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Cancer Research

利用哺乳动物双杂交法检测雌激素受体α的配联域二维化活性

doi: 10.3791/58758 Published: December 19, 2018

Summary

我们提出了一种方法来分析 4-羟基他莫西芬依赖雌激素受体α配体结合域二聚化活性的哺乳动物双杂交法。

Abstract

雌激素受体α (erα) 是一种雌激素配体依赖性转录调节剂。在物种中, erα蛋白的序列高度保守。人们认为人和小鼠的 erα功能是相同的。我们证明了差异 4-羟基他莫西芬 (4oht) 对小鼠和人 erα配体结合域 (lbd) 二聚化活性的影响, 使用哺乳动物双杂交 (m2h) 法。m2h 分析可以利用两个蛋白质表达质粒 (gal4 dna 结合域 [dbd] 融合 lbd 和 vp16 转活化域 [vp16ad] 融合 lbd) 的转染, 证明 lbd 在哺乳动物细胞中的共读活性的有效性。gal4 反应元件 (gal4re) 熔融荧光素酶报告质粒。当 gal4dbd 融合 lbd 和 vp16ad 融合 lbd 在细胞中产生二聚体时, 这种蛋白质复合体与 gal4re 结合, 然后通过 vp16ad 依赖转录活性激活荧光酶基因表达。用小鼠 erαlbd 融合蛋白表达质粒转染的 hepg2 细胞的 4 oh 介导的荧光素酶激活率高于人 erαlbd 融合蛋白表达质粒转染细胞。结果表明, 4oht 依赖性小鼠 erαlbd 共读活性高于人 erαlbd。一般来说, m2h 分析的使用并不理想于评估核受体 lbd 二聚化活性, 因为抗性配体增强了 lbd 活性的基础水平, 并阻碍了 lbd 二聚体活性的检测。我们发现4oht 不能增强 erα lbd 的基础活性。这是能够确定和检测与4oht 相关的 lbd 二聚化活性的关键因素, 以便成功地使用 m2h 检测。基于 erα lbd 的 m2h 检测可用于研究选择性雌激素受体调节剂 (4oht) 在不同哺乳动物细胞类型中的部分激动剂活性。

Introduction

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雌激素受体α (erα) 是一种雌激素配体依赖性转录调节剂。erα的氨基酸序列在物种中高度保守。由于人类和小鼠 erα的同源性较高, 这些受体的功能被认为是相同的, 而这些物种中雌激素物质 (他莫西芬) 的差异活性是由该物种在化学代谢, 而不是由 erα的结构差异。erα具有高度保守的域结构, 这些结构在核受体 (nr) 超家族中很常见, 被指定为 a 到 f 域。e 域或配体结合域 (lbd) 包括配体结合口袋和转录激活功能 2, 名为 af-2。f 域紧邻 e 域进行本地化, 是 nr 中变化最大的域。即使在人和小鼠 erα之间, f 域的同源性也明显低于其他域1。erα的配体 lbd 增强了 erα蛋白的同质化, 直接结合特定的雌激素反应 dna 元素, 以调节木质依赖性基因转录 (erα的经典作用)。晶体学研究揭示了螺旋 12 (af-2 核域) 与雌二醇 (e2) 或 4-羟基-他莫西芬 (4oht) 结合 lbd 二聚体2,3的差异定位。erαf 域 (45个氨基酸) 直接连接螺旋12。然而, 没有关于这种扩展45氨基酸 (f 域) 从螺旋12对 erα lbd 二聚化的影响的信息。在这项研究中, 我们证明了 f 域的贡献, 特定于物种依赖的 eα lbd 同质化使用哺乳动物双杂交 (m2h) 的分析。

m2h 检测是一种证明哺乳动物细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的方法, 它引入了三种不同的质粒 dna: 两种蛋白表达质粒, 表达了 gal4 dna 结合域 (dbd) 融合 erαlld 和 vp16ad 融合 erαldd, 和gal4re 熔融荧光素酶表达报告质粒。当 gal4dbd 融合 erαlbd 和 vp16ad 融合 erα lbd 在细胞中相互作用 (使二聚体) 时, 这种蛋白质复合体与 gal4re 结合, 然后通过 vp16ad 相关的转活化功能激活荧光酶基因表达。lbd 共氧化水平可以通过荧光素酶活性来评价。

酵母双杂交 (y2h) 检测是一种基于与宿主环境相同的原理的替代方法。以前使用 y2h 系统的报告表明, f-域截断人 erα lbd 增加了 e2 依赖协同剂的招募, 结论是 f 域阻止 e2 介导转录4。这一结果与其他报告不一致, 这些报告表明 f-域截断人 erα在哺乳动物细胞5,6中的衰减转录活性。最近, 我们的研究表明, 利用 m2h 系统, 人类 erαlbd 的 e2 依赖共激活剂的招募活性在哺乳动物细胞中的 f 域截断降低, 并与转录活性1一致。这些观察表明, 蛋白质-蛋白质相互作用的生理作用在细胞类型特定的方式和背景不同。m2h 检测可以在用于确定转录活性的同一细胞环境中显示蛋白质-蛋白质相互作用。与 M2H 或其他体外蛋白质-蛋白质相互作用分析相比, 这提供了 m2h 分析的优势。

关于选择性雌激素受体调节剂 (serm) (例如, 4oht) 调节 erα介导的转录的部分激动剂活性的分子机制仍存在疑问。基于 erα lbd 的 m2h 检测可用于研究各种哺乳动物细胞类型中 serm 的部分激动剂活性的机制。

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Protocol

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1. 哺乳动物双杂交法质粒的制备

  1. 使用以下质粒: pg5-luc、pbind-erαef 和 apst-erαef。
    注: 这些质粒可根据要求从作者处获得, 并通过滤纸发送。pg5-luc 是一种带记者的质粒, 它包含与荧光素酶表达单元融合的 gal4 反应元素的5次重复 (图 1a)。pbind-erαef 是 gal4dbd-熔融 erα lbd 蛋白的蛋白表达质粒。pbind-erαef 包含一个雷尼利亚荧光素酶表达单位, 用于使转染效率正常化 (图 1b)。pact-erαef 是 vp16ad-融合 erα lbd 蛋白的蛋白表达质粒 (图 1c)。从质粒中表达的蛋白质结构图如图 2所示。
  2. 准备质粒 dna。
    1. 用干净的剪刀将塑料装载区域从纸张上剪下, 放入 1.5 ml 管中。戴上手套, 用干净的推子拿起装有等离子体的纸。加入100μl 的 tris-edta (te) 缓冲液 (ph 8.0) 和涡旋。
    2. 从步骤1.2.1 到合格的大肠杆菌细胞 (见材料表), 加入 1μl 的质粒 dna 溶液, 并将管放在冰上15分钟。
    3. 热休克等离子体添加的有能力细胞;在42°c 的水浴中孵育管 30秒, 然后在冰上保持2分钟。
    4. 在试管中加入250μl 的超最佳肉汤, 并在管道中进行分解代谢抑制 (soc) 介质 (室温), 并在37°c 下晃动30分钟培养。
    5. 将培养的大肠杆菌板100μl 放在预热的尿液 (lb) 板上, 并在37°c 下培养。
    6. 从盘子中取出一个菌落, 加入一个14毫升的管中, 其中含有2毫升的了不起的肉汤 (tb), 含有100μml 的氨匹西林。在37°c 时晃动直到介质被微弱地笼罩的培养。
    7. 从步骤1.2.6 将培养的培养基添加1毫升, 加入装有50毫升结核病的高压灭菌250毫升玻璃瓶, 并含有100μgml 氨匹西林。在37°c 下晃动20-24小时的培养。
    8. 使用摇桶转子, 在室温下将培养的大肠杆菌转移到50毫升锥形管和离心机 , 温度为 3450 x g, 时间为30分钟。丢弃介质。将大肠杆菌颗粒保存在-80°c。
    9. 大肠杆菌颗粒中加入3毫升细胞再悬浮液 (见材料表), 并将其完全悬浮。加入3毫升的细胞裂解溶液 (见材料表), 将管轻轻搅拌 10倍, 并将其保持在冰上 5分钟 (准时保持时间)。加入6毫升的中和溶液 (见材料表), 将管材稳定地与攻丝混合, 然后在冰上保持10分钟。
    10. 使用摇桶转子, 在4°c 下以 3450 x g的温度离心管30分钟。将含有 dna 的溶液转移到新的50毫升锥形管, 并添加10毫升的 dna 纯化树脂 (见材料表)。轻轻悬挂树脂。
    11. 用摇桶转子以 625 x 克的速度离心管1分钟。丢弃溶液并将树脂保持在底部。
    12. 在50毫升锥形管中加入15毫升柱状洗涤液 (80 mm 醋酸钾、8.5 mm Tris-HCl [ph 7.5]、40μm edta 和55% 乙醇), 轻轻摇匀以树脂。重复步骤1.2.11。
      注: 柱状洗涤液必须使用经过二乙基碳酸氢盐 (depc) 处理的水或无核酸水制备。
    13. 在50毫升锥形管中加入5毫升柱状洗涤液, 用5毫升管悬浮树脂。将树脂涂在真空歧管上设置的柱 (见材料表) 上。将色谱柱吸尘, 直到树脂干燥。在柱和真空中加入6毫升柱状洗涤液。
    14. 一旦树脂在视觉上干燥, 将储层从柱中分离出来。将色谱柱 (树脂) 的底部转移到 1.5 ml 管中。用微型离心机将树脂以最大速度离心2分钟。
    15. 将色谱柱 (树脂) 的底部转移到新的 1.5 ml 管中。在柱中加入300μl 的无核酸酶水, 并等待整个树脂被浸泡。
    16. 以最大速度离心柱 1分钟, 收集含有 dna 的质粒溶液 (200-250μl)。
    17. 用酚氯仿 (1:1) 处理含有 dna 的溶液, 然后用氯仿处理, 如下所示。
      1. 在含 dna 的溶液 (200-250μl) 中加入相同体积的苯酚-氯仿 (1), 用微型离心机以最大速度摇匀和离心机2分钟。收集上层 (含 dna 溶液), 并将其添加到一个新的 1.5 ml 管。重复此步骤1x。
      2. 将相同体积的氯仿添加到含有 dna 的溶液 (200-250μl) 中, 以最大速度摇匀, 离心机1分钟收集上层 (含 dna 溶液), 并将其添加到 1.5 ml 管中。
        注: 内毒素 (脂多糖) 在某些细胞中诱导细胞信号。为了避免这种不可预测的影响, 建议采取步骤 1.2.17, 这样可以减少内毒素污染。
    18. 利用乙醇沉淀技术沉淀质粒 dna, 如下所示。
      1. 在含 dna 溶液中加入 3 m 醋酸钠 (ph 5.5) 和2倍的3m 醋酸钠体积, 即100% 乙醇。例如, 在 dna 溶液的250μl 中加入27.8μl 的 3 m 醋酸钠和278μl 的100% 乙醇 (最终体积为 555.8μl)。
      2. 将溶液保持在-80°c, 至少20分钟。在4°c 下以最大速度离心20分钟。丢弃溶液并保留颗粒。加入200μl 的75% 乙醇, 并冲洗管内。在4°c 下离心 20分钟, 丢弃溶液, 并保留颗粒。使用真空集中器擦干 dna 颗粒。
      3. 在管中加入 100-250μl te 缓冲液 (ph 值 8.0)。溶解 dna 颗粒, 并使用分光光度计检查 dna 浓度的波长为260纳米。将 dna 浓度保持在 0.5 mg/ml 左右。

2. 哺乳动物双杂交法

  1. 维护单元格。
    1. 用750毫升、175厘米 2组织培养瓶培养人类肝癌 hepg2 细胞, 用无酚最低必需培养基 (mL) 补充10% 的胎牛血清 (fbs; 热灭活)、2mm l-谷氨酰胺和1%青霉素链霉素溶液 (抗生素) 用于维持细胞。
    2. 在5% 的 co2 补充, 37°c 的孵化器培养细胞, 直到细胞约90% 融合.
      注: 为了减少雌激素的背景活性, 所有 m2h 实验都应使用无酚的无红色介质。这一步骤应在清洁的工作台/生物安全柜内进行。细胞应按照一般哺乳动物细胞培养协议7进行维护。
  2. 准备转染的细胞。
    注: 应在清洁工作台/生物安全柜内执行以下程序步骤。在这一步中, 细胞每次都在5% 的 co2补充、37°c 的孵化器中培养。
    1. 将90% 的融合细胞重新装上24孔板;用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 冲洗细胞1x。
    2. 在培养瓶中加入7毫升0.05% 的胰蛋白酶 edta 溶液, 浸泡细胞 1-2分钟, 同时在室温下将培养瓶保持在干净的长凳上。取出部分胰蛋白酶 edta 溶液, 并将溶液的 1-2 ml 留在培养瓶中。在孵化器中孵育培养瓶1-2分钟。
    3. 在烧瓶底部打分离细胞, 并在显微镜下检查细胞。
      注: 如果细胞仍连接到烧瓶上, 再孵育 1-2分钟, 然后重复步骤2.2.3。
    4. 将细胞悬浮在无酚红素 mM 中, 辅以10% 的含焦 fbs (热灭活)、2mm l-谷氨酰胺和1% 的青霉素链霉素溶液。
      注: 必须使用带菌剥离的 fbs 来减少血清中源性雌激素的影响。
    5. 在 1.2 x 10 5 细胞的密度下, 在24孔板中计数细胞数量和种子细胞。为每个数据点分配三口井 (三式三份)。
    6. 培养细胞一夜之间。继续2.4.1 步骤。
  3. 准备用于转染的 dna 混合物。
    注: 以下质粒 dna 在一口井中转染: 100 ng pg5-luc 报告质粒、50个 g4dbd 融合蛋白表达质粒 (pbind) 和 50 ng vp16ad 融合蛋白 (pact) 表达质粒。
    1. 要分析配体依赖性 erα lbd 二聚化活性, 请准备以下组合 (图 3)。组合 (i): pg5-luc + pbind-erαef + pact, 和 pg5-luc + pbind-merαef + pact。组合 (二): pg5-luc + pbind-erαef + pact-erαef, 和 pg5-luc + pcind-merαef + pact-erαef。组合 (三): pg5-luc + pG5 + pact-erαef, 和 pg5-luc + pG5 + acct-merαef。
      注: 组合 (i) 分别代表人 erα lbd 和小鼠 erα lbd 的基本实验水平。如果结果显示单独使用配体的水平非常高, 这种方法与该配体一起使用是不可行的 (例如, 二乙基雌石 [des])。组合 (ii) 分别代表二聚体人 erα lbd 和二聚体小鼠 erα lbd 的水平。组合 (三) 表示负对照;仅当第一次执行实验以评估系统的背景级别时, 才使用此集。
    2. 在混合之前, 根据转染井的数量计算所需的 dna 总量。对于在三联和五个数据点进行的实验, 将以下质粒 dna 混合在两个1.5 μl 管中, 用于组合 (i) 和 (ii): pg5-luc, 5 (数据点) x 3 (井) x 100 ng = 1, 500 纳克 (15μl);pbind-merαef, 5 (数据点) x 3 (井) x 50 纳克 = 750 纳克 (7.5μl);pact (组合 i) 或 pact-merαef (组合 ii)、5 (数据点) x 3 (井) x 50 纳克 = 750 纳克 (7.5 μl)。
      注: 每个质粒 dna 溶液的浓度为0.1μμμl。
    3. 利用乙醇沉淀技术沉淀 dna 混合物。在 dna 混合物中加入 3 m 醋酸钠 (ph 5.5) 和2倍的3m 醋酸钠体积, 即100% 乙醇。然后, 旋涡管。
      注: 例如, 在步骤2.3.2 中举例说明的30μl 质粒 dna 混合物中加入3.4 微米的 3 m 醋酸钠, 并加入34μl 的100% 乙醇。此步骤有助于保持不变的转染条件, 并且不需要在生物安全柜中执行此步骤。
    4. 将混合物保持在-20°c 过夜。在4°c 下, 以最大速度离心20分钟。丢弃溶液 (颗粒是不可见的)。在试管中加入120μl 的75% 乙醇;然后, 冲洗管的内部。在4°c 下离心20分钟。丢弃溶液, 使用真空集中器将 dna 混合物干燥30分钟。
  4. 执行转染。
    注: 应在干净的长凳或生物安全柜中执行以下步骤。
    1. 第二天早上, 用 0.5 ml 的 pbs (室温) 冲洗24孔板 (从步骤 2.2.6) 2 x 中播种的细胞。
    2. 在每口井 (0.5 ml/井) 中加入温热 (37°c) 新鲜的无红的 mM, 再加上10% 的带木炭的 fbs (热灭活) 和 2 mm l-谷氨酰胺, 而不添加抗生素。将细胞保存在5% 的二氧化碳补充, 37°c 的孵化器中。
    3. 悬浮在 dulbecco 改性的 eagle 培养基 (dmem) 中的干质粒 dna 混合物 (从步骤 2.3.4) (无血清, 不含苯酚红色, 无谷氨酰胺; 13μl/well)。根据转染井的数量计算 dmem 的数量。
      注:15 口井用于组合 (i) x 13μl = 195μl, 15 口井用于组合 (ii) x 13μl = 195μl。
    4. 将转染试剂 (见材料表; 1.5μl/well) 悬浮在另一个 1.5 ml 管中的 dmem (12.5μl·well) 中。从转染井的数量计算转染试剂和 dmem 的数量。
      注:30 [15 口井用于组合 (i) 和15口组合 (ii)] x 1.5μl 转染试剂 + 30 x 125μl 的 dmem = 420μl。
    5. 在每个管中添加相同数量的转染试剂介质 (从步骤 2.4.4) (从步骤 2.4.3)。在室温下将管材孵化5-10分钟。
      注: 转染试剂介质 + 195μl 组合 (i) dna 混合物 = 395μl, 转染试剂介质 + 195μl 组合 (ii) dna 混合物 = 395μl。在组合 (i) 和 (ii) 的试管中添加等量的转染试剂介质是很重要的。在这一步中, 没有必要用完介质。
    6. 将组合混合物 (从步骤 2.4.5) 添加到24井板的每口井 (25μl·well) 中 (从步骤 2.4.2), 并在 5% co 2-补充的37°c 孵化器中孵育细胞6小时。
    7. 从24孔板上取出转染介质。加入温热 (37°c) 新鲜的无红蛋白 mM, 辅以10% 的含焦 fbs (热失活)、2 mm l-谷氨酰胺、1% 的青霉素链氨酸溶液和配体 (悬浮在乙醇中) (0.5 ml medium/well)。在 5% co 2 补充、37°c 孵化器中培养细胞 16-18小时.
  5. 收集样品。
    1. 用1毫升的 pbs 冲洗细胞, 然后加入100μl 的1x 被动裂解缓冲液 (见材料表)。
    2. 用涡流混合器大力摇晃24孔板, 使细胞分离。
    3. 用液氮将板材 (细胞裂解物) 冷冻 1x, 或在分析前将其保存在-80°c。在检测前, 用力摇晃振动台上的盘子, 直到它们处于室温。
      注: 此过程可防止不规则地出现不规则的荧光素酶活性值。
  6. 进行双荧光素酶检测。
    1. 为双荧光素酶检测系统准备试剂 (见材料表)。
      1. 为使荧光素酶分析底物 (las) 缓冲液中加入所有荧光素酶分析缓冲液, 并将其添加到玻璃棕色瓶中的荧光素酶分析基板中。将 las 缓冲区保存在-20°c。
        注: las 缓冲液在使用前应加热至室温。
      2. 为了使雷尼利亚荧光素酶底物 (rls) 缓冲液, 将雷尼拉荧光素酶底物和雷尼拉荧光素酶缓冲液混合在1:50 的比例下。为每次检测制作新鲜的 rls 缓冲液, 并使用黑色管或被锡油遮挡的管。计算 rls 缓冲区的数量, 使一个新的缓冲区。
        注: 使用前, rls 缓冲液应加热至室温。
    2. 在微板读取器中设置试剂。
      1. 用70% 乙醇清洗注塑生产线 2倍;然后, 用水清洗2倍的线路。
        注: 这对于防止干扰检测结果非常重要。
      2. 将 las 缓冲区设置为 p 型喷射器线 (第一次注入), 并将 rls 缓冲区设置为 m 型喷射器线 (第二次注入)。不要混合这些缓冲区。rls 缓冲抑制荧光素酶活性。
    3. 将10μl 采集的样品 (从步骤 2.5.3) 涂在96井白色塑料板上。
    4. 将以下设置应用于微板读取器。对于 p 型喷射器, 使用50μl 的体积, 2秒的延迟, 速度为50μls/。对于 m 型喷射器, 使用50μl 的体积, 延迟为 2秒, 速度为 50μlss. 将积分时间设置为 15秒. 将温度设置为25°c。
    5. 运行微板读取器。
    6. 使用数据采集程序记录荧光素酶活性值 (ipvalue) 和雷尼利亚荧光素酶活性 (imvalue) 的值 (见材料表)。
    7. 数据收集后清洗注入行 (请参阅步骤 2.6.2.1)。
  7. 执行数据分析。
    1. 使用规范化值 (ipvalue/imvalue) 进行数据分析。
    2. 将组合 (i) [pg5-luc + pbind-erαef + pact] 与车辆 (0 nm 配体) 的归一化值设置为 1, 用于计算基底水平和同读 erα lbd 水平。级别表示为 "相对活动"。

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Representative Results

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图 3显示了组合 (i) 和组合 (ii) 等离子体转染细胞中可能的响应方案。实验结果如图 4所示。组合 (i) (pg5-luc + pbind-merαef + pact) 的活性显示 10 nm e2 的刺激 (图 4a), 因为 erα lbd 包含配体依赖性的失活功能域 af-2。与 erα lbd 结合的农学体 (例如e2) 招募转录共动剂到 af-2 域。此事件导致转录激活, 而不与 vp16ad 融合 lbd 交互, 并由于非特异性背景的原因, 很难评估 lbd 的同质化活动 (图 3c)。通过 1 nm 和 10 nm e2 处理 (图 4 a) 观察到组合 (ii) (pg5-luc + pbind-mersaf + apstt-merαef) 的活性。如果能够找到适当的配体浓度来检测组合 (ii) 的活性, 而不激活组合 (i), 则可以确定与抗体依赖的 erα lbd 共读活性 (例如,条件为图 4a中的 1 nm e2)。因此, 使用 m2h 法检测激动介导的 erα lbd 同质化活性是很困难的。另一方面, (i) 与4oht 的组合活动与车辆控制 (0 nm) 水平相同 (图 4b)。这些结果表明, erα的 af-2 函数不是由4oht 激活的。因此, m2h 分析是分析与4oht 的 erα lbd 同质化活性的可行选择 (图 3b, 3e)。

小鼠 erαlbd 表达质粒 (pbind-merαef + apt-marαf) 与4oht 的组合所产生的活性明显高于人 erα lbd 表达质粒 (pbind-er-erαef + pact-herαef) 的组合 (图 5a, 5b)。结果表明, 小鼠 erα lbd 的4ot 依赖性均读活性比人 erα lbd 更有效。此外, 我们还利用人与人的手 f-域交换 erα lbd 表达质粒、merαehf (具有人 f 域的小鼠 erαe 域) 和 erα emf (具有小鼠 f 域的人 erα e 域) 分析了与4oht 相关的 lbd 同质化活性。merαehf 的同质化活性明显低于 merαef。与此形成对照的是, erα emf 的同质化活性明显高于 erαef (图 5c)。因此, 似乎 f 域对特定于物种的4oht 依赖 erα lbd 共读活性有影响。

这些结果表明, m2h 法检测到 4 oh 样配体 (如 serm) 的 erα lbd 二聚化活性。接下来, 我们展示了一种分析激动化学物质 erα lbd 共读活性的可能方法。使用单氨基-酸突变的 erα lbd (小鼠 erα-i362d) 时, m2h 法检测出 e2 和二乙基雌酚 (des) 的 erα lbd 二聚体活性。这种突变破坏了 erα lbd 8 的 e2 相关共激活剂招募活动.组合 (i) (pg5-luc + pbind-merd-mer-i362d + pact) 在我们分析的任何浓度下没有被 e2 或 des 激活 (图 6b), 这与 wt erα lbd (图 6a) 不同。des 的 erα-i362d 二聚化活性高于 e2 (图 6b)。该突变体可用于对激动性依赖 erα lbd 二聚化活性的比较研究;然而, 它需要进一步的分析和这个突变的 erα的生物功能的表征。

Figure 1
图 1: 用于 m2h 检测的质粒示意图.(a) 这个面板显示 pg5-luc, 记者质粒, 其中包含一个 gal4 反应元素 (gal4 re) 融合与荧光素酶编码基因。(b) 该面板显示 pbind-merαef, gal4dbd 融合 merαef 的蛋白表达质粒;雷尼拉荧光素酶的工作原理是使转染效率正常化。(c) 该面板显示 pact-merαef, 核定位信号 (nls) 的蛋白表达质粒-融合 vp16ad 融合 merαef。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 本实验中使用的 erαlbd 表达质粒图.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: m2h 检测方案.此图显示了组合 (i) 质粒 (左) 转染的细胞和组合 (ii) 质粒 (右) 转染的细胞的代表性状况。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 小鼠 erα lbd 的配体依赖性二聚化活性.(a) 该面板显示了与组合 (i) 质粒 (pg5-luc + pG5 + pbind-merer) 转染的细胞的荧光素酶活性α ef) 或组合 (ii) 质粒 (pg5-luc + apst-melαef + 双苯醚-梅尔α-ef), 有或没有 e2。(b) 该面板显示与组合 (i) 质粒或组合 (ii) 具有或不具有4oht 的质粒转染的细胞的荧光素酶活性。该活动表示为标准偏差 (sd) 的均值±。面板a的图形是根据以前公布的数据11重新创建的。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5* 小鼠和人 erα lbd 与4oht 的微分二聚化活性.(a) 该面板显示小鼠 erα lbd 表达质粒 (aptt-merαef + p) 联合转染的细胞的荧光素酶活性. 或人 erαlbd 表达质粒 (pact-erαef + pbind-er-erαef) 与或没有4oht。(b) 放大 a 面板的低活度, 以显示人 erα lbd 和实验基础水平 (pact + pbind-mer-α ef, pact + pbind-pbind-er-erαef) 的二聚化活性。(c) 该面板显示了用鼠尾流-域交换的 lbd 表达质粒转染的细胞的荧光素酶活性。erαehf 表示与人 f 域融合的小鼠 erαe 域。erα emf 表示与小鼠 f 域融合的人 erαe 域。该活动表示为平均值± sd。这些图形是根据以前发布的数据1重新创建的。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 使用 af-2 突变 erα lbd 检测激动介导的 erα lbd 二聚体活性。(a) 该面板显示了与组合 (i) 质粒 (pg5-luc + pG5 + pbind-merer) 转染的细胞的荧光素酶活性α ef) 或组合 (ii) 有或不具有配体的质粒 (pg5-luc + pact-melαef + 双苯双色谱 e);e2 (红色), des (紫色)。(b) 该面板显示了与组合 (i) 质粒 (pg5-luc + pact + pcidd-er-er-erα-i362d) 转染的细胞的荧光素酶活性) 或组合 (ii) 有或不具有配体的质粒 (pg5-luc + pact-merα-i362d + pbind-meld-erα-i362d);e2 (红色), des (紫色)。活动表示为平均值± sd. 请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

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在此, 我们描述了 m2h 检测的方案, 重点介绍了检测 erα lbd 共读活性的检测条件。一般来说, m2h 检测是不受欢迎的评估配体依赖 erα lbd 二聚化活性。这是由于 erα lbd 具有转录激活功能;在某些情况下, 其活性会干扰 m2h 测定的结果。然而, 正如我们在这里所证明的, m2h 分析可用于分析某些不激活 lbd af-2 转化功能的物质 (例如, 4oht, serm) 的 lbd 二聚体活性。为了减少 lbd (背景活动) 的内在活性, 我们从生产场中选择了含有 e2 的含氧带煤 fbs 的最低部分, 并采用了热灭活带木炭 fbs。这些因素对于使用 wt erα lbd 进行的 m2h 检测的成功和检测弱相互作用活性的研究都很重要。此外, 我们还显示了激动剂 (e2 和 des) 的 erα lbd 二聚化活性, 它使用 merα-i362d 突变体, 它破坏了 af-2 的激动剂依赖共激活剂的招募活动。这些结果表明, m2h 检测可为评价配体依赖性 erα lbd 二聚化活性提供更多的参考。

在 nr 研究领域, m2h 检测已被用于评估 nr lbd 9,10的配体相关共激活剂或协征分子招募活性。pbind 的质粒与辅因子的 nr 相互作用区域融合在一起, 用于此类实验, 而不是使用 pbind-erαef。本实验使用含有 nr 相互作用母题 (lxxll) 的短蛋白质元素, 而不是协同剂的一个较大的结构域。一种可能是较大的协同剂元素可以激活转录, 而无需招募 vp16ad 融合 lbd;可能会干扰 m2h 检测的结果或者, 该协议可用于分析各种物质与 erα的结合活性。例如, 这些细胞是用 pg5-luc、pbind 熔融 nr 相互作用的主题和 apst-erα质粒转染的, 然后用各种化学物质进行治疗, 如干扰内分泌的化学品或潜在的激素疗法。如果在本试验中, 荧光素酶活性增加, 则可以预测该化学物质应与 erα lbd 相互作用, 以招募 nr 相互作用的主题8

m2h 检测显示了哺乳动物细胞中蛋白质与蛋白质的相互作用。正如我们在导言中提到的, 在细胞类型特定的上下文中, 蛋白质-蛋白质相互作用的生理作用可能不同。m2h 检测可以提供蛋白质-蛋白质相互作用的结果, 在相同的细胞环境中用于其他实验, 如转录活性的分析。此外, 它还可以分析细胞信号调节器 (激酶抑制剂或激活剂) 与细胞中蛋白质-蛋白质相互作用有关的效果。与其他体外蛋白-蛋白质相互作用研究相比, 这是 m2h 检测的优势。

然而, 需要考虑的是, 通过 m2h 检测到蛋白质-蛋白质相互作用可能并不代表两种蛋白质之间的直接相互作用。换句话说, 有一种可能性是细胞因子的存在, 它允许两种蛋白质之间的联系。如果出现这种考虑, 则需要对体外蛋白-蛋白质相互作用研究进行评估, 例如 gst 融合蛋白下拉试验。此外, 最好检查 pbind-pact-质粒蛋白在细胞中的表达水平, 以评估检测系统的性能。特别是当无法检测到相互作用活动时, 蛋白质表达水平的信息有助于确定结果的原因。抗 gal4dbd 抗体和抗 vp16ad 抗体可用于西方印迹分析。

如果实验室有荧光素酶检测的实验设置, 可用于分析调节因子或调节因子的转录活性, 那么进行 m2h 检测是相当简单的。m2h 检测是转录调控研究的一种有利的添加剂方法。

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Disclosures

提交人没有什么可申报的。

Acknowledgments

作者感谢国家环境卫生科学研究所 (niehs) 的 sueyoshi 博士和 wang 博士对手稿的批判性解读, 并感谢坦纳·杰斐逊在视频中执行的程序。这项工作得到了 niehs 内部研究司的国家卫生研究所 1zaaes070065 (至 k. s. k.) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

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References

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利用哺乳动物双杂交法检测雌激素受体α的配联域二维化活性
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Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).More

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

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