Summary
Imaging di entrambi, l'isolato della membrana plasmatica e il volume intracellulare circostante, sarà presentato un microscopio avanzato che consentono veloce e ad alta risoluzione. L'integrazione di filatura disco e totale microscopia di fluorescenza di riflessione interna in un'unica configurazione permette esperimenti dal vivo imaging al prezzo di acquisizione alta fino a 3,5 s per serie di immagini.
Abstract
In cellule viventi, processi quali la formazione di aderenze coinvolgono vasti cambiamenti strutturali nella membrana plasmatica e l'interno delle cellule. Per visualizzare questi eventi altamente dinamici, sono stati combinati due tecniche di microscopia chiara complementari che permettono la formazione immagine veloce dei campioni dal vivo: filatura microscopia disco (SD) per la registrazione veloce e ad alta risoluzione volume e riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRF) per localizzazione precisa e la visualizzazione della membrana plasmatica. Verrà mostrato un protocollo di formazione immagine ampio e completo per guidare attraverso la preparazione del campione, taratura del microscopio, formazione dell'immagine e acquisizione, con conseguente serie di formazione immagine multicolore SD-TIRF dal vivo ad alta risoluzione spazio-temporale. Tutti i passaggi di post-elaborazione immagine necessaria per generare dataset multidimensionale in imaging dal vivo, cioè registrazione e combinazione dei singoli canali, sono forniti in una macro auto-scritta per il software open source ImageJ. L'imaging di proteine fluorescenti durante l'inizio e la maturazione dei complessi di adesione, così come la formazione della rete del citoscheletro di actina, è stato utilizzato come una prova di principio per questo nuovo approccio. La combinazione di microscopia 3D ad alta risoluzione e TIRF ha fornito una descrizione dettagliata di questi processi complessi all'interno dell'ambiente cellulare e, allo stesso tempo, precisa localizzazione delle molecole di membrana-collegato rilevato con un alto rapporto di segnale--fondo.
Introduction
Nostri giorni, tecniche di microscopia chiara fornendo alta/super risoluzione imaging in fissa ed esemplare vivente sono in rapida evoluzione. Tecniche di Super-risoluzione stimolato microscopia di emissione svuotamento (STED), strutturato illuminazione (SIM) e microscopia di localizzazione foto-attivazione (PALM) o microscopia diretta ricostruzione ottica stocastica (tempesta), rispettivamente, sono disponibili in commercio e permettono la formazione immagine di strutture subcellulari mostrano dettagli quasi su scala molecolare1,2,3,4,5,6. Tuttavia, questi approcci ancora limitata applicabilità per esperimenti di imaging dal vivo in cui grandi volumi devono essere visualizzate con più fotogrammi al secondo velocità di acquisizione. Varietà dei processi altamente dinamici regolamentati tramite la membrana del plasma, ad es. endo- / esocitosi, adesione, migrazione o segnalazione, si verificano con l'alta velocità all'interno di grandi volumi di cellulare. Recentemente, al fine di riempire questa lacuna, una tecnica di microscopia integrato era proposto chiamato filatura disco-TIRF (SD-TIRF)7. In dettaglio, la microscopia TIRF consente specificamente isolare e localizzare la membrana plasmatica8,9, mentre la microscopia SD è uno della più sensibile e veloce live tecniche di imaging per la visualizzazione e il monitoraggio di organelli sottocellulari nel citoplasma10,11. La combinazione di due tecniche di imaging in un unico setup è stata realizzata già nel passato12,13, tuttavia, il microscopio presentato qui (Figura 1) infine soddisfa i criteri per eseguire esperimenti di SD-TIRF imaging dal vivo dei suddetti processi a 3 fotogrammi al secondo di velocità. Poiché questo microscopio è commercialmente disponibile, l'obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere in dettaglio e fornire strumenti open source e protocolli per l'acquisizione delle immagini, registrazione e visualizzazione associata con microscopia di SD-TIRF.
Il programma di installazione si basa su un microscopio invertito a scansione due unità tramite porte indipendenti - la porta di sinistra è collegata all'unità SD e porta posteriore per unità scanner per TIRF e foto-attivazione /-candeggio esperimenti. Fino a 6 laser (405/445/488/515/561/640 nm) può essere utilizzato per l'eccitazione. Per il rilevamento del segnale di fluorescenza, sia una 100 x ed eccitazione / NA1.45 olio o x 60 / NA1.49 olio obiettivo TIRF, rispettivamente, sono stati impiegati. La luce emessa è divisa da uno specchio dicroico (561 nm long-pass o 514 nm long-pass) e filtrata dai vari filtri passa-banda (55 nm vasta centrata a 525 nm, 54 nm vasta centrata a 609 nm per fluorescenza verde e rosso, rispettivamente) posizionato davanti alla cam EM-CCD due ere. Siete pregati di notare che ulteriori dettagli tecnici sull'installazione sono elencati in Zobiak et al. 7. in configurazione TIRF, l'unità SD viene spostato fuori dal percorso della luce all'interno di circa 0,5 s affinché le stesse due telecamere possono essere utilizzate per il rilevamento, consentendo più veloce di commutazione tra le due modalità di imaging, rispetto ai circa 1 s è stato segnalato in passato13 < /C2 >. Questa funzionalità consente acquisizione simultanea dual channel, quindi 4 canali SD-TIRF imaging in precedenza Velocità ineguagliata e precisione possa essere eseguite. Inoltre, l'allineamento tra le immagini SD e TIRF è inutile. Allineamento dell'immagine tra le due fotocamere, tuttavia, deve essere controllato prima di iniziare l'esperimento ed eventualmente corretto. Nel seguente protocollo, una routine di correzione di registrazione è stata implementata in una macro di ImageJ auto-scritta. Inoltre, la macro è stata progettata principalmente per consentire una visualizzazione simultanea dei DataSet TIRF nonostante la loro diversa dimensionalità e SD. Il software di acquisizione in sé non ha fornito queste caratteristiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparazione delle celle
- Due giorni prima dell'esperimento, seme 3 * 105 HeLa o NIH3T3 cellule in 2 mL di terreno di sviluppo completo per pozzetto di una piastra di coltura cellulare 6 pozzetti. Assicurarsi che le celle vengano gestite in una cappa a flusso laminare in tutto questo protocollo.
- Un giorno prima dell'esperimento, preparare i reagenti di transfezione secondo le raccomandazioni del produttore o un protocollo empiricamente determinato, ad esempio:
- Diluire 1 µ g di RFP-Lifeact e 1 µ g di YFP-Vinculin in un totale di 200 µ l ridotto medio del siero. Vortice il reagente di transfezione brevemente, aggiungere 4 µ l a 200 µ l DNA e vortex nuovamente. Incubare il mix di transfezione per 15-20 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere goccia a goccia il mix di transfezione intero direttamente alle cellule. Mescolare agitando la piastra e rimetterla in incubatrice.
- Il giorno dell'esperimento, è necessario preparare il campione per l'imaging dal vivo:
- Preparare una soluzione di 10 µ g/mL di fibronectina in PBS per rivestire la superficie di vetro di un piatto fondo di vetro 35mm. Utilizzare solo lamelle di vetro 0,17 mm di alta qualità per prestazioni ottimali di TIRF ed evitare piatti inferiore in plastica. Lasciare la soluzione sulla superficie del vetro per 30 min a temperatura ambiente, quindi rimuoverlo e lasciate il piatto asciugare all'aria.
- Diluire una soluzione multi-fluorescente perline 0,1 µm ad una densità di 1,8 x 109 particelle / mL in acqua distillata ed aggiungere la soluzione per 30-60 s alla superficie di vetro rivestite di fibronectina. Rimuovere immediatamente la soluzione e lasciare il piatto asciugare all'aria.
Nota: Questo passaggio è necessario solo se l'aereo TIRF dovrebbe essere trovato prima della semina di cellule e/o di acquisire un'immagine di riferimento 2-colore per la registrazione di immagine basata sul tallone. - Preparare una soluzione di acido ascorbico (AA) 0,1 M e diluirla a una concentrazione finale di 0,1 mM a crescita medio (medio-AA). Posto la soluzione in bagnomaria a 37 ° C.
Nota: Utilizzare fluorescenza-ottimizzato medium della coltura cellulare, se possibile, tali come phenolred-free e medio di flavin-ridotto (ribo-). AA è un agente anti-ossidante che può ridurre effetti fototossici durante live imaging14. È stato testato con successo in questo test, cioè più cellule sono sembrato sane sotto le condizioni applicate rispetto senza aggiunta di AA. Tuttavia, il pH del terreno è stato abbassato da 0,17 unità di pH. - Lavare le cellule con 2 mL di PBS, aggiungere 250 µ l tripsina-EDTA e attendere fino a quando le cellule sono completamente indipendente (2-3 min in un incubatore a 37 ° C). Risospendere le cellule attentamente in 1 mL pre-riscaldati AA-medio con una pipetta e aggiungerlo a AA-medio da 4 mL in una provetta di cultura cellulare da 15 mL. Posizionare la sospensione cellulare con il coperchio leggermente aperto in un'incubatrice impostata a 37 ° C e 5% di CO2 in prossimità del microscopio.
- Aggiungere 1 mL pre-riscaldati AA-medio per il piatto di fondo di vetro e inserirlo nel supporto del microscopio pre-riscaldato (Vedi paragrafo successivo).
2. live imaging
- Avviare il controllo ambientale del microscopio per ottenere una stabile 37 ° C, 5% CO2 e un'atmosfera umida.
Nota: Qui, un piccolo palco incubazione superiore è stato utilizzato botola che impostazioni consentite stabile all'interno di circa 15 min più grandi incubatori bisogno di più tempo per raggiungere condizioni stabili. - Difficoltà tutte le impostazioni di acquisizione al microscopio prima la sospensione cellulare viene applicata:
- Impostare l'intervallo di tempo di 30 s e la durata di 60-90 min. attivare la funzione di messa a fuoco automatica di auto-focus basata su hardware per ogni punto di tempo (valore "1").
- Regolare l'esposizione della fotocamera e guadagno, nonché la potenza del laser per ogni canale. Alti livelli di guadagno, tempo di esposizione basso e laser a bassa potenza sono raccomandate per ridurre la foto-tossicità.
Nota: I dati qui presentati è stati acquisiti con l'esposizione di 200 ms, aumento di potenza del laser di livello 500 e 20% che equivale a intensità di eccitazione di 0,5 W/cm ² per 488 nm e 1 W/cm ² per 561 nm, rispettivamente. - Impostare lo z-stack per i canali del disco rotante a 10 µm con 0,4 µm spaziatura. Disattivare la z-stack per i canali TIRF. Impostare l'offset inferiore a "0", cioè il piano più basso sarà la posizione di messa a fuoco di messa a fuoco automatica dell'hardware.
- Attivare la funzione di multi-punto "posizioni di fase".
Nota: Fino a 3 posizioni possono essere registrate in un intervallo di tempo s 30.
- Trovare le perline fluorescenti con epi-fluorescente illuminazione all'oculare o sullo schermo del computer, quindi attivare un canale TIRF e impostare l'angolo di illuminazione su un valore che indica l'illuminazione TIRF. Attivare la messa a fuoco automatica premendo il pulsante sul pannello di microscopio e regolare la messa a fuoco con le ruote. Acquisire un dataset di 2 colori, cioè TIRF-488 e TIRF-561, per la registrazione successiva immagine basata su tallone (Vedi punto 3.1).
- Facoltativo: Per garantire illuminazione TIRF, aggiungere pochi microlitri della sospensione fluorescente Perle multicolor liberamente fluttuante (vedere punto 1.3.2.). Attivare il live view di un canale TIRF e aumentare l'angolo di illuminazione. Le perline non aderente scomparirà oltre l'angolo critico, garantendo una corretta illuminazione di TIRF8.
- Mescolare la sospensione cellulare ancora capovolgendo la provetta chiusa 2 - 3 volte e applicare 1 mL delle cellule al piatto imaging.
- Trovare rapidamente doppio-transfettati con basso livello epi-fluorescente illuminazione. Centro le cellule nell'anteprima live della telecamera utilizzando illuminazione in campo chiaro e segnare la posizione. Trovare un altro 1-2 punti di interesse e salvarli all'elenco delle posizioni.
Nota: All'inizio, le cellule facilmente possono staccare a causa di movimento scenico, quindi impostare 4-5 posizioni e ricontrollare tutto prima di iniziare acquisizione immagine. In seguito, scartare 1-2 posizioni. - Avvia acquisizione dati cliccando sul pulsante "Sequenza".
3. post-elaborazione in ImageJ
- Al fine di generare un hyperstack senza registrazione in FIJI15, una macro denominata "SD-TIRF_helper" è stato scritto che può essere applicato ai set di dati di 2-4 canali SD-TIRF timelapse. Salvare il file "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" in il FIJI sotto-cartella "macro" ed eseguire la macro facendo clic sul comando di menu "Plugins > macro > Esegui...".
- Se i canali di colore bisogno di correzione di registrazione, selezionare l'opzione e creare un nuovo riferimento di registrazione basato su tallone (file di punto di riferimento) o utilizzare un file esistente che è stato creato prima.
Nota: Il turboreg plugin16 si applicherà a fluorescenza perline immagini di riferimento. Installare il plugin nel software di FIJI secondo linee guida generali per le installazioni di plugin. - Importare i dati con l'importatore di bio-formati e scegliere hyperstack come un'opzione di visualizzazione. Caricare il set di dati di immagine, selezionare la serie di SD nel primo passo e la serie TIRF nel secondo passaggio. FIJI visualizzerà i dati ordinati per posizione canale e fase, cioè normalmente tutti i canali SD e tutti i canali di TIRF presentarsi come un hyperstack per ogni posizione di fase che è stato selezionato.
Nota: Importazione di dati è possibile da vari tipi di file, ad esempio i file dipendenti dalla piattaforma o TIFF-serie tipi come *. ND. Il tipo di file non può essere riconosciuto solo se non è stato esportato dal software di acquisizione come indipendente, senza compressione formato TIFF. - Applicare la correzione di registrazione ai rispettivi canali caricando il file pre-determinati punti di riferimento.
- Selezionare la tabella di look-up di colore desiderato (LUT) per ogni canale SD - e TIRF e unirli in un hyperstack singolo, multi-dimensionale.
Nota: Durante l'elaborazione dei canali TIRF, un numero di aerei-z con zero valori di intensità vengono aggiunti in cima il piano di fondo che corrisponde con il numero di aerei-z nel dataset SD. Questo passaggio è importante per la visualizzazione della hyperstack finale. Questa metodologia è corretta, poiché la profondità dell'illuminazione TIRF (meno di 200nm7) è minore della dimensione z-passo dello stack SD (400 nm).
- Se i canali di colore bisogno di correzione di registrazione, selezionare l'opzione e creare un nuovo riferimento di registrazione basato su tallone (file di punto di riferimento) o utilizzare un file esistente che è stato creato prima.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Al fine di mostrare il potenziale di formazione immagine SD-TIRF, che un'analisi è stata sviluppata che dovrebbe rivelare l'organizzazione spazio-temporale dei complessi di adesione cellula-matrice e loro interazione con il citoscheletro durante l'adesione cellulare. Di conseguenza, aderente HeLa o, in alternativa, NIH3T3 cellule transfected con YFP-vinculina e RFP-Lifeact per 18-24 h, tripsinizzate e seminate su piatti di fondo di vetro rivestite di fibronectina. Queste linee cellulari sono stati scelti per loro citoscheletro pronunciata e maggiore robustezza in esperimenti dal vivo di imaging che si oppose a, ad esempio, le cellule primarie. Quelli non potrebbe resistere a imaging in condizioni molto sensibili, come sono dopo il trattamento di tripsina. Al microscopio, YFP/RFP-esprimendo le cellule sono state selezionate e il processo di adesione osservata durante un 60min time-lapse (Figura 2 e film 1 e 2). Raramente e non chiaramente questo test specifico è stato descritto nella letteratura17,18. Inoltre, formazione di aderenze è stato studiato principalmente in ad esempio la migrazione di cellule19,20. Così, abbiamo bisogno di adattare questa metodologia (linea cellulare, rivestimento, medium, composizione) al fine di svolgere gli esperimenti descritti in questa carta.
Come previsto, le cellule erano circolari all'inizio e solo debolmente aderente, mentre protrusioni di membrana erano percepisce l'ambiente e facendo contatto con il substrato. Contatti cellula-matrice rafforzato rapidamente alla costituzione di una cosiddetta aderenze nascente20,21 (Figura 2A, canale TIRF-488, tempo punti 0-4,5 min). Questi ultimi sono strutture punto-come, vinculina positivo sul lato ventrale della cella. Le strutture erano chiaramente visibili nelle immagini TIRF. All'inizio della formazione di aderenze, l'actina è stato distribuito in modo uniforme nella cella e non hanno localizzato a questi primi complessi (Figura 2A, canale SD-561). Nel corso del tempo, complessi di adesione allargata e maturato per adesioni focali (Figura 2). Queste strutture allungate erano principalmente evidente alla periferia della cellula (figure 2A + B) ed è derivato da forze che erano esercitate dalle fibre di acto-miosina. Queste fibre ha iniziato a collegare i complessi di adesione, quindi li tira verso il centro della cellula e indurre il rafforzamento delle adesioni cellula-matrice, così come l'accorpamento di fibre di actina21. A quanto pare, la cella appiattita anche a seguito di formazione del reticolo di actina (Figura 2A, vista XZ). SD-imaging provato di essere il metodo di scelta qui, dato che permetteva la visualizzazione di questo processo con l'alta sensibilità, risoluzione spaziale e da una prospettiva completa. In un precedente rapporto17, TIRF da solo potrebbe lasciare solo speculare circa l'origine delle adesioni periferiche, mentre SD-TIRF formazione immagine ha rivelato chiaramente la relativa associazione con filopodi (Figura 2B, tempo punto 17 min, punta di freccia bianca). Infatti, le fibre di actina emergenti centripeto da adesioni focali divennero visibile dopo 27 min (Figura 2B, freccia gialla).
Tuttavia, le impostazioni di acquisizione di questi esperimenti, cioè velocità di acquisizione, aumento di intensità e rilevatore di eccitazione, devono essere valutati con attenzione. L'intervallo di 30 s/timepoint, abilitazione multi punto di acquisizione, sembra essere l'ideale, mentre l'intensità di radiazione del laser di eccitazione (tra 0,5-1 W/cm ²) deve essere presa in considerazione critica. Figura 2D consente di visualizzare una cella in una posizione diversa nello stesso esperimento che Impossibile collegare al substrato. Potrebbe essere possibile che effetti fototossici interessati alla biologia della cellula qui, che infine ha provocato la membrana spumeggiante dopo circa 60 minuti, probabilmente simile ad apoptosi (2 film). Questo ha reso nuovamente cancellare celle come sensibili possa reagire a fototossicità e che è importante trovare in che un buon equilibrio tra la quantità di luce messo e le informazioni prese. Riducendo la potenza del laser, il numero di immagini in uno z-stack o aumentando il guadagno potrebbe essere la giusta strategia per la riduzione di fototossicità. Tutte queste impostazioni, tuttavia, devono essere regolate ad un livello che permette ancora di ottenere sufficiente risoluzione e rapporto segnale-rumore, che permette di estrarre informazioni quantitative dal lasso di tempo registrato.
Figura 1: disegno del setup SD-TIRF schematico. R. modalità di imaging di SD: le 6 linee laser diversi (405/445/488/515/561/640nm, verde linee) sono accoppiate in unità di scansione confocale (CSU), passando per la SD (posizione 'IN') e un cubo di filtro vuoto nel corpo del microscopio (MIC). L'emissione di fluorescenza dall'esemplare (SPEC) è proiettata attraverso i forellini della SD e Spalato da diversi specchi dicroici, ad es. per acquisizione simultanea verde/rosso o giallo/ciano, su due diverse telecamere di EM-CCD (C1 e C2). Filtri di fluorescenza sono collocati davanti alle telecamere (non mostrate). B. modalità di imaging TIRF: le linee laser sono accoppiate nello scanner TIRF (TIRF). Un divisore di fascio multi-linea in MIC dirige il fascio alla provetta e l'emissione di luce bypassa la SD ('OUT') per la trasmissione ingrandita. Fluorescenza viene rilevato dalle telecamere della stesse ed emissione filtri descritto in A. Questa figura è stata modificata da Zobiak et al. 7 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: risultati rappresentativi della formazione di diffusione e l'adesione delle cellule usando la microscopia SD-TIRF. R. doppio-transfettate HeLa delle cellule che esprimono RFP-Lifeact (canale rosso, SD-561) e YFP-vinculina (canale verde, TIRF-488) erano lamelle di vetro rivestite di fibronectina tripsinizzate e ri-seminato su. Formazione di aderenze diventa facilmente visibili, partendo con piccole aderenze nascente (punti positivi vinculina) 0 minuti che si sviluppano in più grandi adesioni focali dopo circa 5 minuti. L'actina corticale è evidente dopo circa 10 minuti e si estende alla periferia delle cellule (vedere fotogrammi al minuto 12 e 24,5). B. la vista ingrandita della regione "in box" in un (telaio a 45 minuti) raffigura la diffusione delle cellule e la transizione da aderenze nascente a focale così come aderenze filopodi-collegata (freccia bianca) e formazione della fibra lo stress (Vedi telaio a 27 minuti, freccia gialla). C. Kymograph della linea gialla tratteggiata disegnata a. D. (Foto-) Effetti tossici sulle cellule o altrimenti malsano possono far loro non riescono a collegare al substrato. Condizioni di imaging devono essere valutati criticamente al fine di escludere la fototossicità. Barra della scala = 5 µm (nella A e D) e 2 µm (in B e C). Le vedute XZ in A e D sono le proiezioni ortogonali estratte da linee bianche tratteggiate disegnate in esso (inferiore = substrato). Immagini erano linearmente contrapporre-aumentata e mediana-filtrata con un 3x3 kernel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: 3D-ricostruzione della sequenza timelapse in Figura 2A. La sequenza di immagini è stato eseguito il rendering con 3D software di imaging. Durata: velocità di acquisizione min. 42,5: 2 pile di SD-TIRF bicanale al minuto (56 frames in totale) sono stati acquisiti. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Movie 2: il film della sequenza timelapse in fig. 2 C. Durata: velocità di acquisizione 60 min.: 2 pile di SD-TIRF bicanale al minuto (56 frames in totale) sono stati acquisiti. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In questa carta è stata presentata la prima implementazione di successo di SD e TIRF microscopia in una configurazione adatta per l'esecuzione di esperimenti imaging di cellule vive, cioè i tassi di acquisizione alta quali 2 serie di SD-TIRF immagini al minuto a 3 diversi stadi posizioni, corrispondenti a un totale di 168 fotogrammi (circa 3 fotogrammi al secondo), sono state acquisite. I microscopi di SD-TIRF pochi che erano precedentemente descritto12,13, soprattutto mancanza di imaging sufficientemente alta velocità di seguire processi cellulari in 3D in cui una risoluzione temporale di meno di 2 s per serie di immagini è spesso necessario. L'installazione presentata può raggiungere tassi di imaging fino a 0,78 serie di immagini al secondo e tassi di 3.5 s per pila grande immagine in esperimenti dal vivo d'istruttore vescicola 3D dinamiche sono state dimostrate7. Inoltre, microscopi di SD-TIRF precedente avevano un solo rivelatore per le modalità, riducendo ulteriormente la velocità per acquisizioni multicanale di imaging. Tecnicamente, in quei sistemi che poteva essere attuata una configurazione doppia visualizzazione che consente inoltre acquisizione simultanea a due colori con una singola telecamera. Questo, tuttavia, avrebbe permesso la formazione immagine del solo la metà del campo visivo. Altri metodi per produrre set di dati multidimensionali con alta risoluzione spazio-temporale come widefield imaging combinato con deconvoluzione o microscopia 3D Super-risoluzione, cioè 3D SIM o lattice foglio leggero microscopia22, 23, potrebbe essere una valida alternativa. Tuttavia, acquisizione di immagini basata su deconvoluzione può facilmente introdurre artefatti dell'immagine in acquisizioni di basso rapporto segnale-rumore (come è spesso il caso durante il live applicazioni di imaging), e super-risoluzione 3D immagini dal vivo è ancora un tecnicamente elaborativi e compito impegnativo. Nella realizzazione di un avanzato SD-TIRF installazione7presentata, approfittò di un'unità di SD che consente di spostare il doppio-disco dentro e fuori il percorso di rilevamento. Questa configurazione offre due vantaggi principali: in primo luogo, le due fotocamere stesse possono essere utilizzate per rilevare la SD e TIRF segnale, che si traduce in una sovrapposizione di alta precisione di questi due canali. In secondo luogo, i forellini del disco rotante non bloccano qualsiasi emissione di luce quando si opera in modalità di acquisizione di TIRF (per maggiori dettagli, Vedi Figura 1B), aumentando così l'efficienza di raccolta importante per l'imaging dal vivo ad alta sensibilità. Quindi, questa configurazione ottica è favorevole per l'implementazione di qualsiasi tipo di microscopia TIRF (ad es. angolo variabile o fisso di illuminazione) in SD-microscopi esistenti che consentono di bypassare l'unità SD. Inoltre, lo scanner TIRF usato può essere eseguito in modalità cosiddetto time-sharing, dove possono registrare contemporaneamente due canali di TIRF (come mostrato in Zobiak et al. 7), eccesso di velocità più in alto l'acquisizione di dati multi-canali.
Uno dei maggiori vantaggi di impiegare TIRF è che, con questa metodologia, è possibile localizzare con la massima precisione il segnale proveniente dalla membrana cellulare durante un'esperimento di imaging delle cellule di vita. Infatti, mentre una metodologia come SIM fornisce una migliore z-sezionamento e così migliore isolamento della membrana cellulare in fissa i campioni, in live cell imaging esperimenti l'esponenziale aumento/riduzione del segnale di fluorescenza da organelli si avvicina / uscire dall'interfaccia di TIRF ha permesso la localizzazione più specifico e preciso della membrana cellulare. La precisione di localizzazione, anche se non ancora quantificato, promette di essere molte pieghe più piccoli di 150-200 nm, cioè l'intervallo spaziale del campo degli evanescence.
Attualmente una limitazione del metodo è il tempo necessario per rimuovere l'unità disco di filatura dal percorso della luce ed iniziare l'acquisizione di TIRF, cioè 0,5 s. Questo ritardo limita l'intervallo di tempo minimo tra due acquisizioni consecutivi. Tecnicamente, dovrebbe essere possibile ridurre questo ritardo attraverso bypassando il disco con per esempio galvo-specchi e diminuendo così l'acquisizione complessiva per ciclo di SD-TIRF. Inoltre, le telecamere di generazione più recente potrebbero consentire tempi di esposizione ridotti all'alto rapporto segnale-rumore. Quindi, le prestazioni complessive del programma di installazione possono essere migliorata ancora relativo aggiornando i componenti hardware. Dal punto di vista imaging, tuttavia, ci sono molti altri modi per ridurre al minimo il tempo di acquisizione (in ordine decrescente): evitare posizioni multiple, ridurre l'altezza dello stack z, aumentare la z-spaziatura, ridurre al minimo il tempo di esposizione (aumento di guadagno e possibilmente utilizzare binning), accorciare la distanza tra le posizioni di acquisizione, attivare l'auto-messa a fuoco soltanto ogni punto di tempo n-esimo (n > 1). Nonostante i limiti effettivi, se tutti questi parametri vengono valutati attentamente, è possibile utilizzare SD-TIRF imaging per il rilevamento e localizzazione cellulare vescicole, in rapido movimento, come presentato in Zobiak et al. 7.
Inoltre, in questa carta un protocollo che descrive l'acquisizione è stata presentata la routine di un singolo canale SD-TIRF dataset. Utilizzando la macro fornita, dati grezzi possono essere esportati in un singolo file TIFF contenente tutti i canali SD - e TIRF. Registratura delle immagini è di per sé non necessarie; Tuttavia, è importante che entrambe le fotocamere sono perfettamente allineate rispetto a altro. Restanti turni pixel (traslazione e rotazione) possono essere rilevati e corretti all'interno della macro fornita. L'algoritmo di correzione si avvale di un'immagine di riferimento multi-canale di perline fluorescenti che deve essere registrato poco prima di iniziare l'esperimento. Nel file risultante, l'aereo TIRF è impostato al livello più basso, seguito da un numero di zero aerei di intensità che stanno abbinando la dimensionalità del SD-canale. Pertanto, è importante acquisire i dati, come descritto nel protocollo, dove l'aereo TIRF imaged somiglia l'estremità inferiore dello z-stack imposta per il canale SD.
Infine il sistema potrebbe essere potenzialmente esteso da un modulo SIM o recentemente introdotta multi-angolo TIRFM24,25 ad aumentare ulteriormente la risoluzione spaziale. Tuttavia, aumentare la risoluzione spaziale può avvenire, secondo l'attuale stato dell'arte, solo a costo di una velocità più lenta imaging. Per tutti la cella live imaging esperimenti in cui è cruciale localizzare strutture alla membrana del plasma, seppur mantenendo alta risoluzione spaziale del restante volume cellulare, l'installazione di SD-TIRF descritto qui è un facile da integrare, prontamente disponibile soluzione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo enormemente la comunità scientifica della University Medical Center Hamburg-Eppendorf per averci sostenuto con campioni per la valutazione. Vale a dire, noi ringraziamo Sabine Windhorst per cellule NIH3T3, Andrea Mordhorst per YFP-vinculina e Maren Rudolph per RFP-Lifeact.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
