Summary
En avansert mikroskop som tillater rask og høy oppløsning vil imaging av både isolert plasma membranen og omkringliggende intracellulær volumet, bli presentert. Integreringen av spinning disk og total intern refleksjon fluorescens mikroskopi i ettall setup kan live bildebehandling eksperimenter på høy oppkjøpet datahastigheter på opptil 3,5 s per bildestakk.
Abstract
I levende celler innebære prosesser som vedheft formasjon omfattende strukturendringer i plasma membranen og celle interiør. For å visualisere disse svært dynamisk hendelsene, to utfyllende * lys teknikker som tillater rask bildebehandling av live prøver ble kombinert: spinning disk mikroskopi (SD) for rask og høy oppløsning opptak og total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi for nøyaktig lokalisering og visualisering av plasma membranen. En omfattende og komplett tenkelig protokoll vises for guiding gjennom eksempel forberedelse, mikroskop kalibrering, bildet formasjonen og oppkjøp, noe som resulterer i multi-farge SD-TIRF live bildebehandling serie med spatio-temporale høyoppløselig. Alle krevd image etterbehandling skritt for å generere flerdimensjonal live bildebehandling datasett, dvs. registrering og kombinasjonen av individuelle kanalene, finnes i en selv-skrevet makro for åpen kildekode-programvare ImageJ. Avbilding av fluorescerende proteiner under initiering og modning av vedheft komplekser, i tillegg til dannelsen av cellen cytoskjelett begrepsordbok nettverket ble brukt som et bevis på prinsippet for denne romanen tilnærming. Kombinasjonen av høy resolution 3D mikroskopi og TIRF gitt en detaljert beskrivelse av disse komplekse prosesser i cellular miljøet, og på samme tid, nøyaktig lokalisering av membran-assosiert molekyler oppdaget med høy signal-til-bakgrunn forholdet.
Introduction
Våre dager, * lys teknikker gir høy/super oppløsning imaging i faste og levende prøven utvikler raskt. Super-oppløsning teknikker som stimulerte utslipp nedbryting (STED), strukturert belysning mikroskopi (SIM) og foto-aktivering lokalisering mikroskopi (PALM) eller direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM), henholdsvis, er kommersielt tilgjengelig og aktivere avbildning av subcellular strukturer viser detaljer nesten på molekylære skala1,2,3,4,5,6. Men har disse fortsatt begrenset anvendbarhet for live bildebehandling eksperimenter der store volumer må visualiseres med flere bilder per andre oppkjøpet hastighet. Varianter av svært dynamisk prosesser regulert plasma membranen, f.eks endo- / exocytosis, vedheft, overføring eller signalnettverk, oppstår med høy hastighet i store mobilnettet volumer. Nylig, for å fylle opp dette gapet, en integrert mikroskopi teknikk var foreslåtte kalt spinning disk-TIRF (SD-TIRF)7. I detalj tillater TIRF mikroskopi spesielt isolere og lokalisere plasma membranen8,9, mens SD mikroskopi er en av de mest sensitive og rask leve Bildeteknikker for visualisering og sporing av subcellular organeller i cytoplasma10,11. Kombinasjonen av både Bildeteknikker i et enkelt oppsett har allerede blitt realisert i siste12,13, men mikroskopet presenteres her (figur 1) endelig oppfyller kriteriene for å utføre live bildebehandling SD-TIRF eksperimenter nevnte prosesser for 3 rammens per andre hastighet. Siden denne mikroskopet er kommersielt tilgjengelig, er målet med dette manuskriptet å beskrive detaljer og gi open source verktøy og protokoller for bildeopptak, registrering og visualisering forbundet med SD-TIRF mikroskopi.
Oppsettet er basert på en invertert mikroskop koblet til to skanning enheter via uavhengig porter - venstre porten er koblet til SD enhet og tilbake porten skannerenheten for TIRF og foto-aktivering /-bleking eksperimenter. Opptil 6 lasere (405/445/488/515/561/640 nm) kan brukes for eksitasjon. For eksitasjon og påvisning av fluorescens signalet, enten en 100 x / NA1.45 olje eller 60 x / NA1.49 olje TIRF mål, henholdsvis har vært ansatt. Slippes ut lyset er delt av en dichroic speil (561 nm lang-pass eller 514 nm lang-pass) og filtrert av forskjellige bånd-pass-filtre (55 nm bredt sentrert på 525 nm, 54 nm bredt sentrert ved 609 nm til grønne og røde fluorescens, henholdsvis) plassert foran to EM-CCD cam tidsepoker. Merk at flere tekniske opplysninger om oppsettet er oppført i Zobiak et al. 7. i TIRF konfigurasjon, SD enheten flyttes ut av lys banen i ca 0,5 s slik at de samme to kameraene kan brukes til å søke, tillater raskere veksling mellom to tenkelig modalitetene sammenlignet med ca 1 s som ble rapportert tidligere13 < /C2 >. Denne funksjonen aktiverer tokanals samtidige oppkjøpet, dermed 4 kanaler SD-TIRF imaging i tidligere uovertruffen hastighet og nøyaktighet kan utføres. Videre er justering mellom SD og TIRF bilder unødvendig. Bildejustering mellom de to kameraene, har imidlertid kontrolleres før du starter eksperimentet og korrigeres hvis nødvendig. I følgende protokollen, ble en registrering korreksjon rutine implementert i en selv-skrevet ImageJ makro. Videre var makroen hovedsakelig utformet slik at en samtidige visualisering av SD- og TIRF datasett til tross for deres forskjellige dimensionality. Oppkjøpet programvaren gir ikke disse funksjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av celler
- To dager før eksperimentet frø 3 * 105 HeLa eller NIH3T3 celler i 2 mL full oppblomstringen medium per brønn av en 6-og celle-kultur plate. Sikre at cellene behandles i laminær strømning hette gjennom denne protokollen.
- Én dag før eksperimentet, forberede hva reagenser i henhold til produsentens anbefalinger eller en empirisk bestemt protokoll, f.eks:
- Fortynne 1 µg av RFP-Lifeact og 1 µg av YFP-Vinculin i totalt 200 µL redusert serum medium. Vortex transfection reagensen kort, legge 4 µL til 200 µL DNA og vortex igjen. Inkuber transfection blandingen i 15-20 min ved romtemperatur.
- Legge til hele transfection mix dropwise direkte i cellene. Blande av risting plate og sett den tilbake i inkubator.
- På dagen for eksperimentet, forberede prøven live bildebehandling:
- Forberede en 10 µg/mL løsning av fibronectin i PBS til coat glassoverflaten av et 35 mm glass bunnen rett. Bruk kun høy kvalitet 0,17 mm glass coverslips for optimal TIRF ytelse og unngå plast nederst retter. La løsningen på glassplaten for 30 min ved romtemperatur, deretter fjerne den og la fatet air-dry.
- Fortynne en 0,1 µm multi fluorescerende perler løsning til en tetthet på 1,8 x 109 partikler per mL i destillert vann og legge til løsningen for 30-60 s fibronectin-belagt glassplaten. Fjerne umiddelbart løsningen og la fatet air-dry.
Merk: Dette trinnet er bare nødvendig hvis TIRF flyet bør finnes før såing celler og/eller å kjøpe en 2 farger referanse bildet for perle-basert image registrering. - Forberede en 0.1 M askorbinsyre (AA) løsning og fortynne den å en final konsentrasjon av 0,1 mM i vekst medium (AA-middels). Plass løsningen i et 37 ° C vannbad.
Merk: Bruk fluorescens-optimalisert celle kultur medium hvis mulig, slik som phenolred-fri og (ribo-) flavin-redusert medium. AA er en anti-oksiderende agent som kan redusere fototoksisk effekter under live bildebehandling14. Vi har testet det med hell i denne analysen, dvs flere celler dukket opp sunn under betingelser brukes enn uten AA tillegg. Men ble pH i mediet senket av 0,17 pH enheter. - Vask cellene med 2 mL PBS, legge til 250 µL Trypsin-EDTA og vente til cellene er fullt frittliggende (2-3 min i en inkubator 37 ° C). Resuspend cellene forsiktig i 1 mL pre varmet AA-medium med en pipette og legge den til 4 mL AA-medium i et 15 mL celle kultur rør. Sett celle suspensjon med litt åpnet lokk i en inkubator til 37 ° C og 5% CO2 i mikroskopet.
- Legge 1 mL pre varmet AA-middels til glass bunnen rett og plasser den i innehaveren av det pre-oppvarmet microscope (se neste avsnitt).
2. live bildebehandling
- Starte miljømessige kontroll av mikroskop for å oppnå en stabil 37 ° C, 5% CO2 og fuktig atmosfære.
Merk: Her, en liten scenen topp inkubasjon kammer er brukt at tillatte stabil innstillinger i ca 15 min. større inkubatorer trenger mer tid til å oppnå stabile forhold. - Løse alle oppkjøpet innstillinger i mikroskopet før cellen suspensjon brukes:
- Angi tidsintervallet-til 30 s og varigheten til 60-90 min. aktivere bilen-fokusere funksjonen de maskinvarebasert auto-fokus for hvert punkt (verdien "1").
- Justere kameraet eksponering og gevinst, samt laser makt for hver stasjon. Gain høy nivåer, lav eksponeringstid og lav laser makt er tilrådelig å redusere Foto-toksisitet.
Merk: Dataene som presenteres her ble kjøpt med 200 ms eksponering får 500 og 20% laser makt som tilsvarer eksitasjon intensiteter av 0,5 M/cm ² for 488 nm og 1 W/cm ² for 561 nm, henholdsvis. - Angi z-stakken for spinning-disk kanalene 10 µm med 0,4 µm avstand. De-aktivere z-stabler for TIRF kanaler. Bunn-forskyvningen er satt til "0", dvs laveste flyet blir fokus plasseringen av maskinvare auto-fokus.
- Aktivere funksjonen multi-Point "scenen stillinger".
Merk: Opptil 3 posisjoner kan registreres i 30 s mellomrom.
- Finne fluorescerende perler med epi-fluorescerende lys på okulær eller på skjermen, og aktivere en TIRF kanal og sette belysning vinkelen til en verdi som angir TIRF belysning. Aktivere den auto-fokuset ved å trykke på knappen på mikroskopet panel og justere fokus med offset hjulet. Kjøpe en 2-fargers dataset, i.e. TIRF-488 og TIRF-561, etterfølgende perle-basert image registrering (se punkt 3.1).
- Valgfritt: For å sikre TIRF belysning, Legg noen microliters av fritt flytende fluorescerende multicolor perler suspensjon (se punkt 1.3.2.). Aktivere live view på en TIRF kanal og øke belysning vinkel. Ikke-tilhenger perlene forsvinner utenfor kritisk vinkel, sikrer en riktig TIRF belysning8.
- Bland celle suspensjon igjen ved å snu lukket røret 2 - 3 ganger og 1 mL av cellene gjelder tenkelig parabolen.
- Raskt finne dobbel-transfekterte celler med lavt nivå epi-fluorescerende lys. Midtstiller cellene i for live kamera forhåndsvisningen lyse feltet belysning og markere posisjonen. Finne en annen 1-2 steder av interesse og lagre dem til listen posisjoner.
Merk: I begynnelsen, cellene enkelt kan koble på grunn av scenen bevegelse, derfor sett 4-5 stillinger og re-sjekk alle før bildeopptak. Etterpå forkaste 1-2 posisjoner. - Start datainnsamling ved å klikke på knappen "Sequence".
3. image etterbehandling i ImageJ
- For å generere en registrering uten hyperstack i FIJI15, er en makro kalt "SD-TIRF_helper" skrevet som kan brukes på 2-4 kanal SD-TIRF timelapse datasett. Lagre filen "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" i Fiji undermappe "makroer" og kjøre makroen ved å klikke på menykommandoen "Plugins > makroer > løpe...".
- Hvis fargekanalene trenger registrering korreksjon, velger og opprette en ny perle-baserte registrering referanse (landemerke-fil) eller bruke en eksisterende fil som ble opprettet før.
Merk: Turboreg plugg16 brukes til fluorescens perler referanse bilder. Installere plugin i FIJI programvare i henhold til de generelle retningslinjene for plugin installasjoner. - Importer dataene med bio-formater importøren og velger hyperstack som et visningsalternativ. Laste bildet datasettet, velge SD-serien i første trinn, og TIRF-serien i andre trinn. FIJI viser dataene sortert etter kanal og scenen posisjon, dvs normalt alle SD-kanaler og alle TIRF-kanaler vises som en hyperstack for hver scene posisjon som er valgt.
Merk: Dataimport er mulig fra ulike filtyper, for eksempel TIFF-serien eller plattform-avhengige filen typer som * nd. Filtypen kan ikke gjenkjennes bare hvis det ikke ble eksportert av oppkjøpet som uavhengig, komprimering mindre TIFF-format. - Bruke registrering korreksjon til de respektive kanalene ved innlasting forhåndsbestemt landemerker.
- Velg den ønskede fargen look-up tabellen (LUT) for hver SD- og TIRF-stasjon og sette dem sammen til en enkelt, multi-dimensjonale hyperstack.
Merk: Under behandlingen av TIRF kanaler, en rekke z-fly med nullverdier intensitet er lagt over bunnen flyet som samsvarer med antall z-fly i SD datasettet. Dette trinnet er viktig for visualisering av den endelige hyperstack. Denne metodikken er riktig, siden dybden i TIRF belysning (mindre enn 200nm7) er mindre enn z-trinn av SD-stakken (400 nm).
- Hvis fargekanalene trenger registrering korreksjon, velger og opprette en ny perle-baserte registrering referanse (landemerke-fil) eller bruke en eksisterende fil som ble opprettet før.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vise potensialet i SD-TIRF imaging, en analysen ble utviklet som skulle avsløre spatio-temporale organiseringen av celle-matrix vedheft komplekser og deres samspill med cytoskeleton under cellular vedheft. Derfor tilhenger HeLa eller alternativt NIH3T3 celler var transfekterte med YFP-Vinculin og RFP-Lifeact for 18-24 h, trypsinized og sådd på fibronectin-belagt glass bunn retter. Disse linjer ble valgt for sin uttalt cytoskjelett og høyere robusthet live bildebehandling eksperimenter imot, for eksempel primær celler. De kan ikke motstå imaging i svært følsomme stand som de er etter trypsin behandling. Mikroskopet, YFP/RFP-uttrykke celler ble valgt og vedheft prosessen observert under 60min time-lapse (figur 2 og filmer 1 og 2). Denne spesifikke analysen har sjelden og ikke klart blitt beskrevet i litteraturen17,18. Videre har vedheft dannelsen hovedsakelig blitt undersøkt i f.eks migrere celler19,20. Dermed måtte vi tilpasse denne metodikken (celle linje belegg medium, komposisjon) for å gjennomføre eksperimenter beskrevet i dette dokumentet.
Som forventet, celler var rund-formet i begynnelsen og bare svakt tilhenger, mens membran utstikkende deler var sensing miljøet og gjør kontakt med underlaget. Celle-matrix kontakter styrket raskt på dannelsen av såkalte begynnende adhesjon20,21 (figur 2A, TIRF-488 kanal, tid poeng 0-4.5 min). Sistnevnte er flekk-aktig, Vinculin-positive strukturer på ventral side i cellen. Strukturer var synlig i TIRF bilder. I begynnelsen av vedheft formasjon, begrepsordbok var jevnt fordelt i cellen og lokalisere ikke til disse tidlige komplekser (figur 2A, SD-561 kanal). I løpet av tiden, vedheft forstørret og modnet til fokal adhesjon (figur 2C). Disse langstrakt strukturene var hovedsakelig gjenkjennelige utkanten av cellen (tall 2A + B) og resulterte fra styrker som var utøves av acto-myosin fiber. Disse fiber begynte å koble til vedheft komplekser, og dermed trekke dem mot celle midten og inducing styrking av celle-matrix adhesjon samt bunting begrepsordbok fiber21. Angivelig, cellen også flat grunn av utgangen nettverk dannelse (figur 2A, XZ-visningen). SD-imaging bevis for å bli metoden for valg, som det lov visualisere prosessen med høy følsomhet, romlig oppløsning og en komplett perspektiv. I en tidligere rapport17, kan TIRF alene bare la spekulere om opprinnelsen periferisk adhesjon, mens SD-TIRF imaging tydelig viste sin tilknytning til filopodia (figur 2B, punkt 17 min, hvitt pilhode). Faktisk ble begrepsordbok fiber nye centripetally fra fokal adhesjon synlig etter 27 min (figur 2B, gul pilspiss).
Men må innstillingen oppkjøpet av disse eksperimentene, dvs oppkjøpet hastighet, eksitasjon intensitet og detektor gevinst, vurderes nøye. Tidsintervallet 30 s/timepoint, slik at flere punkt oppkjøpet, synes å være ideelt, mens stråling intensiteten av eksitasjon laser (mellom 0,5-1 cm W/²) må tas under kritisk vurdering. Figur 2D viser en celle på et annet sted i samme eksperiment som kan ikke knyttes til underlaget. Det kan være mulig at fototoksisk effekter påvirket biologi cellen her, som til slutt resulterte i membranen boblende etter ca 60 min., sannsynligvis ligner apoptose (Movie 2). Dette laget igjen klart hvor følsom celler kan reagere på Phototoksisitet og at det er viktig å finne en god balanse mellom mengden lys innlegge og informasjonen blir tatt ut. Redusere laser makt, kan antall bilder i en z-stabel eller øke gevinsten være strategien for å redusere Phototoksisitet. Alle disse innstillingene, men burde være innstilt på et nivå som gir nok oppløsning og signal til støyforhold, aktivere trekke ut kvantitativ informasjon fra den innspilte tid forfalle.
Figur 1: skjematisk tegning av SD-TIRF. A. SD tenkelig modus: 6 forskjellige laser linjene (405/445/488/515/561/640nm, grønn linje) er kombinert i AC confocal skanning enheten (CSU), går gjennom SD (posisjon "IN") og en tom filter kube i mikroskopet kroppen (MIC). Fluorescens utslipp fra prøven (SPEC) er anslått gjennom knappenålshull SD og delt av ulike dichroic speil, f.eks til grønn/rød eller gul/cyan samtidige oppkjøp, på to forskjellige EM-CCD kameraer (C1 og C2). Fluorescens filtre plasseres foran kameraene (vises ikke). B. TIRF tenkelig modus: laser linjene er koplet til TIRF skanneren (TIRF). En flerlinjet strålen splitter i MIC leder strålen til prøven og utslipp lys forbigår SD ('OUT') maksimert overføring. Fluorescens oppdages av samme kameraer og utslipp filtre beskrevet i A. Dette tallet er endret fra Zobiak et al. 7 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant resultatene av celle spredning og vedheft formasjon bruke SD-TIRF mikroskopi. A. dobbelt-transfekterte HeLa celle uttrykke RFP-Lifeact (rød, SD-561 kanal) og YFP-Vinculin (grønn, TIRF-488 kanal) var trypsinized og nytt frø på fibronectin-belagt glass coverslips. Vedheft formasjon blir synlig, starter med små begynnende adhesjon (Vinculin-positive flekker) 0 minutter som utvikler seg til større fokal adhesjon etter ca 5 minutter. Kortikale utgangen er tydelig etter ca 10 minutter og strekker seg i utkanten av cellene (se rammer 12 og 24,5 minutter). B. forstørrede visningen av regionen eske i (ramme på 45 minutter) viser celle spredning og overgangen fra begynnende til fokal adhesjon samt filopodia-assosiert adhesjon (hvitt pilhode) og stress fiber dannes (se ramme 27 minutter, gul pilspiss). C. Kymograph av stiplet gule linjen i A. D. (Foto-) Toksiske effekter på celler eller annen måte usunn celler kan la dem mislykkes å feste til underlaget. Imaging forhold må vurderes kritisk for å utelukke Phototoksisitet. Skala bar = 5 µm (i A og D) og 2 µm (i B og C). Visningene XZ i A og D er orthogonal anslagene Hentet fra de stiplede hvite linjene trukket der (bunnen = substrat). Bildene ble lineært kontrast forbedret og median-filtrert med kjerne 3 x 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: 3D-gjenoppbygging av timelapse sekvensen i Fig. 2A. Bildet sekvensen ble gjengitt med 3D bildebehandlingsprogrammer. Varighet: 42,5 min. oppkjøpet hastighet: 2 tokanals SD-TIRF stabler per minutt (56 rammer totalt) ble kjøpt. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Movie 2: film av timelapse rekkefølgen Fig. 2 C. Varighet: 60 min. oppkjøpet hastighet: 2 tokanals SD-TIRF stabler per minutt (56 rammer totalt) ble kjøpt. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette papiret ble presentert den første vellykkede implementeringen av SD og TIRF mikroskopi i en konfigurasjon som er egnet til å utføre levende celle tenkelig eksperimenter, dvs høy oppkjøpet priser som 2 SD-TIRF bildestakker per minutt på 3 forskjellige scene posisjoner, tilsvarer totalt 168 rammer (ca 3 bilder per sekund), ble anskaffet. De få SD-TIRF mikroskop som ble beskrevet tidligere12,13, hovedsakelig mangel på tilstrekkelig høy tenkelig hastighet å følge cellulære prosesser i 3D som en midlertidig løsning på mindre enn 2 s per bildestakk er ofte nødvendig. Presentert oppsettet kan oppnå tenkelig priser til 0.78 bildestakker per sekund, og priser av 3.5 s per store bildestakk live eksperimenter undersøker 3D vesicle dynamics har vært vist7. I tillegg hadde tidligere SD-TIRF mikroskop eneste detektor per imaging modus, reduserer ytterligere hastigheten for flerkanals oppkjøp. Teknisk, i disse systemene en split-konfigurasjon kan implementeres som også kan samtidig dual-farge oppkjøp med et enkelt kamera. Dette ville imidlertid tillate imaging bare halvparten av synsfeltet. Andre metoder for å produsere flerdimensjonal datasett med spatio-temporale høyoppløselig som widefield-avbildning kombinert med deconvolution eller 3D super-oppløsning mikroskopi, dvs. 3D SIM eller gitter lys ark mikroskopi22, 23, kan være gyldig alternativer. Imidlertid deconvolution-basert bildebehandling kan introdusere bilderester i lav signal-til-støy forholdet oppkjøp (som det er ofte tilfellet under bor bildebehandlingsprogrammer), og super-oppløsning 3D live bildebehandling er fortsatt en teknisk elaborative og utfordrende oppgave. I presentert realisering av en avansert SD-TIRF setup7tatt fordel av en SD-enhet som lar flytte dobbelt-disken av gjenkjenning banen. Denne konfigurasjonen gir to store fordeler: først de samme to kameraene kan brukes til å oppdage SD- og TIRF signal, som resulterer i en høy presisjon overlapping av disse to kanalene. Andre knappenålshull av spinner disken ikke blokker noe utslipp lys når opererer i TIRF vinningen måte (for mer informasjon, se figur 1B), dermed øke samling effektiviteten viktig for høy-sensitive live bildebehandling. Derfor er denne optiske konfigurasjon gunstig for å gjennomføre noen form for TIRF mikroskopi (f.eks variabel eller fast vinkel belysning) i eksisterende SD-mikroskop at omgåelsen SD enheten. I tillegg brukes TIRF skanneren kan kjøres i såkalte gang-deling modus, der to TIRF kanaler kan tas opp samtidig (som vist i Zobiak et al. 7), fartsovertredelse videre opp oppkjøpet av flerkanals data.
En av de største fordelene ved å bruke TIRF er at med denne metoden, er det mulig å lokalisere med høyeste presisjon signalet fra cellemembranen under en livet celle imaging eksperiment. Faktisk, mens en metodikk som SIM gir en bedre z-skjæring og dermed bedre isolasjon i cellemembranen i fast prøver, i levende celle imaging eksperimenter det eksponentielle øke/redusert fluorescens signalet fra organeller nærmer / forlater TIRF grensesnittet tillatt mer spesifikk og presis lokalisering av cellemembranen. Lokalisering presisjon, selv om ikke fortsatt kvantifisert, lover å være mange kaster mindre enn 150-200 nm, dvs romlige området i feltet evanescence.
Tiden er en begrensning av metoden tiden nødvendig å fjerne spinning disk enheten fra lys banen og starte TIRF erverv, dvs 0,5 s. Denne forsinkelsen begrenser minste tidsintervallet mellom to påfølgende oppkjøp. Teknisk, bør det være mulig å redusere denne ventetiden gjennom omgåelsen disken med f.eks galvo-speil og dermed redusere total oppkjøpet per SD-TIRF syklus. Nyere generasjon kameraer kan også gi redusert eksponeringstider på høy signal-til-støy-forhold. Derfor, den generelle ytelsen til dette oppsettet kan fortsatt relevantly forbedres ved å oppgradere maskinvarekomponentene. Fra tenkelig synspunkt, men det er mange andre måter å minimere oppkjøpet tiden (i synkende rekkefølge): unngå flere stillinger, redusere z-stack høyden, øke z-avstanden, minimere eksponeringstid (økning få og muligens bruke binning), Reduser avstanden mellom oppkjøpet posisjoner, aktivere auto-fokus bare hver n-te tidspunkt (n > 1). Til tross for faktiske begrensninger, hvis alle de parameterne vurderes nøye, er det mulig å bruke SD-TIRF imaging for sporing og lokalisere raskt flytte mobilnettet blemmer, som presenteres i Zobiak et al. 7.
Videre i dette papiret en protokoll som beskriver oppkjøpet ble rutine av enkanals SD-TIRF dataset presentert. Bruker den angitte makroen, kan rå data eksporteres i en enkelt TIFF-fil som inneholder alle SD- og TIRF kanaler. Bildet registrering er sådan ikke nødvendig; Det er imidlertid viktig at begge kameraene er nøyaktig justert forhold til hverandre. Gjenværende pixel Skift (oversettelse og rotasjon) kan oppdages og rettet innen angitte makroen. Korrigeringsalgoritme gjør bruk av en flerkanals referanseavbildning av fluorescerende perler som må registreres bare før du starter eksperimentet. I resultatfilen satt TIRF flyet på laveste nivå etterfulgt av en rekke null intensitet fly som er samsvarende dimensionality av SD-kanalen. Derfor er det viktig å skaffe data, som beskrevet i protokollen, der fotografert TIRF flyet ligner den nedre enden av z-stakken satt til SD-kanalen.
Endelig kan systemet potensielt utvides av en SIM-modul eller nylig introdusert multi-Angle TIRFM24,-25 ytterligere økning romlig oppløsning. Men oppnås økende av romlig oppløsning, ifølge den gjeldende toppmoderne, bare på bekostning av en tregere tenkelig hastighet. For alle de levende cellen imaging eksperimenter der det er avgjørende å lokalisere strukturer på plasma membranen riktignok opprettholde høy romlig oppløsning på gjenværende mobilnettet volumet, er her beskrevet SD-TIRF oppsettet lett å integrere, lett tilgjengelig løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker sterkt det vitenskapelige samfunnet i University Medical Center Hamburg-Eppendorf for å støtte oss med prøver for evaluering. Nemlig, vi takker Sabine Windhorst for NIH3T3 celler, Andrea Mordhorst for YFP-Vinculin og Maren Rudolph for RFP-Lifeact.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
