra hastigheten. Eftersom detta Mikroskop är kommersiellt tillgängliga, är målet av detta manuskript att beskriva detaljer och tillhandahålla öppen källkod-verktyg och protokoll för bild förvärv, registrering och visualisering är associerad med SD-Frida mikroskopi.
Installationen bygger på ett inverterat Mikroskop ansluten till två Skanna enheter via oberoende portar - vänster porten är kopplad till enheten SD och den baksida porten att skannerenheten för Frida och foto-aktivering /-blekning experiment. Upp till 6 lasrar (405/445/488/515/561/640 nm) kan användas för magnetisering. För magnetisering och detektion av signalen fluorescens, antingen en 100 x / NA1.45 olja eller 60 x / NA1.49 olja Frida mål, respektive, har varit anställd. Det utsända ljuset är uppdelat på en dichroic spegel (561 nm lång-pass eller 514 nm lång-pass) och filtreras av olika band-passera filter (55 nm brett centrerad på 525 nm, 54 nm brett centrerad på 609 nm för grön och röd fluorescens, respektive) placeras framför två EM-CCD cam epoker. Observera att mer teknisk information om installationen finns i Zobiak et al. 7. i Frida konfiguration, SD enheten flyttas ut ur ljusstrålen inom cirka 0,5 s så att samma två kamerorna kan användas för detektion, tillåter snabbare växling mellan de två avbildningsmetoder jämfört med circa 1 s som rapporterades tidigare13 < /C2 >. Denna funktion möjliggör dubbla kanaler samtidiga förvärv, således 4 kanaler SD-Frida imaging på tidigare oöverträffad hastighet och noggrannhet kan utföras. Anpassningen mellan SD och Frida bilder är dessutom onödiga. Bildjustering mellan de två kamerorna, har dock skall kontrolleras innan du börjar experimentet och korrigeras om det behövs. I följande protokoll genomfördes en registrering korrigering rutin i en egenkomponerad ImageJ makro. Makrot var dessutom främst avsedd att möjliggöra en samtidig visualisering av SD- och Frida datamängder trots deras olika dimensionalitet. Själva förvärvet programvaran inte ger dessa funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av celler
- Två dagar före experimentet, utsäde 3 * 105 HeLa eller NIH3T3 celler i 2 mL full odlingsmedium per brunn 6-väl cellkultur platta. Se till att celler hanteras i en LAF i hela detta protokoll.
- En dag före experimentet, förbereda transfection reagenser enligt tillverkarens rekommendationer eller ett empiriskt fastställda protokoll, t.ex.:
- Späd 1 µg av RFP-Lifeact och 1 µg YFP-Vinculin i sammanlagt 200 µL minskade serum medium. Vortex transfection reagensen kort, lägga till 4 µL 200 µL DNA och vortex igen. Inkubera transfection mixen för 15-20 min i rumstemperatur.
- Lägga till hela transfection mixen droppvis direkt i cellerna. Blanda genom att skaka plattan och Lägg tillbaka i inkubatorn.
- På dagen för experimentet, förbereda provet för levande avbildning:
- Bered en 10 µg/mL av Fibronektin i PBS att bestryka glasytan på en 35 mm glas botten maträtt. Använd endast högkvalitativa 0.17 mm glas coverslips för optimal Frida prestanda och Undvik plast botten rätter. Lämna lösningen på glasytan för 30 min i rumstemperatur, sedan ta bort den och låt skålen lufttorka.
- Späd en 0.1 µm multi fluorescerande pärlor lösning till densitet 1,8 x 109 partiklar per mL i destillerat vatten och tillsätt lösningen för 30-60 s till Fibronektin-belagda glasytan. Ta omedelbart bort lösningen och låt skålen lufttorka.
Obs: Detta steg är nödvändigt endast om Frida planet ska hittas innan sådd celler och/eller att förvärva en 2-färg referensavbildning för pärla-baserad avbildning registrering. - Bered en 0,1 M askorbinsyra (AA) och späd det till en slutlig koncentration på 0,1 mM i odlingsmedium (AA-medium). Placera lösningen i 37 ° C vattenbad.
Obs: Använd fluorescens-optimerade cellodlingsmedium om möjligt, sådant som phenolred-gratis och (ribo-) flavin-reducerad medium. AA är ett anti-oxiderande medel som kan minska fototoxiska effekter under live imaging14. Vi har testat det framgångsrikt i denna analys, dvs fler celler synts friska enligt de villkor som tillämpas än utan AA tillsats. Dock sänktes pH i medlet av 0.17 pH-enheter. - Tvätta cellerna med 2 mL PBS, tillsätt 250 µL Trypsin-EDTA och vänta tills cellerna är helt fristående (2-3 min i en inkubator i 37 ° C). Återsuspendera cellerna noggrant i 1 mL före värmde AA-medium med en pipett och lägga till 4 mL AA-medium i en 15 mL cell kultur tub. Placera cellsuspension med något öppnat lock i en inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2 i närheten av mikroskopet.
- Tillsätt 1 mL pre värmde AA-medium i skålen med glas i botten och placera den i innehavaren av mikroskopet förvärmd (se nästa punkt).
2. levande imaging
- Starta miljökontroll av mikroskopet för att åstadkomma en stabil 37 ° C, 5% CO2 och fuktig atmosfär.
Obs: Här, en liten scen top inkubation kammare har använts att tillåtna stabila inställningar inom cirka 15 min. större inkubatorer kommer att behöver mer tid att uppnå stabila förhållanden. - Fixa alla förvärv inställningar på mikroskopet innan cellsuspensionen tillämpas:
- Ange tidsintervallet-till 30 s och varaktighet till 60-90 min. Aktivera autofokus funktionen av maskinvarubaserad auto-fokus för varje tidpunkt (värdet ”1”).
- Justera kamerans exponering och vinst, samt laser kraften för varje kanal. Få hög nivåer, låg exponeringstid och låg lasereffekt är rekommendabelt att minska foto-toxicitet.
Obs: De uppgifter som presenteras här förvärvades med 200 ms exponering, få nivå 500 och 20% lasereffekt som motsvarar excitation intensiteter av 0,5 W/cm² för 488 nm och 1 W/cm² för 561 nm, respektive. - Ange z-stacken för spinning-disk kanaler till 10 µm med 0,4 µm mellanrum. Avaktivera z-stackar för Frida kanaler. Ställa in botten-offset till ”0”, dvs lägsta plan kommer att vara fokus position av hårdvara auto-fokus.
- Aktivera funktionen flerpunkts ”scenen positioner”.
Obs: Upp till 3 positioner kan registreras i ett 30 s tidsintervall.
- Hitta de fluorescerande pärlorna med epi-fluorescerande belysning på okulära eller på datorskärmen, och sedan aktivera en Frida kanal och ange en infallsvinkel till ett värde som betecknar Frida belysning. Aktivera auto-fokus genom att trycka på knappen på panelen mikroskopet och justera fokus med offset hjulet. Skaffa en 2-färg datamängden, dvs Frida-488 och Frida-561, för efterföljande pärla-baserad avbildning registrering (se punkt 3.1).
- Tillval: Frida belysning, lägga till några mikroliter av fritt flytande fluorescerande multicolor pärlor upphängning (se punkt 1.3.2.). Aktivera live-vyn av en Frida kanal och öka infallsvinkel. Icke-anhängare pärlor försvinner bortom den kritiska vinkeln, att säkerställa en korrekt Frida belysning8.
- Blanda cellsuspensionen igen genom att vända den slutna rör 2 - 3 gånger och applicera 1 mL av cellerna till imaging skålen.
- Snabbt hitta dubbel-transfekterade celler med låg nivå epi-fluorescerande belysning. Centrum cellerna i den live kamera förhandsgranskning med ljusa fält belysning och markera positionen. Hitta en annan 1-2 punkter av intresse och spara dem till listan positioner.
Obs: I början, cellerna enkelt kan lossa på grund av scenen rörelse, därmed ställa in 4-5 positioner och kontrollera igen alla före start bild förvärv. Efteråt, kasta 1-2 positioner. - Starta datainsamling genom att klicka på knappen ”sekvens”.
3. bild efterbehandling i ImageJ
- För att generera en registrering utan hyperstack i FIJI15, har det skrivits ett makro med namnet ”SD-TIRF_helper” som kan tillämpas på 2-4 kanal SD-Frida timelapse datamängder. Spara filen ”SD-TIRF_helper_JoVE.ijm” i Fijis undermapp ”makron” och köra makrot genom att klicka på kommandot ”Plugins > makron > Kör...”.
- Om färgkanalerna behöver registrering korrigering, markerar du alternativet och skapa en ny pärla-baserade registrering referens (landmark fil) eller använda en befintlig fil som skapades innan.
Obs: De turboreg plugin16 kommer att gälla fluorescens pärlor referensbilder. Installera plugin i FIJI programvara enligt allmänna riktlinjer för plugin-installationer. - Importera data med bio-format importören och välja hyperstack som ett alternativ för visning. Ladda bild datamängden, Välj SD-serien i det första steget, och Frida-serien i det andra steget. FIJI visas data sorterade efter kanal och scenen position, dvs normalt alla SD-kanaler och alla Frida-kanaler visas som en hyperstack för varje skede position som har valts.
Obs: Dataimporten är möjligt från olika filtyper, till exempel TIFF-serien eller plattformsberoende fil typer såsom * nd. Filtypen identifieras inte endast om den inte exporterades av programvaran förvärvet som oberoende, komprimering-mindre TIFF-format. - Gäller registrering korrigeringen till respektive kanaler genom att läsa in filen förutbestämda sevärdheter.
- Välj önskad färg look-up tabellen (LUT) för varje kanal som SD- och Frida och sammanfoga dem till en enda, flerdimensionella hyperstack.
Obs: Under bearbetning av Frida kanalerna, ett antal z-plan med nollvärden intensitet läggs ovanpå nedre planet som matchar med antalet z-flygplan i SD datamängden. Detta steg är viktigt för visualisering av den slutliga hyperstack. Denna metod är korrekt, eftersom djupet av Frida belysning (mindre än 200nm7) är mindre än z-steg storlek SD stacken (400 nm).
- Om färgkanalerna behöver registrering korrigering, markerar du alternativet och skapa en ny pärla-baserade registrering referens (landmark fil) eller använda en befintlig fil som skapades innan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att Visa potentialen i SD-Frida imaging, utvecklades en analysmetod som ska avslöja den plats och tid organisationen av cell-matrix vidhäftning komplex och deras interaktion med cytoskelettet under cellulär adhesion. Därför anhängare HeLa eller, alternativt, NIH3T3 celler var transfekterade med YFP-Vinculin och RFP-Lifeact för 18-24 h, trypsinized och seedade på Fibronektin-belagda glas botten rätter. Dessa cellinjer valdes för sin uttalade cytoskelettet och högre robusthet i levande imaging experiment emot, till exempel primära celler. De kan inte motstå imaging i mycket känsliga skick som de är efter trypsin behandling. På mikroskopet, YFP/RFP-uttryckande celler har valts och vidhäftning processen observerats under en 60min time-lapse (figur 2 och filmer 1 och 2). Denna särskilda analys har sällan och inte tydligt beskrivits i litteraturen17,18. Dessutom har vidhäftning bildandet mestadels undersökts i t.ex. migrera celler19,20. Således, vi behövde för att anpassa denna metod (cellinje, beläggning, medium, sammansättning) för att genomföra de experiment som beskrivs i detta dokument.
Som förväntat, celler var runda i början och bara svagt anhängare, medan membran utbuktningar sensing miljön och att göra kontakt med substratet. Cell-matrix kontakter stärkt snabbt vid bildandet av så kallade begynnande sammanväxningar20,21 (figur 2A, Frida-488 kanal, tid punkter 0-4,5 min). De senare är spot-liknande, Vinculin-positiv strukturer på den ventrala sidan av cellen. Strukturerna var tydligt i Frida bilderna. I början av vidhäftning bildandet, aktin var jämnt fördelade i cellen och lokalisera inte till dessa tidiga komplex (figur 2A, SD-561 kanal). Under loppet av tiden, vidhäftning komplex förstoras och mognat till focal sammanväxningar (figur 2 c). Dessa avlånga strukturer var huvudsakligen påtagligt på peripheryen av cellen (siffror 2A + B) och resulterade från krafter som var utövas av acto-myosin fibrer. Dessa fibrer började ansluta till vidhäftning komplexen, därmed dra dem mot cell centrum och förmå förstärkning av cell-matrix sammanväxningar samt bunta av aktin fibrer21. Tydligen, tillplattad cellen också till följd av aktin nätverk bildandet (figur 2A, XZ Visa). SD-imaging impregnerad för att metoden för val här, eftersom det tillät att visualisera denna process med hög känslighet, rumslig upplösning och komplett perspektiv. I en tidigare rapport17, kunde Frida ensam bara låta spekulera om ursprunget av perifera sammanväxningar, medan SD-Frida imaging visade tydligt sin förening med filopodia (figur 2B, tidpunkt 17 min, vita pilspets). Faktiskt, aktin fibrer framväxande centripetally från focal sammanväxningar blev synliga efter 27 min (figur 2B, gul pilspets).
Förvärv inställningarna av dessa experiment, dvs förvärv hastighet, excitation intensitet och detektor vinning, behöver dock utvärderas noggrant. Intervallet för 30 s/tidpunkt, aktivera multi punkt förvärv, verkar vara perfekt, medan excitation laser strålning intensitet (mellan 0.5-1 W/cm²) måste tas kritiska övervägs. Figur 2D visar en cell på en annan plats i samma experiment som misslyckades att fästa till substratet. Det kan vara möjligt att fototoxiska effekter påverkas biologin av cellen här, vilket slutligen resulterade i membran bubblande efter circa 60 min, som förmodligen liknar apoptos (film 2). Detta igen klart hur känsliga celler kan reagera på fototoxicitet och att det är viktigt att hitta en bra balans mellan mängden ljus sätta i och den information som tas. Att minska lasereffekten, kan antalet bilder i en z-stack eller öka känsligheten vara rätt strategi för att minska fototoxicitet. Alla dessa inställningar, dock bör justeras på en nivå som fortfarande tillåter att uppnå tillräckligt upplösning och signal-brus-förhållande, gör det möjligt för att extrahera kvantitativ information från inspelade tidsfördröjning.
Figur 1: Schematisk ritning av SD-Frida setup. A. SD imaging läge: 6 olika laserlinjerna (405/445/488/515/561/640nm, gröna linjer) är kopplat till confocal scanningenheten (CSU), passerar genom SD (position 'IN') och en tom filter kub i mikroskopet kroppen (MIC). Fluorescens utsläpp från preparatet (SPEC) beräknas genom hål för SD och split av olika dikroiskt speglar, e.g. för grön/röd eller gul/cyan samtidiga förvärv, på två olika EM-CCD-kameror (C1 och C2). Fluorescens filter placeras framför kamerorna (visas inte). B. Frida imaging läge: laserlinjerna är kopplade till Frida skannern (Frida). En multi-line stråldelare i MIC riktar strålen med förlagan och utsläpp ljus kringgår SD ('OUT') för maximerad överföring. Fluorescens upptäcks av samma kameror och utsläpp filter beskrivs i A. Denna siffra har ändrats från Zobiak et al. 7 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat av cell spridning och vidhäftning formation använda SD-Frida mikroskopi. A. dubbel-transfekterade HeLa cellen uttrycker RFP-Lifeact (röd, SD-561 kanal) och YFP-Vinculin (grön, Frida-488 kanal) var trypsinized och åter seedade på Fibronektin-belagda glas coverslips. Vidhäftning bildandet blir synlig, börjar med små begynnande sammanväxningar (Vinculin-positiv fläckar) på 0 minuter som utvecklas till större brännvidd sammanväxningar efter circa 5 minuter. Kortikala aktin framgår efter cirka 10 minuter och sträcker sig i utkanten av cellerna (se ramar vid 12 och 24,5 minuter). B. den förstorade vyn av boxed regionen i en (ruta i 45 minuter) skildrar cell spridning och övergången från begynnande till focal sammanväxningar samt filopodia-associerade sammanväxningar (vit pil) och stress fiber bildas (se ram på 27 minuter, gul pil). C. Kymograph på den streckade gula linjen dras i A. D. (Foto-) Toxiska effekter på celler eller annars ohälsosamt celler kan låta dem misslyckas att koppla till substratet. Imaging villkoren måste utvärderas kritiskt för att utesluta fototoxicitet. Skalstapeln = 5 µm (i A och D) och 2 µm (i B och C). XZ åsikter i A och D är de rätvinkliga projektionerna utvinns ur de streckade vita linjer dras däri (botten = substrat). Bilderna var linjärt kontrastförstärkt och median-filtreras med en 3 x 3 kärna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: 3D-rekonstruktion av timelapse sekvensen i Fig. 2A. Bildsekvens återges med 3D bildhanteringsprogram. Spellängd: 42,5 min. förvärv hastighet: 2 dubbla kanaler SD-Frida stackar per minut (56 bilder totalt) förvärvades. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Movie 2: film av timelapse sekvensen i Fig. 2 C. Spellängd: 60 min. förvärv hastighet: 2 dubbla kanaler SD-Frida stackar per minut (56 bilder totalt) förvärvades. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta paper presenterades de första framgångsrika genomförandet av SD och Frida mikroskopi i en konfiguration som är lämplig för att utföra levande cell imaging experiment, dvs hög förvärv priser såsom 2 SD-Frida bildstaplar per minut i 3 olika skede positioner, motsvarande sammanlagt 168 ramar (cirka 3 bilder per sekund), förvärvades. Mikroskopen i några SD-Frida som var tidigare beskrivits12,13, främst avsaknaden av tillräckligt hög avbildning hastighet att följa cellulära processer i 3D där en temporal upplösning på mindre än 2 s per bildstapel är ofta nödvändigt. Den presenterade setup kan uppnå imaging priser upp till 0,78 bildstaplar per sekund, och priser på 3,5 s per stor bildstapel i levande experiment utredande 3D vesikler dynamics har visat7. Dessutom hade tidigare SD-Frida Mikroskop bara en detektor per imaging läge, att ytterligare minska hastigheten för Multi-Channel förvärv. Tekniskt sett i dessa system som en delad vy konfiguration kunde genomföras tillåter som också samtidiga tvåfärgad förvärv med en enda kamera. Detta skulle emellertid tillåta avbildning av endast hälften av synfältet. Andra metoder att producera flerdimensionella datamängder med högupplösta plats och tid som widefield imaging kombinerat med deconvolution eller 3D super-resolution mikroskopi, dvs 3D SIM eller galler ljus ark mikroskopi22, 23, kan vara giltiga alternativ. Dock deconvolution-baserad avbildning kan enkelt införa bildartefakter i lågt signal-till-brusförhållande förvärv (eftersom det ofta är fallet under live-imaging program), och super-upplösning 3D live imaging är fortfarande en tekniskt elaborative och utmanande uppgift. I presenteras förverkligandet av en avancerad SD-Frida setup7togs fördel a SD som tillåter flyttar dual-disken och ur upptäckt sökvägen. Den här konfigurationen ger två stora fördelar: först, de samma två kamerorna kan användas för att upptäcka SD och Frida signal, vilket resulterar i en hög precision överlappning av dessa två kanaler. Andra, hål av spinning disken inte blockera något utsläpp ljus Frida förvärvet används (för mer detaljer, se figur 1B), vilket ökar samling effektiviteten viktigt för hög-känsliga levande imaging. Därför är denna optisk konfiguration gynnsamma för att genomföra någon form av Frida mikroskopi (t.ex. rörlig eller fast vinkel belysning) i befintliga SD-Mikroskop som tillåter förbi SD enheten. Dessutom används Frida skannern kan köras i så kallade time-sharing-läge, där två Frida kanaler kan spelas in samtidigt (som visas i Zobiak et al. 7), fortkörning längre upp förvärvet av flerkanaligt data.
En av de största fördelarna med att anställa Frida är att med denna metod, är det möjligt att lokalisera med högsta precision signalen från cellmembranet under en liv cell imaging experiment. Faktiskt, medan en metodik som SIM ger en bättre z-snittning och därmed bättre isolering av cellmembranet i fasta prover, i levande cell imaging experiment den exponentiella ökande/minskande av fluorescens signalen från organeller närmar sig / lämnar gränssnittet Frida får mer specifika och exakta lokalisering av cellmembranet. Lokalisering precision, även om det inte fortfarande kvantifierade, lovar att bli många veck mindre än 150-200 nm, dvs den rumsliga rad fältet evanescence.
För närvarande är en begränsning för metoden tid som krävs att bort spinning disk från ljusstrålen och börja Frida förvärv, dvs 0,5 s. Denna försening begränsar minsta tidsintervallet mellan två på varandra följande förvärv. Tekniskt sett bör det vara möjligt att minska denna fördröjning genom förbi disken med e.g. galvo-speglar och vilket minskar det totala förvärvet per SD-Frida cykel. Nyare generationen kameror kan dessutom tillåta minskade exponeringstider på hög signal-brus-förhållande. Därför kan denna setup totala prestanda förbättras fortfarande relevant genom att uppgradera maskinvarukomponenter. Från imaging synvinkel, dock finns det flera andra sätt att minimera förvärv (i fallande ordning): undvika flera positioner, minska höjden z-stack, öka z-avståndet, minimera exponeringstid (öka vinna och eventuellt använda Binning), förkorta avståndet mellan förvärvet positioner, aktivera auto-fokus endast varje n-th tidpunkt (n > 1). Trots verkliga begränsningar, om alla dessa parametrar utvärderas noga, är det möjligt att använda SD-Frida imaging för att spåra och lokalisera snabbrörliga cellulära blåsor, som presenteras i Zobiak et al. 7.
Dessutom i denna uppsats ett protokoll som beskriver förvärvet presenterades rutinen i en kanal SD-Frida dataset. Hjälp av den medföljande makron, kan raw-data exporteras i en enda TIFF-fil som innehåller alla SD- och Frida kanaler. Bildregistrering är i sig inte nödvändigt; Det är dock viktigt att båda kamerorna är exakt justerade med avseende på varandra. Återstående pixel Skift (översättning och rotation) kan upptäckas och rättas inom angivna makrot. Korrigering algoritmen använder sig av en flerkanalig referensavbildning av fluorescerande pärlor som har registreras bara innan experimentet. I den resulterande filen, är Frida planet inställd på lägsta nivån följt av ett antal noll intensitet flygplan som matchar dimensionerna SD-kanal. Det därför viktigt att förvärva data, som anges i protokollet, där avbildas Frida planet liknar den nedre änden av z-stacken för SD kanal.
Slutligen kan systemet eventuellt förlängas med en SIM-modul eller de nyligen införda multi-Angle TIRFM24,25 att ytterligare öka den rumsliga upplösningen. Men kan ökande av rumslig upplösning uppnås, enligt den nuvarande toppmoderna, endast på bekostnad av en långsammare imaging hastighet. För alla levande cellen imaging experiment där det är viktigt att lokalisera strukturer på plasmamembranet om än att upprätthålla hög rumslig upplösning av den återstående cellulära volymen, är här beskrivs SD-Frida installationen lätt att integrera, lätt tillgängliga lösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar kraftigt det vetenskapliga samfundet av de University Medical Center Hamburg-Eppendorf för att stödja oss med prover för utvärdering. Nämligen, vi tackar Sabine Windhorst för NIH3T3 celler, Andrea Mordhorst för YFP-Vinculin och Maren Rudolph för RFP-Lifeact.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
