Summary
Здесь представлен протокол для защиты ДНК оригами наноструктур в мг истощены и нуклеиназы богатые средства массовой информации, используя природный полисахарид Катионный хитозана и синтетические линейной полиэтиленимина (LPEI) покрытия.
Abstract
ДНК оригами наноструктур провести огромный потенциал, который будет использоваться для биологических и медицинских приложений. Однако низким содержанием соли условия и nucleases в физиологических жидкостях побудить денатурации и деградации собственн-собранные nanostructures ДНК. В не вирусных генов доставки энзимной деградации ДНК преодолевается инкапсуляции отрицательно заряженной ДНК в катионной оболочки. Здесь, вдохновленные гена доставки достижений, простой, одношаговый и надежной методологии представлены для стабилизации ДНК оригами наноструктур путем покрытия их с хитозаном и линейных полиэтиленимина. Поликатион покрытие эффективно защищает ДНК оригами наноструктур в мг истощены и нуклеиназы богатые средства массовой информации. Этот метод также сохраняет полную адресуемости на основе ферментов и aptamer функционализации ДНК наноструктур.
Introduction
ДНК является универсальным строительным блоком для программируемых самостоятельной сборки из наноразмерных структур1. Наиболее популярным методом для создания наноструктур ДНК это ДНК оригами технику, которая основана на самостоятельной сборки длинные круговые, единый мель ДНК лески с помощью сотен короче формы определение синтетических штапель нити2. Сегодня создание ДНК наноструктур в почти любой геометрии и морфология легко осуществимо. Наноструктур ДНК может быть site-specifically функционализированных с высокой точностью3,4 и может быть запрограммирован для прохождения аллостерический конформационные изменения5,6. Следовательно использование ДНК в качестве строительного материала предлагает уникальную возможность для создания программируемых и отзывчивым специально наноструктур для приложений biosensing, диагностика и доставки лекарств. Однако ДНК наноструктур подвержены пищеварение экзо- и Эндо-nucleases и на основе решетки наноструктур 3D оригами ДНК, как правило, требуют высокой солености буферов (например., 5-20 мм Mg+ 2) для поддержания их целостность7,8.
Быстрой деградации ДНК в nucleases присутствует в крови и внеклеточного матрикса является серьезным препятствием для эффективной в естественных условиях доставки генетических продуктов в клетки9. Чтобы преодолеть это ограничение, в не вирусных генов доставки, ДНК смешивается с катионных полимеров на определенный коэффициент (коэффициент аминов в поликатион фосфатов в ДНК) N/P заряд10. Комплекс из ДНК с Катионный полимер, известный как polyplex, защищает ДНК от нуклеиназы опосредованной деградации и повышает его клеточного поглощения11. Вдохновленный достижений доставки генов, oligolysine12, oligolysine полиэтилен гликоль (PEG) сополимеры13, поли (2-диметиламино ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-на основе полимеров14и вирус капсульных белков15 были использованы для стабилизации ДНК оригами наноструктур.
Недавно мы сообщали метод для защиты ДНК оригами наноструктур в мг истощены и нуклеиназы Рич медиа, используя природный полисахарид Катионный хитозана и синтетические линейной полиэтиленимина (LPEI) был сообщил16. Эта статья является адаптация нашей предыдущей работы и описывает подробный протокол для подготовки polyplexes, их характеристики, тестирование стабильности голый и защищенных наноструктур в низким содержанием соли и нуклеиназы богатые средства массовой информации и изучения возможность адресации функционализированных фермента и aptamer ДНК оригами наноструктур при поликатион покрытия.
Protocol
1. Подготовка решения поликатион фондовой
- LPEI раствор
- Добавить 10 мг LPEI в стеклянный стакан, содержащий < 10 мл H2O.
- Чтобы полностью растворить LPEI, добавьте до достижения рН 2.0 HCl (32%).
- Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 путем добавления NaOH (10 М).
- Отрегулируйте громкость до конечной концентрации 1 мг/мл.
- Фильтрата Стоковый раствор LPEI через мембрану 0,22 мкм.
- Стоковый раствор хитозана
- Распустить 16.6 мг лактата олигосахарид хитозана (Mw ~ 5 кДа, 60% олигосахарида состав, deacetylated из хитина 90%) в 1 мл уксусной кислоты (10%) водных сред подготовить раствор с концентрацией 10 мг/мл.
2. Очистка ДНК оригами наноструктур
- Смесь 100 µL пробы ДНК оригами (в 5 мм трис, ЭДТА 1 мм, 5 мм NaCl буфера (обозначается как ТБ) включая 18 мм MgCl2) с эквивалентный объем 22 мм MgCl2 дополнено ТБ (100 мкл) в 1,5 мл.
- 200 мкл очистки буфера (15% (w/v) PEG 8000, 5 мм трис, 1 мм ЭДТА и 505 мм NaCl). Смешайте нежно трубки инверсии.
- Спиновые образца на 16 000 × g при комнатной температуре (r.t.) 25 мин.
- Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в буфере 16 мм MgCl2 дополнено ТБ. Супернатант и гранулы содержат избыток основных нитей и осажденный ДНК-оригами, соответственно.
- Проинкубируйте образцы на один день в r.t. на 650 об/мин в thermomixer. Этот шаг предназначен для полной ресуспендирования ДНК-оригами.
3. агарозы Gel электрофорез (лет)
- Добавьте 1.6 g агарозы и 80 мл 0,5 x TAE буфера (20 мм трис, 0.5 мм ЭДТА, уксусная кислота 10 мм, pH 8) в стеклянный стакан подготовить 2% гель агарозы. Микроволновая печь на 5 мин вихрем содержимое стакана за 1 мин на водяной бане. 352 мкл MgCl2 (2,5 М) подготовить гель с 11 мм MgCl2. Предварительно пятно гель с 10 мкл пятно гель ДНК.
- Залейте раствор гель в поле сухой гель и вставить гребень электрофореза геля. Пусть решение закрепить в r.t. для 15-30 мин.
- Дополнять идущий буфер (0,5 x буфер TAE) с 11 мм MgCl2.
- Смешайте 10-20 мкл пример с 20% 6 x загрузки буфера (глицерина 30% (v/v), 0,25% (w/v) бромфеноловый синий, 0,25% (w/v) ксилол cyanol FF) и загрузить его в скважинах геля агарозы.
- Побегите гель на 70 V в r.t. для 2,5 - 3 ч.
- Визуализируйте с помощью сканера УФ гель.
4. отрицательные пятно просвечивающей электронной микроскопии (nsTEM)
- Примените 5 мкл разбавленного наноструктурированных или polyplex на сетке Cu400 ТЕА свечения выписан углерода покрытием. Пусть он адсорбирует для ca. 1 мин.
- Слейте лишнюю жидкость от края сетки, кусок фильтровальной бумаги.
- Применить 5 мкл ацетат уранила 2% водный раствор и подождите 1 мин.
- Используйте фильтр бумага край полностью слить лишнюю жидкость от края сетки.
- Дайте полностью высохнуть перед инъекцией в ТЕА сетки.
5. Polyplex формирования
Примечание: Иллюстрации для приготовления polyplex, состоящий из ДНК-оригами и хитозана на коэффициенты N/P 0.01-8.
- Рассчитайте количество амины в поликатион с использованием формулы-1 (Таблица 1).
- Измерить концентрацию очищенная ДНК-оригами, используя ультра фиолетовый спектрофотометром в 260 Нм. Используйте 2 мкл буфера ТБ как бланк для калибровки машина. Вычислить «нмоль фосфат» с помощью формулы-2.
- Подготовка 15 мкл структуры ДНК оригами, в том числе 1 нмоль фосфата.
- Используйте формулу-3 для расчета объема хитозана, который необходим для подготовки polyplex на N/P 0.01-8. Например, чтобы подготовить polyplex на N/P 8, необходима 1.8 мкл хитозана (0,8 мг/мл) (N/P 8, нмоль фосфат-1, молекулярный вес хитозана 5000 g/мол, концентрация Стоковый раствор хитозана — 0,8 мг/мл и количество амины в хитозан-28). Мкл 13.2 ТБ до 1,8 мкл хитозана (0,8 мг/мл). Добавьте 15 мкл раствора хитозана (0,8 мг/мл) в 15 мкл ДНК-оригами из шага 5.3 получить ДНК оригами Хитозан polyplex с NP 8. Polyplex формируется спонтанно.
- Повторите шаг 5.4 подготовить polyplexes в разных соотношениях N/P.
- Выполните возраст, как описано в шаге 3 (рис. 1A). Включать голый ДНК-оригами как элемент управления.
- Изображение polyplex, как описано в шаге 4 (рис. 2).
Формулы-1) количество групп аминов в поликатион
Формула-2) моль фосфат
=
Формула-3) Объем (мкл) поликатионами
=
6. деинкапсуляции с декстран сульфата
- Рассчитайте количество сульфата групп на декстран сульфата с использованием формулы-4 (Таблица 2).
- Рассчитать объем декстран сульфата, необходимые для decomplexation polyplex на предопределенный A / P соотношение с использованием формулы-5. A / P заряда коэффициент представляет собой соотношение между группами сульфат полианионом (A) фосфат группам (P) ДНК-оригами. Избыточное количество декстран сульфата необходима для эффективного decomplexation polyplexes (например 500-1000). Например, для decomplex polyplex подготовил в разделе 5 (polyplex содержит 1 нмоль фосфата) на A / P 1000, 3.6 мкл декстран сульфата 40 кДа (50 мг/мл) необходима (A / P-1000, нмоль фосфат 1, молекулярная масса декстран сульфата 40 000 г/моль концентрация декстран сульфата раствор составляет 50 мг/мл и количество сульфата-220). 3.6 мкл декстран сульфата (50 мг/мл) до polyplex с шагом 5.4 и хорошо перемешать.
- При работе с polyplex Хитозан, добавление NaOH для облегчения процесса decomplexation. Добавление NaOH для конечной концентрации 10 мм. Пропустите этот шаг для LPEI polyplexes.
- Выполните возраста, как описано в шаге 3 (рис. 1B). Включать голый ДНК-оригами и polyplex управления.
Формула-4) количество сульфата групп на полианионом =
Формула-5) Объем (мкл) декстран сульфата
=
7. устойчивость к истощению мг
- Вымойте 20 мкл ДНК-оригами или соответствующий polyplex (включая 2 нмоль фосфат) с 4 x 600 мкл буфера мг ноль (5 мм трис, 1 ЭДТА и 30 мм NaCl) с помощью столбца ультрафильтрации (MWCO ~ 3 кДа). Спин каждой стирки на 14 000 × g в r.t. для 3-5 мин.
- Собирать оставшийся раствор (80 мкл) и инкубировать при 37 ° C на один день на 650 об/мин в thermomixer.
- Если тестирование LPEI polyplex, мкл 2,5 MgCl2 (500 мм) для окончательного концентрации 16 мм MgCl2. Затем, 7 мкл декстран сульфата-40 кДа (50 мг/мл) (эквивалентно A / P 1000) разгадать ядро ДНК наноструктур (деинкапсуляции, см. шаг 6).
Примечание: Пропустите этот шаг, если работа с хитозаном polyplex или голый ДНК-оригами. - Следуйте nsTEM изображений, как описано в шаге 3 (рис. 2).
8. DNase I титрования Assay голый ДНК оригами наноструктур
- Mix 3 мкл голый ДНК-оригами, включая 1 нмоль фосфат с 2 мкл 10 x DNase буфере (100 мм трис-HCl, 25 мм MgCl2, 5 мм CaCl2, рН 7,6), 1 мкл MgCl2 (250 мм), 12 мкл воды в 0.2 мл ПЦР пробирок. 2 мкл DNase I (10 x). Отрегулируйте запасов концентрация DNase I (10 x), чтобы получить окончательный DNase я концентрации 0,25-2 ед/мл.
- Проинкубируйте образцы при 37 ° C для 1-2 ч в Термоциклер.
- Погружать образцы в лед и отключить действие nucleolytic, добавив 2 мкл 500 мм Дитиотреитол (DTT) и 2,5 мкл EGTA (33 мм).
- Анализ образцов, используя возраста, как описано в шаге 3.
9. стабильность Polyplexes к DNase I
- Смешайте 4 мкл polyplex (включая 1 нмоль фосфата, подготовленные в разных соотношениях N/P) с 1,5 мкл DNase буфере (10 x), 8 мкл TB и 1.5 мкл DNase I (100 ед/мл) в 0.2 мл ПЦР трубку.
- Проинкубируйте образцы для 24 ч при 37 ° C в Термоциклер.
- 2 мкл протеиназы K (20 мг/мл) переваривать DNase I. инкубировать 30 минут при 37 ° C в Термоциклер.
Примечание: вместо ферментативного пищеварения, химической дезактивации DNase I путем добавления 1,5 мкл DTT (500 мм) и 2 мкл EGTA (33 мм) могут быть выполнены. - 3.6 мкл декстран сульфата-40 кДа (50 мг/мл) (эквивалентно A / P 1000) разгадать ядро ДНК наноструктур.
- Выполните возраста, как описано в шаге 3 (рис. 3A, рис. 3 c). Включить свежие ДНК-оригами как элемент управления для измерения и сравнения интенсивности группы на геле.
- Акцизный группы на возраст и экстракт, ДНК-оригами, выжать заморозить извлечения столбец, основанный на протоколе, предоставленных поставщиком.
- Следуйте nsTEM изображений, как описано в шаге 4 (рис. 2).
10. стабильность к бычьим сывороточным плода (ФБС)
- Смешайте 4 мкл голый ДНК-оригами или его соответствующий polyplex (включая 1 нмоль фосфата) с 17 мкл ТБ + 10% FBS в 0.2 мл ПЦР пробирок. Использование свежей талой FBS.
- Инкубируйте образца в 37 градусов в тепловой циклователь на 24 часа.
- Погрузите образец в ледяной бане.
- Если тестирование polyplex, выполните процесс деинкапсуляции путем добавления 3.6 мкл декстран сульфата-40 кДа (50 мг/мл). Кроме того добавьте NaOH, если работа с хитозаном polyplexes (см. шаг 6.3)
- Выполните возраст, как описано в шаге 3. Включить свежие ДНК-оригами как элемент управления для измерения и сравнения интенсивности группы на геле.
- Акцизный группы о возрасте и извлечь ДНК-оригами, выжать замораживание извлечение столбца.
- Добавьте 2 мкл протеиназы K (20 мг/мл) для извлечения ДНК оригами решение (20 мкл) в 0.2 мл ПЦР-пробирку. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C в Термоциклер для переваривания белков сыворотки, обязан наноструктур.
- Вымойте образца с 5 x 500 мкл ТБ, включая 16 мм MgCl2 с помощью столбца ultracentrifugation (MWCO ~ 100 кДа) мыть протеиназы K (МВт ~ 28,9 кДа) прочь. Спин каждой стирки на 14 000 × g в r.t. для 3-5 мин.
- Выполните nsTEM изображений как описано в шаге 4 (рис. 3).
Примечание: Гель извлечения образца из шага 10.6 может непосредственно использоваться для nsTEM изображений. Однако изображения может быть очень сложным из-за привязанности белков сыворотки крови к ДНК оригами наноструктур. Поэтому лечение протеиназы K (шаги 10,7-10,9) рекомендуется для облегчения процесса создания образа.
11. Проверка адресации фермента пероксидазы хрена (ПХ)-функционализированных ДНК-оригами на покрытие с поликатионами
- Очищайте собственн-собранные биотинилированным NR (биотин-NR), как описано в шаге 2.
- Инкубировать 200 мкл очищенный биотин-NR (36 Нм, в 16 мм дополнены ТБ буфера) с 200 мкл HRP-конъюгированных стрептавидина (540 Нм, в буфере ТБ). Мкл 4.8 MgCl2 (500 мм) до конечной концентрации 14 мм. Инкубируйте на r.t. за 12 ч при 650 об/мин в thermomixer
- Очищайте HRP-функционализированных NR (HRP-NR) методом очистки ПЭГ (как описано в шаге 2) чтобы удалить несвязанные HRP ферментов. Ресуспензируйте осажденный HRP-NR в том числе 16 мм MgCl2ТБ.
- Mix 6,5 мкл очищенный HRP-NR (36 Нм) с 6,5 мкл поликатионами вариант концентрации подготовить polyplex на коэффициенты N/P 1, 2, 4, 10 и 20 (с использованием Формулы 3).
- Повторите шаги 11.2-11.4 для не биотинилированным NR. Как энзимом HRP может связывать-специально для ДНК-оригами, не биотинилированным ДНК-оригами, которая обрабатывается с ПХ ферментов и PEG очищенный (аналогично биотин-NR), будет служить в качестве элемента управления в assay.
- Mix 6,5 мкл дистиллированной воды с 6,5 мкл поликатионами вариант концентрации, соответствующие определенным соотношением N/P 1, 2, 4, 10 и 20. Диссертации Образцы служат пустой группы.
- Добавить приготовленный раствор в шагах 11,4-11.6 (12,5 мкл) 96-луночных пластины, включая 72,5 мкл буфера HEPES (25 мм HEPES, 20 мм KCl, 200 мм NaCl, 0,05% Тритон X-100, 1% ДМСО, рН 7,4) и хорошо перемешать.
- 10 мкл 2, 2'-Азино bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (Бест) (15 мм).
- 5 мкл H2O2 (12 мм) и смешайте хорошо закупорить вверх и вниз. H2O2 инициирует реакцию.
- Измерение оптической плотности в 421 Нм более 4 ч с читателем многомодового пластины (рис. 4A).
12. Проверка адресации гемин привязки аптамеры (HBA)-функционализированных ДНК-оригами на покрытие с поликатионами
- Очищайте HBA функционализированных NR (HBA-NR), как описано в шаге 2. Ресуспензируйте осажденный HBA-NR в ТБ, с 6 мм MgCl2 (более высокие концентрации соли приводит к агрегации HBA-NR).
- Смесь 10 мкл HBA-NR (40 Нм) с 10 мкл поликатионами в различной концентрации для подготовки polyplex определенных коэффициентов N/P 1, 2, 10 и 20.
- Смесь 10 мкл голый NR (40 Нм) или дистиллированной воды с 10 мкл поликатионами в различной концентрации, соответствующие соотношения N/P 1, 2, 10 и 20.
- Добавьте 20 мкл подготовил решение от шагов, 12.2 и 12.3 96-луночных пластины, включая 60 мкл буфера HEPES (25 мм HEPES, 20 мм KCl, 200 мм NaCl, 0,05% Тритон X-100, 1% ДМСО, рН 7,4) и хорошо перемешать. Включать по крайней мере один пустой образец, заменив 20 мкл polyplex или поликатион раствор (из шагов 12.2 и 12.3) с водой.
- Мкл 5 гемин (0,04 мм) следуют 10 мкл АКП (15 мм). Место пластину на орбитальный шейкер для 5 мин.
- 5 мкл H2O2 (12 мм) и смешайте хорошо закупорить вверх и вниз.
- Измерьте absorbance на 421 nmover 30 мин с читателем многомодового пластины (рис. 4В).
Representative Results
Были разработаны три ДНК оригами наноструктур различных конфигураций, включая nanorod (NR), nanobottle (NB) и каркас наноструктур (WN) (3D модели наноструктур проиллюстрированы на рис. 2). NR и NB были разработаны основанные на площади и сотовые решетки, соответственно, с помощью caDNAno17 и WN был создан с помощью программного обеспечения Дедал18. Всеобъемлющего протокола для проектирования и самостоятельной сборки наноструктур ДНК была опубликована уже19,20,,2122. Форму конкретных штапель пряди были приказал, самостоятельно собранных и далее очищенный на основе протокола описаны Stahl и др. 23 (шаг 2).
Polyplexes характеризовались гель отсталости пробирного и nsTEM томографии. После смешивания ДНК-оригами с поликатионами, переход в полосе голый наноструктуре к катоду было отмечено (рис. 1А). Это может объясняться противовеса отрицательный заряд фосфатной группы после привязки к поликатионами и общий размер увеличения комплекса. Добавление дополнительного количества полианионами например декстран сульфата может обратить вспять polyplex формирования. В этой связи, декстран сульфата более высокой молекулярной массы (MW ~ 40 кДа) показали, чтобы быть более эффективным по сравнению с нижней низкомолекулярного декстрана сульфат decomplexation (MW ~ 4 кДа) (рис. 1Б).
Во время визуализации LPEI polyplexes по уранила ацетат негативные пятно ТЕА, было трудно изображение любой частицы. Это было предположить, что LPEI может помешать уранила ацетат от привязки к костяк фосфата из-за жесткой экранирование ДНК-оригами. Таким образом до nsTEM изображений, избыточное количество декстран сульфата был добавлен в ЛЕПИ polyplexes. Разгадана наноструктур оригами ДНК показали никаких признаков дефекта, ни разложения. В отличие хитозана polyplexes были успешно воспроизведен образ без необходимости для лечения полианионом (рис. 2).
Все голые ДНК наноструктур (независимо от их различных конфигураций) были денатурированного полностью после одного дня инкубации при 37 ° C в буфере мг ноль, что подтверждается nsTEM изображений. В отличие от наноструктур с покрытием LPEI или хитозана на N/P≥1 остались нетронутыми. Аналогичным образом, DNase I титрования анализы показали восприимчивость незащищенных наноструктур к ферментативного пищеварения. В то время как голый наноструктур были полностью переваривается в присутствии 1 ед/мл DNase, я после 2 h, ЛЕПИ или Хитозан инкапсулированные ДНК-оригами остался неизменным в мг нулевой буфер дополнена 10 ед/мл DNase я как минимум один день (рис. 2). Более высокой стабильности к nucleolytic пищеварение было достигнуто путем увеличения коэффициента N/P polyplexes. Кроме того LPEI защищает ДНК наноструктур более эффективно по сравнению с хитозаном (рис. 3A, рис. 3C), вероятно, из-за более высокой плотности заряда ЛЕПИ, и, таким образом, выше сродство к ДНК24 . Было отмечено никакой разницы при использовании LPEI разной молекулярной массы (рисунок3B).
Адресация в ДНК наноструктур, после инкапсуляции в полимерной оболочке является важной особенностью функциональных групп. Кроме того был рассмотрен совместимости поликатион покрытия с энзим пероксидазы хрена (ПХ) и ДНК-оригами аптамеры (HBA) функционализированных гемин привязки. Три основных нитей биотинилированным торчали от поверхности NR и затем функционализированных с ПХ конъюгированных стрептавидина (три ферментов на ДНК-оригами). Каталитически высокоактивные (Kd: 439 Нм) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') был выбран для этих экспериментов25. До 24 основных пряди были торчали от поверхности NR с компоновщик 5-Нм длины (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') следуют PS2. Последовательность М (24 аптамеры на ДНК-оригами). Не замечательный помеха ферментативной или aptamer активность наблюдалась после покрытия HRP - или HBA-функционализированных ДНК-оригами с LPEI и хитозана на вариант N/P коэффициенты (рис. 4A-B)16. Однако кинетическая энзимом HRP резко изменилась после привязки к ДНК-оригами (рис. 4C).
Рисунок 1 : Представитель возраст изображения polyplex формирования и деинкапсуляции. (A) assay переноса электрофоретической подвижности для NB смешанного с хитозаном на N/P соотношения 0.01-8. Каждый Лейн содержит 1 нмоль NB. Первый Лейн является ссылкой NB. (B) деинкапсуляции polyplexes, Полианионная декстран сульфата (DS). Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Негативные пятно ТЕА микроскопии ДНК-оригами и polyplexes. 3D модель и nsTEM микроскопии голый ДНК оригами наноструктур (колонки 1 и 2). nsTEM микроскопии LPEI polyplexes (после деинкапсуляции) и хитозана polyplexes (колонки 3 и 4). nsTEM изображения обнаженных и охраняемых ДНК оригами (polyplex) подвергается мг истощения (колонки 5, 6 и 7), энзимной деградации (колонки 8 и 9), сыворотка пищеварения (колонок 10 и 11) за один день на 37 ° C. LPEI-5 кДа был использован в этот assay. Голый наноструктур ДНК были деградированных за пределы обнаружения на эпоху присутствии 1 ед/мл DNase I или в ТБ + 10% FBS после 2 ч инкубации при температуре 37 ° C. Масштаб бары: 100 Нм. Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Представитель результаты DNase I защита анализов. (A) DNase I assay защиты для polyplexes WN с LPEI-5 кДа, LPEI-10 кДа и LPEI-25 кДа, подготовленный на N/P коэффициент 2, 4, 8 и 10. Образцы были подвергнуты 10 ед/мл DNase I для 24 ч при 37 ° C. Последний Лейн является элементом управления WN. Polyplexes были очищенные до погрузки в гель. (B) интенсивность нормализованных средней полосы для polyplexes ДНК origamis с различными LPEI извлеченные из возраста изображения A. Ось Y представляет собой нормализованное средняя полоса интенсивности. (C) DNase I защита пробирного Хитозан WN polyplexes подготовлен на N/P соотношения 1, 2, 4, 10 и 20. Образцы были подвергнуты 10 ед/мл DNase I для 24 ч при 37 ° C. Переулок 6 является элемент управления polyplex (N/P 20). Последний Лейн является элементом управления WN. Все хитозана polyplexes были очищенные до загрузки в гель. Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: результаты представитель колориметрические фермента - и aptamer функционализированных анализов ДНК оригами. (A) колориметрические assay фермента функционализированных наноструктур (HRP-NR) покрытием с хитозаном 3.7 ч после начала реакции. (B) колориметрического анализа aptamer функционализированных наноструктур (HBA-NR) покрытием с хитозаном, 6 мин после начала реакции. Ось Y представляет собой нормализованное поглощения. (C) мониторинг колориметрические assay HRP и ПХ-NR с течением времени. Этот показатель был изменен ранее опубликованные на рисунке16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Катионные полимеры | Хитозан | LPEI-5 кДа | LPEI-10 кДа | LPEI-25 кДа |
| Молекулярная масса полимера (кДа) | 5 | 5 | 10 | 25 |
| Молекулярная масса мономера (г/моль) | 161 | 43 | 43 | 43 |
| Количество Амин на мономера | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Количество аминов в полимер | 28 | 116 | 232 | 581 |
Таблица 1. Расчет числа групп аминов в поликатион.
| Молекулярная масса декстран сульфата (кДа) | 4 | 40 |
| Молекулярная масса мономера (г/моль) | 366 | 366 |
| Количество сульфата на мономера | 2 | 2 |
| Количество сульфата в полимер | 22 | 220 |
Таблица 2. Расчет количество сульфата групп за полианионом.
Discussion
В самостоятельной сборки из ДНК-оригами, основных нитей обычно добавляются в избыточный соотношение 5-10 на эшафот. Также эти излишки основных нитей связать поликатион и формы polyplexes в диапазоне Перекрываемая, который далее трудно отделить от ДНК оригами polyplexes. Таким образом важным шагом в формировании polyplex является удалить избыток основных нитей и использовать хорошо очищенная ДНК оригами наноструктур.
Другие методы были разработаны для стабилизации ДНК наноструктур например циклизация нитей ДНК через клик реакции26. Алкины и азид изменение основных нитей необходимы для формирования блокируемые одноцепочечной колец, этот метод ограничен для стабилизации малых наноструктур такой catenane ДНК, а это не охотно масштабируемость для больших ДНК-оригами Структура таких, которые используются в настоящем Протоколе. Недавно, Герлинг etl.27 сообщил метод для создания ковалентной cyclobutene пиримидина димер (CPD) связей между соседними thymidines в ДНК наноструктур с помощью ультрафиолетового облучения. Хотя этот метод является сайт селективный и масштабируемым, его эффективность в деле защиты ДНК-оригами гораздо ниже, чем поликатион покрытия. К примеру ДСП стабилизированный ДНК оригами объектов терпеть только 0,4 ед/мл DNase я за 1 ч, в то время как polyplexes были стабилен в присутствии 10 ед/мл DNase я по крайней мере один день.
Вкратце, генная терапия вдохновил хитозаном и LPEI покрытие является низкая стоимость, одношаговое и эффективный метод для решения долгосрочной стабильности ДНК оригами наноструктур в мг истощены и нуклеиназы богатые средства массовой информации. Обратимость формирования polyplex облегчает его применение в многоэтапный диагностические тесты, где защита ДНК-оригами против nucleolytic деградации или истощения соль имеет решающее значение в один шаг, но может вызвать проблемы в других такие шаги, как ДНК усиление. Кроме того покрытие поликатион-потенциальный подход для повышения клеточного поглощения ДНК оригами наноструктур для доставки лекарств приложения28.
Disclosures
Авторы заявляют нет конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.
Acknowledgments
Этот проект получил финансирование от Европейского союза Horizon 2020 исследовательской и инновационной программы под Грант соглашение № 686647. ТЕА изображения были записаны на Morgagni, действовали на 80 кв на объекте EM Венской биоцентр основной зал GmbH (VBCF). Мы хотели бы поблагодарить Tadija Кекич за помощь в графический дизайн и Elisa де LIano за проектирование каркасных наноструктур.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10× DNase I reaction buffer | New England Biolab (NEB) | B0303 | |
| ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) | Alfa Aesar | J65535 | |
| Amicon ultracentrifugation columns | Merck Millipore | UCF500308, UCF510024 | |
| Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide | Sigma-Aldrich | 523682 | |
| Design-specific staple strands | Integrate DNA Technologies (IDT) | ||
| Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) | Sigma-Aldrich | 75027 | |
| Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) | Sigma-Aldrich | 42867 | |
| DNA gel loading dye (6×) | ThermoFischer sceintific | R0611 | |
| DNase I (RNase free) | New England Biolab (NEB) | M0303 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | Biorad | 7326165 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroixde slution (32 wt%) | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| LPEI-25 kDa | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) | ThermoFischer sceintific | NP0004 | |
| Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) | Carl Roth | O263.1 | |
| Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 | Sigma-Aldrich | 765090 | |
| Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 | Sigma-Aldrich | 764582 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | ThermoFischer sceintific | AM2548 | |
| Streptavidin-conjugated HRP | ThermoFischer sceintific | N100 | |
| SYBER safe DNA gel stain | ThermoFischer sceintific | S33102 |
References
- Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond. Science. 347 (6224), 1260901 (2015).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites. Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).
- Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
- Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
- Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture. ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).
- Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress. The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).
- Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. Gene therapy and DNA delivery systems. International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
- Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation. Nature Communication. 8, 15654 (2017).
- Agarwal, N. P., Matthies, M., Gür, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami. Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).
- Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., Järvihaavisto, E., Mikkilä, J., Tenhu, H., Nonappac,, Kostiainen, M. A. Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates. Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).
- Perrault, S. D., Shih, W. M. Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability. ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).
- Ahmadi, Y., De Llano, E., Barišić, I. (Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures. Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).
- Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6293), 1534 (2016).
- Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
- Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).
- Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles. Journal of Visualized Experiment. (99), May 52486 (2015).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Grigsby, C. L., Leong, K. W. Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).
- Li, T., Dong, S., Wang, E. G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work. Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).
- Cassinelli, V. 1, Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).
- Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies. Science Advances. , 1157 (2018).
- Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
