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Chemistry

Thérapie génique inspiré Polycation enduit pour la Protection de l’ADN Origami Nanostructures

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58771
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

Summary

Ici, un protocole pour la protection des nanostructures origami ADN dans les médias appauvris en Mg et la nucléase riches à l’aide de polysaccharide cationique naturel chitosan et revêtements synthétiques polyéthylèneimine linéaire (LPEI) est présenté.

Abstract

Nanostructures origami ADN détiennent un immense potentiel d’être utilisé pour des applications biologiques et médicales. Toutefois, des conditions de faible teneur en sel et nucléases dans les liquides physiologiques induisent à la dénaturation et la dégradation des nanostructures auto-assemblées d’ADN. Dans la livraison de gène non viraux, dégradation enzymatique de l’ADN est vaincue par l’encapsulation de l’ADN chargée négativement dans une coquille cationique. Ci-après, inspiré par les progrès de livraison de gène, un simple, en une seule étape et méthodologie robuste est présenté pour la stabilisation des nanostructures origami ADN en les enduisant avec chitosan et polyéthylèneimine linéaire. Le revêtement polycation protège efficacement nanostructures origami ADN en milieu appauvri en Mg et nucléase riches. Cette méthode permet aussi de conserver l’adressabilité pleine de fonctionnalisation aptamère-base d’enzymes et de nanostructures de l’ADN.

Introduction

L’ADN est un bloc de construction polyvalent pour l’auto-assemblage des nano structures1programmable. La méthode la plus populaire pour créer des nanostructures de l’ADN est la technique de l’origami ADN, qui repose sur l’auto-assemblage d’un ADN bicaténaire circulaire, unique échafaudage à l’aide de centaines de courte déterminant la forme synthétique staple brins2. Aujourd'hui, la création d’ADN nanostructures dans presque n’importe quelle géométrie et la morphologie est facile à faire. Nanostructures d’ADN peuvent être relativement fonctionnalisés avec haute précision3,4 et peut être programmé pour subir des changements de conformation allostérique5,6. Par conséquent, en utilisant l’ADN comme matériau de construction offre l’occasion unique de créer des nanostructures programmable et réactif spécialement conçus pour les applications en biodétection, de diagnostics et d’administration des médicaments. Cependant, l’ADN nanostructures sont sensibles à la digestion par exo- et endo-nucléases et axée sur les treillis de nanostructures d’origami ADN 3D requièrent généralement des tampons de forte salinité (e.g., 5-20 mM Mg+ 2) pour maintenir leur l’intégrité7,8.

La dégradation rapide de l’ADN par des nucléases présents dans le sang et la matrice extracellulaire est un obstacle majeur à la prestation efficace in vivo des produits génétiques dans les cellules9. Pour contourner cette limitation, dans la livraison de gène non virale, l’ADN est mélangé avec un polymère cationique à une charge de N/P défini ratio (ratio d’amines dans polycation les phosphates dans l’ADN)10. Le complexe de l’ADN avec un polymère cationique, appelé polyplex, protège l’ADN d’une nucléase induite par la dégradation et favorise son absorption cellulaire11. Inspiré par les progrès de livraison de gène, oligolysine12, oligolysine-polyéthylène glycol (PEG) copolymères13, poly (2-diméthylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-base de polymères14et virus capsid protéines15 ont été utilisés pour stabiliser des nanostructures origami ADN.

Récemment, nous avons rapporté une méthode pour la protection des nanostructures origami ADN dans appauvri en Mg et nucléase-rich media en utilisant le chitosan polysaccharide cationique naturel et le synthétique polyéthylèneimine linéaire (LPEI) a rapporté16. Cet article est une adaptation de nos travaux antérieurs et décrit le protocole détaillé pour la préparation des polyplexes, leur caractérisation, test de stabilité des nanostructures nu et protégées dans les médias la nucléase riches et pauvre en sel et en examinant la adressabilité des enzymes et aptamère-fonctionnalisés ADN origami nanostructures sur revêtement polycation.

Protocol

1. préparer la Solution Stock Polycation

  1. Solution mère de LPEI
    1. Ajouter 10 mg de LPEI dans un bécher de verre contenant < 10 mL de H2O.
    2. Pour dissoudre complètement LPEI, ajouter HCl (32 %) jusqu'à atteindre le pH 2.0.
    3. Ajuster le pH à 7.0 en ajoutant le NaOH (10 M).
    4. Réglez le volume à la concentration finale de 1 mg/mL.
    5. Le filtrat de la solution mère de LPEI à travers une membrane de 0,22 µm.
  2. Solution mère de chitosan
    1. Dissoudre 16,6 mg de lactate de chitosan oligosaccharide (Mw ~ 5 kDa, 60 % de composition oligosaccharide, désacétylé de chitine de 90 %) dans 1 mL d’acide acétique (10 %) des milieux aqueux pour préparer une solution avec une concentration de 10 mg/mL.

2. purification d’ADN Origami Nanostructures

  1. Mélanger 100 µL de l’échantillon d’ADN origami (en 5 mM, EDTA 1 mM, 5 mM NaCl un tampon Tris (dénoté TB) dont 18 mM MgCl2) avec le volume équivalent de 22 mM MgCl2 complété TB (100 µL) dans un tube de 1,5 mL.
  2. Ajouter 200 µL de tampon de purification (15 % (p/v) PEG 8 000, 5 mM Tris, EDTA 1 mM et 505 mM NaCl). Mélanger doucement à l’inversion du tube.
  3. Faire tourner l’échantillon à 16 000 × g à la température ambiante (r.t.) pendant 25 min.
  4. Éliminer le liquide surnageant avec soin et resuspendre le culot dans un tampon 16 mM MgCl2 complété TB. Le surnageant et le culot contiennent excès brins discontinues et précipité ADN origami, respectivement.
  5. Incuber l’échantillon pendant une journée à r.t. à 650 tr/min dans un thermomixer. Cette étape est pour une complète remise en suspension des origami ADN.

3. l’électrophorèse sur Gel d’Agarose (âge)

  1. Ajouter 1,6 g d’agarose et 80 mL de tampon de x TAE 0,5 (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, acide acétique de 10 mM, pH 8) dans un bécher de verre pour préparer un gel d’agarose de 2 %. Four à micro-ondes pendant 5 min. agiter le contenu du bécher pendant 1 min dans un bain d’eau. Ajouter 352 µL de MgCl2 (2,5 M) pour préparer le gel avec 11 mM MgCl2. Avant souillez le gel avec 10 µL de tache de gel ADN.
  2. Verser la solution de gel dans une boîte de gel sèche et insérer un peigne d’électrophorèse de gel. Laisser la solution se solidifier à r.t. pendant 15-30 min.
  3. Supplément de la mémoire tampon en cours d’exécution (0,5 x tampon TAE) avec 11 mM MgCl2.
  4. Mélanger 10-20 µL de l’échantillon avec 20 % de 6 x tampon de charge (30 % (v/v) de glycérol, bleu de bromophénol 0,25 % (p/v), 0,25 % (p/v) de xylène cyanol FF) et le charger dans les puits du gel d’agarose.
  5. Exécutez le gel à 70 V à r.t. pour 2,5 - 3 h.
  6. Visualiser le gel avec un scanner UV.

4. négatif tache microscopie électronique à Transmission (nsTEM)

  1. Appliquer 5 µL de la nanostructure diluée ou le polyplex sur une grille de TEM Cu400 carbone enduit lueur-déchargé. Laisser absorber pendant env. 1 min.
  2. Vidanger le liquide en excès du bord de la grille par un morceau de papier filtre.
  3. Appliquer 5 µL d’une solution aqueuse d’acétate d’uranyle 2 % et attendre pendant 1 min.
  4. Utilisez le bord du papier filtre pour vidanger le liquide en excès du bord de la grille.
  5. Laisser la grille sécher complètement avant de l’injecter dans le TEM.

5. Polyplex Formation

Remarque : L’exemple illustratif pour préparer un polyplex comprenant origami ADN et chitosan à rapports N/P 0,01-8.

  1. Calculer le nombre d’amines par polycation à l’aide de la formule 1 (tableau 1).
  2. Mesurer la concentration de l’origami d’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre à ultra violet à 260 nm. Utiliser 2 µL de tampon de TB comme le blanc pour calibrer la machine. Calculer le « nmol de phosphate » à l’aide de la formule-2.
  3. Préparer 15 µL de la structure d’origami ADN dont 1 nmol de phosphate.
  4. Formule-3 permet de calculer le volume du chitosane, ce qui est nécessaire pour la préparation de la polyplex N/p 0,01-8. Par exemple, pour préparer le polyplex à 8 N/P, 1,8 µL de chitosan (0,8 mg/mL) est nécessaire (N/P est 8, nmol de phosphate est 1, poids moléculaire de chitosan est 5 000 g/mol, concentration de la solution mère de chitosan est de 0,8 mg/mL et le nombre d’amines par chitosan est 28). Ajouter 13,2 µL de la tuberculose à 1,8 µL de chitosan (0,8 mg/mL). Ajouter 15 µL de solution de chitosan (0,8 mg/mL) à 15 µL de l’origami d’ADN de l’étape 5.3 pour obtenir un ADN origami-chitosan polyplex avec NP 8. Le polyplex se forme spontanément.
  5. Répétez l’étape 5.4 pour préparer les polyplexes à différents rapports N/P.
  6. Effectuer un âge tel que décrit à l’étape 3 (Figure 1 a). Inclure l’origami ADN nu comme contrôle.
  7. L’image de la polyplex tel que décrit à l’étape 4 (Figure 2).

    Formule 1) nombre de groupes amines par polycation
    Equation 1

    Formule-2) Mole de phosphate
    =Equation 2

    Formule-3) Volume (µL) de polycations
    =Equation 3

6. la décapsulation avec du sulfate de Dextran

  1. Calculer le nombre de groupes sulfate par sulfate de dextran, à l’aide de la formule-4 (tableau 2).
  2. Calculer le volume du sulfate de dextran, nécessaire pour la décomplexation de la polyplex à un prédéfini A / rapport P en utilisant la formule-5. Le A / P charge ratio est le rapport entre les groupes sulfate de la polyanion (A) pour les groupes de phosphate (P) de l’origami d’ADN. Une quantité excessive de sulfate de dextran est nécessaire pour une efficace décomplexation des polyplexes (p. ex. 500-1 000). Par exemple, pour decomplex la polyplex établi à l’article 5 (polyplex contient 1 nmol de phosphate) à A / P 1 000, 3,6 µL de dextran sulfate 40 kDa (50 mg/mL) est nécessaire (A / P est 1 000, nmol de phosphate est 1, le poids moléculaire du sulfate de dextran est 40 000 g/mol la concentration de solution étalon de sulfate dextran est de 50 mg/mL et nombre de sulfate est 220). Ajouter 3,6 µL du sulfate de dextran (50 mg/mL) à la polyplex étape 5.4 et bien mélanger.
  3. Si vous travaillez avec un polyplex chitosan, ajouter NaOH pour faciliter le processus de décomplexation. Ajouter NaOH pour une concentration finale de 10 mM. Ignorez cette étape pour LPEI polyplexes.
  4. Effectuer un âge tel que décrit à l’étape 3 (Figure 1 b). Inscrire un origami d’ADN nu et polyplex contrôle.

    Formule-4) nombre de groupes sulfate par polyanion =
    Equation 4

    Formule-5) Volume (µL) de sulfate de dextran
    =Equation 5

7. la stabilité vers l’appauvrissement Mg

  1. Laver 20 µL d’un origami ADN ou le polyplex correspondant (y compris 2 nmol phosphate) avec 4 x 600 µL de tampon de Mg-zéro (5 mM Tris, EDTA 1 mM et 30 mM NaCl) à l’aide de la colonne d’ultrafiltration (MWCO ~ 3 kDa). Tourner chaque lavage à 14 000 × g à r.t. pendant 3-5 min.
  2. Recueillir le reste de la solution (80 µL) et incuber à 37 ° C pendant une journée à 650 tr/min dans un thermomixer.
  3. Si test polyplex LPEI, ajouter 2,5 µL de MgCl2 (500 mM) pour une concentration finale de 16 mM MgCl2. Puis, ajouter 7 µL de dextran sulfate-40 kDa (50 mg/mL) (équivalent à A / P 1 000) à démêler le noyau ADN nanostructures (décapsulation, voir étape 6).
    Remarque : Ignorer cette étape si vous travaillez avec le chitosan polyplex ou origami d’ADN nu.
  4. Suivez nsTEM imagerie tel que décrit à l’étape 3 (Figure 2).

8. DNase j’essai de titrage de l’ADN nu Origami Nanostructures

  1. Tubes de DNase I-tampon (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7,6), 1 µL de MgCl2 (250 mM), 12 µL d’eau à 0,2 mL PCR mix 3 µL de l’origami d’ADN nu dont 1 nmol phosphate avec 2 µL de x 10. Ajouter 2 µL de DNase I (x 10). Ajuster la concentration en stock de la DNase I (x 10) pour obtenir la DNase finale j’ai des concentrations de 0,25-2 U/mL.
  2. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 à 2 h dans un thermocycleur.
  3. Plonger les échantillons de glace et de désactiver l’activité nucléolytiques en ajoutant 2 µL de 500 mM le dithiothréitol (DTT) et 2,5 µL de EGTA (33 mM).
  4. Analyse des échantillons à l’aide d’un âge tel que décrit à l’étape 3.

9. stabilité des Polyplexes vers la DNase I

  1. Mix 4 µL d’une polyplex (y compris 1 nmol de phosphate, établi à différents rapports N/P) avec 1,5 µL d’une DNase I mettre en mémoire tampon (10 x), 8 µL de TB et 1,5 µL de DNase I (100 U/mL) dans un PCR de 0,2 mL tube.
  2. Incuber l’échantillon pendant 24 h à 37 ° C dans un thermocycleur.
  3. Ajouter 2 µL de protéinase K (20 mg/mL) pour digérer la DNase I. incuber 30 min à 37 ° C dans un thermocycleur.
    Remarque : au lieu de digestion enzymatique, neutralisation chimique de DNase I en ajoutant 1,5 µL de la TNT (500 mM) et 2 µL de EGTA (33 mM) puisse être effectuée.
  4. Ajouter 3,6 µL de dextran sulfate-40 kDa (50 mg/mL) (équivalent à A / P 1 000) à démêler le noyau ADN nanostructures.
  5. Effectuer l’âge tel que décrit à l’étape 3 (Figure 3 a, Figure 3). Comprennent les frais origami ADN comme contrôle pour mesurer et comparer les intensités de bande sur le gel.
  6. La bande de l’accise sur l’âge et l’extrait de l’origami d’ADN par un squeeze figer colonne d’extraction basée sur le protocole fourni par le fournisseur.
  7. Suivez nsTEM imagerie tel que décrit à l’étape 4 (Figure 2).

10. stabilité vers sérum fœtal (SVF)

  1. Tubes de FBS dans 0,2 mL PCR mix 4 µL d’origami d’ADN nu ou sa polyplex correspondant (y compris 1 nmol de phosphate) avec 17 µL de TB + 10 %. Utilisez FBS fraîchement décongelées.
  2. Incuber les échantillons à 37 ° c dans un thermocycleur pendant 24 h.
  3. Immergez l’échantillon dans un bain de glace.
  4. Si les tests le polyplex, effectuer le processus de décapsulation en ajoutant 3,6 µL de dextran sulfate-40 kDa (50 mg/mL). En outre, ajouter NaOH si vous travaillez avec les polyplexes chitosan (voir étape 6.3)
  5. Effectuer un âge tel que décrit à l’étape 3. Inclure le frais origami ADN comme contrôle pour mesurer et comparer les intensités de bande sur le gel.
  6. La bande de l’accise sur l’âge et extraire l’origami ADN par une colonne d’extraction gel squeeze.
  7. Ajouter 2 µL de protéinase K (20 mg/mL) à la solution d’origami ADN extraite (20 µL) dans un tube PCR de 0,2 mL. Incuber 30 min à 37 ° C dans un thermocycleur pour digérer les protéines sériques liés aux nanostructures.
  8. Laver l’échantillon avec 5 x 500 µL de la tuberculose y compris 16 mM MgCl2 à l’aide de la colonne d’ultracentrifugation (MWCO ~ 100 kDa) pour laver la protéinase K (MW ~ 28,9 kDa) loin. Tourner chaque lavage à 14 000 × g à r.t. pendant 3-5 min.
  9. Exécuter nsTEM imagerie tel que décrit à l’étape 4 (Figure 3).
    Remarque : L’échantillon extrait de gel de l’étape 10.6 pourrait être directement utilisé pour l’imagerie nsTEM. Toutefois, l’imagerie pourrait être très difficile en raison de la fixation de protéines sériques sur les nanostructures d’origami ADN. Par conséquent, traitement de protéinase K (étapes 10,7-10,9) est recommandé pour faciliter le processus d’imagerie.

11. tester l’adressabilité de peroxydase de raifort (HRP)-fonctionnalisés Origami ADN sur revêtement avec Polycations

  1. Purifier l’auto-assemblés biotinylé-NR (biotine-NR) tel que décrit à l’étape 2.
  2. Incuber 200 µL de biotine-NR purifiée (36 nM, en 16 mM complétée to mémoire tampon) avec 200 µL de HRP conjugué streptavidine (540 nM, dans le tampon de TB). Ajouter 4,8 µL de MgCl2 (500 mM) à une concentration finale de 14 mM. Incuber à r.t. pendant 12 h à 650 tr/min dans un thermomixer
  3. Purifier fonctionnalisés HRP NR (HRP-NR) par une méthode de purification de PEG (tel que décrit à l’étape 2) pour supprimer les enzymes HRP indépendants. Resuspendre le HRP-NR précipité dans TB y compris 16 mM MgCl2.
  4. 6.5 mix µL de purifiée HRP-NR (36 nM) avec 6,5 µL de polycations des concentrations variant de préparer le polyplex à rapports N/P de 1, 2, 4, 10 et 20 (à l’aide de la formule 3).
  5. Répétez les étapes 11.2-11,4 pour non-biotinylé NR. Comme l’enzyme HRP peut lier non spécifiquement à l’origami de l’ADN, l’origami d’ADN non-biotinylé, qui est traité avec des enzymes HRP et PEG purifiée (semblable à la biotine-NR), servira de contrôle dans le dosage.
  6. 6.5 mix µL d’eau distillée avec 6,5 µL de polycations des concentrations variant correspondant à des rapports N/P définies de 1, 2, 4, 10 et 20. Exemples de thèses servent le groupe vide.
  7. Ajouter la solution préparée en étapes 11,4-11,6 (12,5 µL) d’une plaque à 96 puits dont 72,5 µL de tampon HEPES (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, pH de Triton X-100, 1 % DMSO, 0.05 % 7,4) et bien mélanger.
  8. Ajouter 10 µL de 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).
  9. Ajouter 5 µL de H2O2 (12 mM) et mélanger bien en pipettant également monter et descendre. H2O2 initie la réaction.
  10. Mesurer l’absorbance à 421 nm sur une période de 4 h avec un lecteur de plaque multimode (Figure 4 a).

12. tester l’adressabilité de liaison hémine Aptamères (HBA)-fonctionnalisés Origami ADN sur revêtement avec Polycations

  1. Purifier le HBA fonctionnalisés-NR (HBA-NR) tel que décrit à l’étape 2. Resuspendre le précipité HBA-NR dans TB additionné de 6 mM MgCl2 (plus élevée concentration saline provoque l’agrégation des HBA-NR).
  2. Mix 10 µL de HBA-NR (40 nM) avec 10 µL de polycations à des concentrations variables de préparer polyplex de définie rapports N/P de 1, 2, 10 et 20.
  3. Mix 10 µL de nu-NR (40 nM) ou eau distillée avec 10 µL de polycations à diverses concentrations correspondant aux rapports N/P de 1, 2, 10 et 20.
  4. Ajoutez la solution de 20 µL préparé des étapes 12.2 et 12.3 à la plaque à 96 puits dont 60 µL de tampon HEPES (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, pH de Triton X-100, 1 % DMSO, 0.05 % 7,4) et bien mélanger. Inclure au moins un échantillon témoin, remplaçant la solution de 20 µL polyplex ou polycation (à partir de mesures 12.2 et 12.3) avec de l’eau.
  5. Ajouter 5 µL d’hémine (0,04 mM) suivie de 10 µL de VTT (15 mM). Placer la plaque dans un agitateur orbital pendant 5 min.
  6. Ajouter 5 µL de H2O2 (12 mM) et mélanger bien en pipettant également monter et descendre.
  7. Mesurer l’absorbance à 421 nmover 30 min avec le lecteur de plaque multimode (Figure 4 b).

Representative Results

Trois ADN origami nanostructures de différentes configurations ont été conçus, y compris une nanotige (NR), une nanobottle (NB) et une nanostructure filaire (WN) (les modèles 3D des nanostructures sont illustrées à la Figure 2). La NR et le NB ont conçu un réseau carré et nid d’abeille, respectivement, à l’aide de la caDNAno17 et le WN a été créé en utilisant le logiciel de Daedalus18. Un protocole complet pour la conception et l’auto-assemblage des nanostructures de l’ADN a été déjà publié19,20,21,22. L’agrafe de forme spécifique brins ont été commandés, self-assembled et purifiés basé sur un protocole décrit par Stahl et al. 23 (étape 2).

Polyplexes ont été caractérisés par l’analyse d’un retard de gel et l’imagerie de nsTEM. Sur l’origami ADN de mélange avec les polycations, un changement dans la bande de nanostructure nu vers la cathode a été observé (Figure 1A). Cela peut être attribuée à l’équilibrage de la charge négative du phosphate augmentent de groupes lors de la liaison de polycations et la taille globale du complexe. Ajout d’une quantité supplémentaire de polyanions tels que le sulfate de dextran peut inverser la formation polyplex. À cet égard, le sulfate de dextran de poids moléculaire plus élevé (MW ~ 40 kDa) a montré pour être plus efficace pour la décomplexation comparée au sulfate de dextran bas poids moléculaire (MW ~ 4 kDa) (Figure 1B).

Tout en imagerie LPEI polyplexes par colorant négatif TEM de l’acétate d’uranyle, il était difficile à l’image de toutes les particules. Il a émis l’hypothèse que LPEI risquent d’entraver l’acétate d’uranyle de se lier à la colonne vertébrale de phosphate grâce à une protection étanche de l’origami de l’ADN. Par conséquent, avant l’imagerie nsTEM, une quantité excessive de sulfate de dextran a été ajoutée à LEPI polyplexes. Les nanostructures démêlés d’origami ADN ne présentaient aucun signe de défectuosité ni décomposition. Au contraire, polyplexes chitosan ont été avec succès projetés sans nécessité de traitement polyanion (Figure 2).

Tous les nanostructures d’ADN nus (indépendamment de leurs configurations différentes) ont été dénaturés complètement après un jour d’incubation à 37 ° C dans un tampon Mg-zéro, tel que confirmé par l’imagerie nsTEM. En revanche, les nanostructures recouverts de LPEI ou chitosan à N/P≥1 sont restés intacts. De la même façon, DNase I titrage essais ont montré la vulnérabilité des nanostructures non protégé vers la digestion enzymatique. Tandis que les nanostructures nus ont été complètement digérées en présence de 1 U/mL DNase I après que 2 h, la LEPI ou chitosan encapsulé origami ADN est resté intact dans Mg-zéro tampon additionné de 10 U/mL DNase I pendant au moins un jour (Figure 2). Une meilleure stabilité vers nucléolytiques digestion a été atteint en augmentant le rapport N/P de la polyplexes. En outre, LPEI protège les nanostructures ADN plus efficacement par rapport au chitosan (Figure 3A, Figure 3C), probablement en raison de la densité de charge plus élevée de la LEPI et donc, une plus grande affinité de liaison vers l’ADN24 . Aucune différence a été observée lors de l’utilisation de LPEI de différents poids moléculaire (Figure3 b).

L’adressabilité de groupes fonctionnels dans les nanostructures de l’ADN après encapsulation dans une coquille de polymère est une caractéristique importante. En outre, la compatibilité du revêtement polycation avec la peroxydase de raifort (HRP) et liaison hémine Aptamères (HBA) fonctionnalisés ADN origami a été examinée. Trois volets discontinues biotinylé étaient sortait de la surface de la NR et puis fonctionnalisés avec HRP conjugué streptavidine (trois enzymes par origami ADN). Les catalytiquement hautement actives (Kd: 439 nM) HBA aptamère PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') a été choisi pour ces expériences25. Jusqu'à 24 brins discontinues ont sortaient de la surface de la NR avec un linker de 5 nm de longueur (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') suivie de la PS2. Séquence de M (24 Aptamères par origami ADN). Aucun obstacle remarquable d’enzymatique ou aptamère activité a été observée à revêtement origami ADN HRP ou HBA-fonctionnalisés avec LPEI et chitosan à variant de rapports (Figure 4A-B) N/P16. Toutefois, les cinétiques de l’enzyme HRP a été radicalement changé après la liaison à l’origami d’ADN (Figure 4C).

Figure 1
Figure 1 : Images représentant âge de formation polyplex et décapsulation. (A) l’analyse de décalage de mobilité électrophorétique de NB mélangé avec le chitosan à rapports N/P de 0,01-8. Chaque piste contient 1 nmol NB La première voie est la référence NB (B) la décapsulation de polyplexes par sulfate de dextran polyanioniques (DS). Ce chiffre a été modifié par un publiées antérieurement figure16. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Colorant négatif des micrographies TEM d’origami ADN et polyplexes. Micrographies modèle et nsTEM 3D d’origami nanostructures (colonnes 1 et 2) de l’ADN nu. nsTEM micrographies de LPEI polyplexes (après la décapsulation) et chitosan polyplexes (colonnes 3 et 4). nsTEM images de l’origami d’ADN nu et protégée (polyplex) soumis à l’appauvrissement de Mg (colonnes 5, 6 et 7), dégradation enzymatique (colonnes 8 et 9), la digestion (colonnes 10 et 11) de sérum pendant une journée à 37 ° C. LPEI-5 kDa a été utilisé dans cet essai. Nanostructures d’ADN nus ont été dégradés au-delà de détection sur un âge en présence de 1 U/mL DNase I ou en TB + 10 % FBS après 2 h d’incubation à 37 ° C. Barreaux de l’échelle : 100 nm. Ce chiffre a été modifié par un publiées antérieurement figure16. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Des résultats représentatifs de DNase j’essais de protection. (A) la DNase I test de protection pour les polyplexes de WN avec LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa et LPEI-25 kDa préparés au rapport N/P du 2, 4, 8 et 10. Les échantillons ont été soumis à 10 U/mL DNase I pendant 24 h à 37 ° C. La dernière voie est le contrôle WN. Les polyplexes étaient décapsulés avant le chargement dans le gel. (B) l’intensité de la bande moyenne normalisée pour polyplexes des origamis d’ADN avec différents LPEI extraites âge image-A. L’axe Y représente normalisée de bande moyenne intensité. (C) la DNase I test de protection de chitosan-WN polyplexes préparé à N/P ratios de 1, 2, 4, 10 et 20. Les échantillons ont été soumis à 10 U/mL DNase I pendant 24 h à 37 ° C. 6 Lane est le contrôle polyplex (N/P 20). La dernière voie est le contrôle WN. Tous les polyplexes chitosan étaient décapsulés chargement préalable dans le gel. Ce chiffre a été modifié par un publiées antérieurement figure16. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: résultats de représentant des dosages colorimétriques-fonctionnalisés enzyme et aptamère d’origami à l’ADN. (A) le dosage colorimétrique de nanostructures fonctionnalisés enzyme (HRP-NR) recouvert de chitosan 3,7 h après le début de la réaction. (B) le dosage colorimétrique des nanostructures aptamère fonctionnalisés (HBA-NR) recouvert de chitosan, 6 min après le début de la réaction. L’axe Y représente l’absorbance normalisée. (C) contrôle le dosage colorimétrique de l’HRP et HRP-NR au fil du temps. Ce chiffre a été modifié par un publiées antérieurement figure16. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Polymères cationiques Chitosan LPEI-5 kDa LPEI-10 kDa LPEI-25 kDa
Poids moléculaire du polymère (kDa) 5 5 10 25
Molecualr poids du monomère (g/mol) 161 43 43 43
Nombre d’amine par monomère 1 1 1 1
Nombre d’amine par polymère 28 116 232 581

Le tableau 1. Calcul du nombre de groupes amines par polycation.

Poids moléculaire du sulfate de dextran (kDa) 4 40
Poids moléculaire du monomère (g/mol) 366 366
Nombre de sulfate par monomère 2 2
Nombre de sulfate par polymère 22 220

Le tableau 2. Calcul du nombre de groupes sulfate par polyanion.

Discussion

Dans l’auto-assemblage d’origami de l’ADN, les brins discontinues sont généralement ajoutés dans 5-10 ratio excédent à l’échafaud. Ces brins discontinues excès également lient à la polyplexes polycation et forme dans la gamme de manomètre qui sont plus difficile d’être séparé de l’ADN origami polyplexes. Par conséquent, une étape cruciale dans la formation polyplex est à retirer les excès brins discontinues et utiliser bien purifiée ADN origami nanostructures.

Autres méthodes ont été développées pour stabiliser les nanostructures ADN telles que la cyclisation des brins d’ADN via un clic réaction26. Comme alcyne - et azoture-modification des brins discontinues sont requises pour la formation de contrefil monocaténaire anneaux, cette technique est limitée pour la stabilisation des petites nanostructures tel un caténane ADN, et ce n’est pas facilement évolutif pour les plus grand origami ADN structure tels que ceux utilisés dans le présent protocole. Récemment, Gerling et unl.27 a signalé une méthode pour créer cyclobutène covalent pyrimidine dimère (CPD) liens entre voisins thymidines dans les nanostructures de l’ADN à l’aide de l’irradiation aux ultraviolets. Bien que cette méthode soit site sélective et évolutive, son efficacité dans la protection origami ADN est beaucoup plus faible que polycation revêtement. Par exemple, les objets origami ADN CPD-stabilisé endurent seulement 0,4 DNase U/mL j’ai pendant 1 h, polyplexes étaient stables en présence de 10 U/mL DNase I pendant au moins une journée.

En bref, thérapie génique inspiré chitosan et revêtement de LPEI est un faible coût, en une seule étape et une méthode efficace pour traiter la stabilité à long terme des nanostructures origami ADN en milieu appauvri en Mg et nucléase riches. La réversibilité de la formation polyplex facilite son application dans les tests de diagnostic plusieurs étapes où la protection de l’origami ADN contre sel-perte ou dégradation nucléolytiques est crucial en une seule étape mais peut causer des problèmes aux autres étapes telles que l’ADN amplification. En outre, le revêtement de polycation est une approche potentielle pour améliorer l’assimilation de nanostructures origami ADN pour les demandes de délivrance de médicaments28.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt concernant ce rapport.

Acknowledgments

Ce projet a reçu de fonds du programme de recherche et l’innovation de Horizon 2020 de l’Union européenne au titre de la subvention contrat no 686647. Images TEM ont été enregistrées sur un Morgagni fonctionné à 80 kV à l’installation de l’EM de la Vienna Biocenter Core installations GmbH (VBCF). Nous tenons à remercier Tadija Kekic pour aide à la conception graphique et Elisa De LIano pour la conception de la nanostructure filaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10× DNase I reaction buffer New England Biolab (NEB) B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) Alfa Aesar J65535
Amicon ultracentrifugation columns Merck Millipore UCF500308, UCF510024
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide Sigma-Aldrich 523682
Design-specific staple strands Integrate DNA Technologies (IDT)
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) Sigma-Aldrich 75027
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) Sigma-Aldrich 42867
DNA gel loading dye (6×) ThermoFischer sceintific R0611
DNase I (RNase free) New England Biolab (NEB) M0303
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) Sigma-Aldrich EDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Biorad 7326165
Hemin Sigma-Aldrich H9039
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) Sigma-Aldrich 216763
LPEI-25 kDa Polysciences, Inc 23966-1
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) ThermoFischer sceintific NP0004
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) Carl Roth O263.1
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 Sigma-Aldrich 765090
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 Sigma-Aldrich 764582
Proteinase K solution (20 mg/ml) ThermoFischer sceintific AM2548
Streptavidin-conjugated HRP ThermoFischer sceintific N100
SYBER safe DNA gel stain ThermoFischer sceintific S33102

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Thérapie génique inspiré Polycation enduit pour la Protection de l’ADN Origami Nanostructures
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Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy … More

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures. J. Vis. Exp. (143), e58771, doi:10.3791/58771 (2019).

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