Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Genterapi inspireret Polycation Coating til beskyttelse af DNA Origami nanostrukturer

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58771
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

Summary

Her, er en protokol om beskyttelse af DNA origami nanostrukturer i Mg-forarmet og nukleasen-rige medier ved hjælp af naturlige kationiske polysaccharid chitosan og syntetiske lineære polyethyleneimine (LPEI) belægninger præsenteret.

Abstract

DNA origami nanostrukturer holde en enorme potentiale til at blive anvendt til biologiske og medicinske applikationer. Men lav-salt betingelser og nukleaser i fysiologiske væsker fremkalde denaturering og nedbrydning af selvsamlede DNA-nanostrukturer. I ikke-virale gen levering, er Enzymatisk nedbrydning af DNA overvældet af indkapsling af den negativt ladede DNA i en kationiske shell. Heri, inspireret af genet levering fremskridt, en enkel, one-step og robust metode præsenteres for stabilisering af DNA origami nanostrukturer med belægning dem med chitosan og lineær polyethyleneimine. Polycation Belægningen beskytter effektivt DNA origami nanostrukturer i Mg-forarmet og nukleasen-rige medier. Denne metode bevarer også den fulde adresserbarhed af enzym - og aptamer-baseret functionalization af DNA nanostrukturer.

Introduction

DNA er en alsidig byggesten for de programmerbare samlesæt af nanoskala strukturer1. Den mest populære metode til at oprette DNA nanostrukturer er DNA origami teknik, som er baseret på den samlesæt i en lang cirkulær, enkelt strandede DNA stillads ved hjælp af hundredvis af kortere form-bestemmende syntetiske korte strands2. I dag, er oprettelsen af DNA nanostrukturer i næsten enhver geometri og morfologi, der umiddelbart gennemførlig. DNA nanostrukturer kan være site-specifically functionalized med høj præcision3,4 og kan programmeres til at gennemgå allosteriske konformationelle ændringer5,6. Derfor, ved hjælp af DNA som byggemateriale tilbyder en unik mulighed for at oprette programmerbare og lydhør specialdesignede nanostrukturer til applikationer i biosensing, diagnostik og medicinafgivelse. Men DNA nanostrukturer er modtagelige for fordøjelsen af exo- og endo-nukleaser og gitter-baseret 3D DNA origami nanostrukturer generelt kræver høj saltholdighed buffere (fx., 5-20 mM Mg+ 2) til at opretholde deres integritet7,8.

Den hurtige nedbrydning af DNA ved nukleaser stede i blod og den ekstracellulære matrix er en væsentlig hindring for effektiv i vivo -levering af genetiske produkter i celler9. For at overvinde denne begrænsning, i ikke-virale gen levering, er DNA blandet med en kationiske polymer på en defineret N/P afgift ratio (forholdet mellem aminer i polycation til fosfater i DNA)10. Komplekset af DNA med en kationiske polymer, kendt som polyplex, beskytter DNA fra nukleasen-medieret nedbrydning og øger dets cellulære optagelse11. Inspireret af genet levering fremskridt, oligolysine12, oligolysine-polyethylen glycol (PEG) copolymerer13, poly (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-baserede polymerer14, og virus kapsid proteiner15 har været brugt til stabiliserende DNA origami nanostrukturer.

For nylig, vi rapporterede en metode til beskyttelse af DNA origami nanostrukturer i Mg-forarmet og nukleasen-rige medier ved hjælp af naturlige kationiske polysaccharid chitosan og den syntetiske lineære polyethyleneimine (LPEI) blev rapporteret16. Denne artikel er en tilpasning af vores tidligere arbejde og beskriver de detaljerede protokol for forberedelse af polyplexes, deres karakterisering, afprøvning stabilitet af nøgne og beskyttede nanostrukturer i lav-salt og nukleasen-rige medier og undersøge den adresserbarhed af enzym - og aptamer-functionalized DNA origami nanostrukturer ved polycation belægning.

Protocol

1. forberedelse Polycation Stock løsning

  1. LPEI stamopløsning
    1. Tilføje 10 mg af LPEI i et glas bægerglas med < 10 mL H2O.
    2. For at opløse LPEI, skal du tilføje HCl (32%) indtil nå til pH 2.0.
    3. Justeres til pH 7,0 ved at tilføje NaOH (10 M).
    4. Regulér lydstyrken til den endelige koncentration af 1 mg/mL.
    5. Filtratet LPEI stamopløsning gennem et 0,22 µm membran.
  2. Chitosan stamopløsning
    1. Opløse 16,6 mg af chitosan oligosaccharid laktat (Mw ~ 5 kDa, 60% oligosaccharid sammensætning, deacetylated fra chitin af 90%) i 1 mL eddikesyre (10%) vandige medier til at forberede en stamopløsning med en koncentration på 10 mg/mL.

2. oprensning af DNA Origami nanostrukturer

  1. Mix 100 µL af DNA-prøven, origami (i 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl buffer (betegnet som TB) herunder 18 mM MgCl2) med den tilsvarende mængde af 22 mM MgCl suppleret2 TB (100 µL) i 1,5 mL rør.
  2. Tilføje 200 µL af rensning buffer (15% (w/v) PLØK 8.000, 5 mM Tris, 1 EDTA og 505 mM NaCl). Bland forsigtigt af tube inversion.
  3. Spin prøve på 16.000 × g ved stuetemperatur (r.t.) i 25 min.
  4. Supernatanten omhyggeligt og resuspenderes i 16 mM MgCl2 suppleret TB buffer. Supernatanten og pellet indeholder overskydende korte tråde og udfældet DNA origami, henholdsvis.
  5. Inkuber prøven for en dag på r.t. på 650 rpm i en thermomixer. Dette trin er for komplet ophvirvling af DNA origami.

3. agarosegel elektroforese (alder)

  1. Tilføje 1,6 g Agarosen og 80 mL 0,5 x TAE buffer (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 10 mM eddikesyre, pH 8) i et glas bægerglas til at forberede en 2%-agarosegel. Mikroovn i 5 min. Swirl indholdet i bægerglasset for 1 min i et vandbad. Tilføje 352 µL af MgCl2 (2,5 M) til at forberede gel med 11 mM MgCl2. Pre pletten gel med 10 µL af DNA gel pletten.
  2. Hæld gelopløsning i en tør gel boks og indsætte en gel elektroforese kam. Lad løsningen størkne på r.t. til 15-30 min.
  3. Supplere den kørende buffer (0,5 x TAE buffer) med 11 mM MgCl2.
  4. Bland 10-20 µL af prøven med 20% af 6 x loading bufferen (30% (v/v) glycerol, 0,25% (w/v) bromophenol blå, 0,25% (w/v) xylen cyanol FF) og indlæse den i Agarosen gel brønde.
  5. Kør gelen på 70 V på r.t. for 2,5 - 3 h.
  6. Visualisere gel med en UV-scanner.

4. negative pletten transmissions elektronmikroskopi (nsTEM)

  1. Anvende 5 µL af de fortyndede nanostrukturer eller polyplex på en glød-udledes CO2-belagt Cu400 TEM gitter. Lad det adsorberer for ca. 1 min.
  2. Dræne overskydende væske fra kanten af gitteret ved et stykke filtrerpapir.
  3. Anvende 5 µL af en 2% uranyl acetat vandig opløsning og vente på 1 min.
  4. Bruge filtrerpapir kant til helt dræne overskydende væske fra kanten af gitteret.
  5. Lad gitteret tørre helt, før indsprøjte det i TEM.

5. Polyplex dannelse

Bemærk: Illustrerende eksempel for at forberede en polyplex bestående af DNA origami og chitosan på N/P 0,01-8 nøgletal.

  1. Beregne antallet af aminer pr. polycation ved hjælp af formel-1 (tabel 1).
  2. Måler koncentrationen af oprenset DNA origami ved hjælp af en ultra violet Spektrofotometer på 260 nm. Brug 2 µL af TB buffer som tomt til at kalibrere maskinen. Beregne "nmol af fosfat" ved hjælp af formel-2.
  3. Forberede 15 µL DNA origami struktur herunder 1 nmol af fosfat.
  4. Brug formel-3 til at beregne mængden af chitosan, som er nødvendig for at forberede polyplex N/p 0,01-8. For eksempel for at forberede polyplex på N/P 8, 1,8 µL af chitosan (0,8 mg/mL) er nødvendig (N/P er 8, nmol af fosfat er 1, molekylvægt af chitosan er 5.000 g/mol, koncentration af chitosan stamopløsning er 0,8 mg/mL og antallet af aminer pr. chitosan er 28). Tilføje 13,2 µL af TB til 1,8 µL af chitosan (0,8 mg/mL). Tilføje 15 µL af chitosan løsning (0,8 mg/mL) til 15 µL DNA-origami fra trin 5.3 at få en DNA origami-chitosan polyplex med NP 8. Polyplex dannes spontant.
  5. Gentag trin 5.4 at forberede polyplexes på forskellige N/P nøgletal.
  6. Udføre en alder, som beskrevet i trin 3 (figur 1A). Omfatte den nøgne DNA-origami som kontrol.
  7. Billede af polyplex, som beskrevet i trin 4 (figur 2).

    Formel-1) antallet af amine grupper pr. polycation
    Equation 1

    Formel-2) muldvarp af fosfat
    =Equation 2

    Formel-3) Polycations volumen (µL)
    =Equation 3

6. udpakning med Dextran sulfat

  1. Beregne antallet af sulfat grupper pr. dextran sulfat ved hjælp af formel-4 (tabel 2).
  2. Beregning af volumen af dextran sulfat behov for decomplexation af polyplex på en foruddefineret A / P-forhold ved hjælp af formel-5. A / P opladning ratio er forholdet mellem grupperne sulfat af polyanion (A) til fosfat-grupper (P) af DNA-origami. En overskydende beløb af dextran sulfat er nødvendig for en effektiv decomplexation af polyplexes (f.eks. 500-1.000). For eksempel, at decomplex polyplex forberedt i sektion 5 (polyplex indeholder 1 nmol af fosfat) på A / P 1.000, 3,6 µL af dextran sulfat 40 kDa (50 mg/mL) der er behov (A / P er 1.000, nmol af fosfat er 1, molekylvægt dextran sulfat er 40.000 g/mol koncentrationen af dextran sulfat stamopløsning er 50 mg/mL og antallet af sulfat er 220). Tilføje 3,6 µL af dextran sulfat (50 mg/mL) til polyplex fra trin 5.4 og bland godt.
  3. Hvis arbejder med en chitosan polyplex, tilføje NaOH for at lette decomplexation processen. Tilsæt NaOH i en endelig koncentration på 10 mM. Spring dette trin for LPEI polyplexes.
  4. Udføre en alder, som beskrevet i trin 3 (figur 1B). Omfatte en nøgen DNA origami og polyplex som kontrol.

    Formel-4) antallet af sulfat grupper pr. polyanion =
    Equation 4

    Formel-5) Volumen (µL) dextran sulfat
    =Equation 5

7. stabilitet mod Mg udtynding

  1. Vaske 20 µL af en DNA-origami eller den tilsvarende polyplex (herunder 2 nmol fosfat) med 4 x 600 µL af Mg-nul buffer (5 mM Tris, 1 EDTA og 30 mM NaCl) ved hjælp af kolonnen ultrafiltrering (MWCO ~ 3 kDa). Spin hver vask på 14.000 × g på r.t. for 3-5 min.
  2. Indsamle de resterende løsning (80 µL) og der inkuberes ved 37 ° C i en dag på 650 rpm i en thermomixer.
  3. Hvis test LPEI polyplex, tilføje 2,5 µL af MgCl2 (500 mM) til en slutkoncentration på 16 mM MgCl2. Tilføj derefter 7 µL af dextran sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (svarende til A / P 1.000) at trævle centralt DNA nanostrukturer (udpakning, se trin 6).
    Bemærk: Spring dette trin, hvis arbejder med chitosan polyplex eller nøgen DNA origami.
  4. Følg nsTEM imaging, som beskrevet i trin 3 (figur 2).

8. DNase jeg titrering Assay af Naked DNA Origami nanostrukturer

  1. Mix 3 µL af naked DNA origami herunder 1 nmol fosfat med 2 µL af 10 x DNase buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7,6), 1 µL af MgCl2 (250 mM), 12 µL vand i 0,2 mL PCR rør. Tilføj 2 µL af DNase jeg (10 x). Justere stock koncentrationen af DNase jeg (10 x) at få endelige DNase jeg koncentrationer af 0,25-2 U/mL.
  2. Inkuber prøver ved 37 ° C i 1-2 timer i en thermocycler.
  3. Fordyb prøver i isen og deaktivere nucleolytic aktivitet ved at tilføje 2 µL af 500 mM dithiothreitol (DTT) og 2,5 µL af EGTA (33 mM).
  4. Analysere prøverne ved hjælp af en alder, som beskrevet i trin 3.

9. stabilitet af Polyplexes mod DNase jeg

  1. Mix 4 µL af en polyplex (herunder 1 nmol af fosfat, tilberedt på forskellige N/P nøgletal) med 1,5 µL af en DNase jeg buffer (10 x), 8 µL af TB og 1,5 µL af DNase jeg (100 U/mL) i en 0,2 mL PCR rør.
  2. Inkuber prøven i 24 timer ved 37 ° C i en thermocycler.
  3. Tilføj 2 µL af proteinase K (20 mg/mL) til at fordøje, DNase I. Inkubér i 30 minutter ved 37 ° C i en thermocycler.
    Bemærk: i stedet for enzymatisk fordøjelse, kemisk inaktivering af DNase jeg tilføje 1,5 µL af DTT (500 mM) og 2 µL af EGTA (33 mM) kan udføres.
  4. Tilføje 3,6 µL af dextran sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (svarende til A / P 1.000) at trævle centralt DNA nanostrukturer.
  5. Udføre alder som beskrevet i trin 3 (figur 3A, figur 3 c). Omfatte frisk DNA origami som kontrol til at måle og sammenligne band intensiteterne på gelen.
  6. Punktafgifter bandet på alder og ekstrakt DNA-origami af en tvangsindløsning fryse udvinding kolonne baseret på protokollen leveres af leverandøren.
  7. Følg nsTEM imaging, som beskrevet i trin 4 (figur 2).

10. stabilitet mod fostrets bovint Serum (FBS)

  1. Mix 4 µL af naked DNA origami eller dens tilsvarende polyplex (herunder 1 nmol af fosfat) med 17 µL af TB + 10% FBS i 0,2 mL PCR rør. Brug frisk optøede FBS.
  2. Inkuber prøve på 37 ˚C i en termisk cycler i 24 timer.
  3. Fordyb prøven i isbad.
  4. Hvis testning af polyplex, udføre udpakning processen ved at tilføje 3,6 µL af dextran sulfat-40 kDa (50 mg/mL). Derudover tilføje NaOH, hvis arbejder med chitosan polyplexes (Se trin 6.3)
  5. Udføre en alder, som beskrevet i trin 3. Omfatte den friske DNA-origami som kontrol til at måle og sammenligne band intensiteterne på gelen.
  6. Punktafgifter bandet på alderen og udpakke DNA-origami ved en squeeze fryse udvinding kolonne.
  7. Tilføje 2 µL af proteinase K (20 mg/mL) til den udpakkede DNA origami løsning (20 µL) i en 0,2 mL PCR rør. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C i en thermocycler at fordøje serum proteiner er bundet til nanostrukturer.
  8. Vaske prøve med 5 x 500 µL af TB herunder 16 mM MgCl2 ved hjælp af kolonnen ultracentrifugering (MWCO ~ 100 kDa) at vaske proteinase K (MW ~ 28,9 kDa) væk. Spin hver vask på 14.000 × g på r.t. for 3-5 min.
  9. Udføre nsTEM imaging som beskrevet i trin 4 (figur 3).
    Bemærk: Eksemplet gel udvindes fra trin 10.6 kan bruges direkte til nsTEM imaging. Imaging kunne dog meget udfordrende på grund af udlæg i serum proteiner til DNA origami nanostrukturer. Proteinase K behandling (trin 10,7-10.9) anbefales derfor, at lette billedprocessen.

11. afprøvning adresserbarhed peberrodsperoxidase enzym (HRP)-functionalized DNA Origami ved belægning med Polycations

  1. Rense den selvsamlede biotinylated-NN (Biotin-NR), som beskrevet i trin 2.
  2. Inkuber 200 µL af renset Biotin-NR (36 nM, i 16 mM suppleret TB buffer) med 200 µL af HRP-konjugerede streptavidin (540 nM, i TB buffer). Tilføje 4,8 µL af MgCl2 (500 mM) til en slutkoncentration på 14 mM. Der inkuberes ved r.t. i 12 timer ved 650 rpm i en thermomixer
  3. Rense HRP-functionalized NN (HRP-NR) af en PIND rensning metode (som beskrevet i trin 2) for at fjerne de ubundne HRP enzymer. Resuspend udfældet HRP-NR i TB herunder 16 mM MgCl2.
  4. Mix 6.5 µL af renset HRP-NR (36 nM) med 6,5 µL af polycations af variant koncentrationer at forberede polyplex på N/P forhold mellem 1, 2, 4, 10 og 20 (ved hjælp af formel 3).
  5. Gentag trin 11.2-11.4 for ikke-biotinylated NR. Som HRP enzymet kan bindes ikke-specifikt DNA origami, ikke-biotinylated DNA origami, som er behandlet med HRP enzymer og PIND renset (svarende til Biotin-NR), vil tjene som kontrol i analysen.
  6. Mix 6.5 µL af destilleret vand med 6,5 µL af polycations af variant koncentrationer svarende til de definerede N/P forhold mellem 1, 2, 4, 10 og 20. Teser prøver tjene som gruppen tom.
  7. Tilføj den forberedte løsning i trin 11,4-11,6 (12,5 µL) til en 96-brønd plade herunder 72,5 µL af HEPES buffer (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 1% DMSO, pH 7,4) og bland godt.
  8. Tilsæt 10 µL af 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).
  9. Tilsæt 5 µL af H2O2 (12 mM) og bland godt ved pipettering op og ned. H2O2 indleder reaktionen.
  10. Absorbansen måles på 421 nm over 4 h med en multimode Pladelæser (figur 4A).

12. test adresserbarhed af Pia-bindende Aptamers (HBA)-functionalized DNA Origami ved belægning med Polycations

  1. Rense HBA functionalized-NN (HBA-NR), som beskrevet i trin 2. Resuspend udfældet HBA-NR i TB suppleret med 6 mM MgCl2 (højere salt koncentration fører til en sammenlægning af HBA-NR).
  2. Mix 10 µL af HBA-NR (40 nM) med 10 µL af polycations ved varierende koncentration at forberede polyplex af definerede N/P forhold mellem 1, 2, 10 og 20.
  3. Mix 10 µL af nøgen-NR (40 nM) eller destilleret vand med 10 µL af polycations ved varierende koncentrationer svarende til N/P forhold mellem 1, 2, 10 og 20.
  4. Tilføj 20 µL forberedt løsning fra trin 12.2 og 12,3 til 96-brønd pladen herunder 60 µL HEPES buffer (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 1% DMSO, pH 7,4) og bland godt. Omfatte mindst én blindprøve erstatte 20 µL polyplex eller polycation løsning (fra trin 12.2 og 12,3) med vand.
  5. Tilsæt 5 µL af Pia (0,04 mM) efterfulgt af 10 µL af ATBS (15 mM). Pladen anbringes på en orbitalryster i 5 min.
  6. Tilsæt 5 µL af H2O2 (12 mM) og bland godt ved pipettering op og ned.
  7. Måling af absorbans ved 421 nmover 30 min med multimode-Pladelæser (figur 4B).

Representative Results

Tre DNA origami nanostrukturer af forskellige konfigurationer blev konstrueret, herunder en nanorod (NN), en nanobottle (NB) og en wireframe af nanostrukturer (WN) (3D-modeller af nanostrukturer er illustreret i figur 2). NR og NB blev designet baseret på et torv og honeycomb gitter, henholdsvis, ved hjælp af caDNAno17 og WN blev oprettet ved hjælp af Daedalus software18. En omfattende protokol for design og samlesæt af DNA nanostrukturer har været offentliggjort allerede19,20,21,22. Figur-specifikke korte tråde var bestilt, selv samlet og yderligere renset baseret på en protokol, der er beskrevet af Stahl mfl. 23 (trin 2).

Polyplexes var kendetegnet ved gel retardering assay og nsTEM billeddannelse. Efter blanding DNA-origami med polycations, blev et skift i den nøgne nanostrukturer band mod katoden observeret (fig. 1A). Dette kan tilskrives modvægt af den negative ladning af fosfat grupper ved binding til polycations og den samlede størrelse forøgelse af komplekset. Tilføje en ekstra mængde af polyanions såsom dextran sulfat kan tilbageføre polyplex dannelse. I denne henseende, dextran sulfat af højere molekylvægt (MW ~ 40 kDa) viste, at være mere effektiv for decomplexation sammenlignet med lavere molekylvægt dextran sulfat (MW ~ 4 kDa) (figur 1B).

Mens imaging LPEI polyplexes af uranyl acetat negative pletten TEM, var det svært at billede partikler. Det var den hypotese, at LPEI kan hæmme uranyl acetat fra bindende til fosfat rygraden på grund af stramme afskærmning af DNA origami. Derfor, forud for nsTEM billeddannelse, en overskydende beløb af dextran sulfat blev føjet til LEPI polyplexes. Unraveled DNA origami nanostrukturer viste ingen tegn på defekt eller nedbrydning. I modsætning, blev chitosan polyplexes med held afbildet uden behov for polyanion behandling (figur 2).

Alle naked DNA-nanostrukturer (uanset deres forskellige konfigurationer) var denatureret helt efter en dag med inkubation ved 37 ° C i Mg-nul buffer, som bekræftet af nsTEM billeddannelse. Derimod forblev nanostrukturer belagt med LPEI eller chitosan på N/P≥1 intakt. På samme måde, DNase jeg titrering assays viste modtagelighed af ubeskyttede nanostrukturer mod Enzymatisk nedbrydning. Mens nøgne nanostrukturer var helt fordøjet i nærværelse af 1 U/mL DNase jeg efter 2 h, LEPI eller chitosan indkapslet DNA origami forblev intakt i suppleret Mg-nul buffer med 10 U/mL DNase jeg i mindst en dag (figur 2). Højere stabilitet mod nucleolytic fordøjelse blev opnået ved at øge N/P-forhold af polyplexes. Derudover beskytter LPEI DNA-nanostrukturer mere effektivt i forhold til chitosan (fig. 3A, figur 3C), sandsynligvis på grund af den højere afgift tæthed af LEPI, og dermed højere bindende affinitet til DNA24 . Ingen forskel var observeret mens du bruger LPEI med forskellige molekylevægt (figur3B).

Adresserbarhed af funktionelle grupper i DNA nanostrukturer efter indkapsling i en polymer shell er en vigtig funktion. Derudover blev polycation belægning forenelighed med peberrodsperoxidase enzym (HRP) og Pia-bindende aptamers (HBA) functionalized DNA origami undersøgt. Tre biotinylated korte tråde var stak fra overfladen af NR og derefter functionalized med HRP konjugeret streptavidin (tre enzymer pr. DNA origami). Katalytisk højaktiv (Kd: 439 nM) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') blev valgt for disse eksperimenter25. Op til 24 korte tråde var stak fra NR overfladen med en 5-nm længde linker (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') efterfulgt af PS2. M sekvens (24 aptamers pr. DNA origami). Ingen bemærkelsesværdig hindring af enzymatiske eller aptamer aktivitet blev observeret ved belægning HRP - eller HBA-functionalized DNA origami med LPEI og chitosan på variant N/P nøgletal (figur 4A-B)16. Men den kinetiske HRP enzym er blevet dramatisk ændret efter binding til DNA-origami (fig. 4C).

Figure 1
Figur 1 : Repræsentant alder billeder af polyplex dannelse og udpakning. (A) elektroforese mobilitet Skift assay for NB blandet med chitosan på N/P forhold mellem 0,01-8. Hver bane indeholder 1 nmol NB. Den første lane er reference NB. (B) udpakning af polyplexes af polyanionic dextran sulfat (DS). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere udgivne figur16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Negative pletten TEM micrographs af DNA origami og polyplexes. 3D model og nsTEM micrographs af naked DNA origami nanostrukturer (kolonne 1 og 2). nsTEM micrographs af LPEI polyplexes (efter udpakning) og chitosan polyplexes (kolonne 3 og 4). nsTEM billeder af nøgne og beskyttet DNA origami (polyplex) underkastes Mg udtynding (kolonne 5, 6 og 7), Enzymatisk nedbrydning (kolonne 8 og 9), serum fordøjelsen (kolonne 10 og 11) til en dag ved 37 ° C. LPEI-5 kDa blev brugt i denne analyse. Naked DNA-nanostrukturer blev nedbrudt udover opdagelse på en alder i nærværelse af 1 U/mL DNase jeg eller i TB + 10% FBS efter 2 h inkubation ved 37 ° C. Skalere barer: 100 nm. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere udgivne figur16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentative resultater af DNase jeg beskyttelse assays. (A) DNase jeg beskyttelse assay for polyplexes af WN med LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa og LPEI-25 kDa forberedt på N/P forhold på 2, 4, 8 og 10. Prøverne blev udsat til 10 U/mL DNase jeg i 24 timer ved 37 ° C. Den sidste lane er kontrol WN. Polyplexes var decapsulated før pålæsningen i gelen. (B) den normaliserede gennemsnitlige band intensitet for polyplexes af DNA origamis med forskellige LPEI udvundet af alder billede-A. Y-aksen repræsenterer normaliseret gennemsnitlige band intensitet. (C) The DNase jeg beskyttelse assay af chitosan-WN polyplexes forberedt på N/P forhold mellem 1, 2, 4, 10 og 20. Prøverne blev udsat til 10 U/mL DNase jeg i 24 timer ved 37 ° C. Lane 6 er kontrol polyplex (N/P 20). Den sidste lane er kontrol WN. Alle chitosan polyplexes var decapsulated forudgående lastning i gelen. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere udgivne figur16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentative resultater af kolorimetriske enzym - og aptamer-functionalized DNA origami assays. (A) kolorimetriske analysen af enzym-functionalized nanostrukturer (HRP-NR) belagt med chitosan 3,7 h efter reaktion start. (B) kolorimetriske analyse af aptamer-functionalized nanostrukturer (HBA-NR) belagt med chitosan, 6 min. efter reaktion indledning. Y-akse repræsenterer de normaliserede absorbans. (C) overvågning kolorimetriske analysen af HRP og HRP-NR over tid. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere udgivne figur16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Kationiske polymerer Chitosan LPEI-5 kDa LPEI-10 kDa LPEI-25 kDa
Molekylevægt af polymer (kDa) 5 5 10 25
Molecualr vægt af monomer (g/mol) 161 43 43 43
Antallet af amin pr. monomer 1 1 1 1
Antallet af amin pr. polymer 28 116 232 581

Tabel 1. Beregning af antallet af amine grupper pr. polycation.

Molekylevægt af dextran sulfat (kDa) 4 40
Molekylevægt af monomer (g/mol) 366 366
Antallet af sulfat pr. monomer 2 2
Antallet af sulfat pr. polymer 22 220

Tabel 2. Beregning af antallet af sulfat grupper pr. polyanion.

Discussion

I den samlesæt DNA origami, de korte tråde er typisk tilføjet i 5-10 overskydende forholdet til skafottet. Disse overskydende korte tråde også binde sig til den polycation og form polyplexes i rækken monometer, som er yderligere vanskeligt kan adskilles fra DNA origami polyplexes. Dermed er et afgørende skridt i polyplex dannelse at fjerne de overskydende korte tråde og bruge godt oprenset DNA origami nanostrukturer.

Andre metoder har været udviklet til stabiliserende DNA nanostrukturer såsom cyclization af DNA-strenge, via et klik reaktion26. Som alkyn og indeholder modificerede korte tråde er nødvendige for dannelsen af låst enkeltstrenget ringe, denne teknik er begrænset til stabilisering af små nanostrukturer DNA catenane, og det er ikke let skalerbart til større DNA origami struktur som dem der bruges i denne protokol. For nylig, Gerling et enl.27 rapporterede en metode til at skabe kovalente cyclobutene pyrimidin dimer (CPD) obligationer mellem tilstødende thymidines inden for DNA nanostrukturer ved hjælp af ultraviolet bestråling. Selvom denne metode er site-selektive og skalerbar, er dens effektivitet i at beskytte DNA origami meget lavere end polycation belægning. For eksempel, udholde CPD-stabiliseret DNA origami objekter kun 0,4 U/mL DNase jeg for 1 h, mens polyplexes var stabil i 10 U/mL DNase jeg mindst én dag.

Kort sagt, genterapi inspireret chitosan og LPEI belægning er en low-cost, one-step og effektiv metode til at behandle den langsigtede stabilitet af DNA origami nanostrukturer i Mg-forarmet og nukleasen-rige medier. Reversibilitet af polyplex dannelsen letter sin ansøgning i flere trin diagnostiske tests hvor beskyttelse af DNA origami mod nucleolytic nedbrydning eller salt-udtynding er afgørende i ét trin, men kan forårsage problemer i andre foranstaltninger såsom DNA forstærkning. Derudover er polycation belægning en potentiel tilgang for at øge den cellulære optagelse af DNA origami nanostrukturer til medicinafgivelse programmer28.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter, der er relateret til denne betænkning.

Acknowledgments

Dette projekt har modtaget støtte fra EUs Horisont 2020 forskning og innovation program under grant aftale nr. 686647. TEM billeder blev optaget på en Morgagni drives på 80 kV på EM anlægget af Wien Biocenter Core faciliteter GmbH (VBCF). Vi vil gerne takke Tadija Kekic for assistance i grafisk design og Elisa De LIano til at designe wireframe nanostrukturer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10× DNase I reaction buffer New England Biolab (NEB) B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) Alfa Aesar J65535
Amicon ultracentrifugation columns Merck Millipore UCF500308, UCF510024
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide Sigma-Aldrich 523682
Design-specific staple strands Integrate DNA Technologies (IDT)
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) Sigma-Aldrich 75027
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) Sigma-Aldrich 42867
DNA gel loading dye (6×) ThermoFischer sceintific R0611
DNase I (RNase free) New England Biolab (NEB) M0303
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) Sigma-Aldrich EDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Biorad 7326165
Hemin Sigma-Aldrich H9039
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) Sigma-Aldrich 216763
LPEI-25 kDa Polysciences, Inc 23966-1
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) ThermoFischer sceintific NP0004
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) Carl Roth O263.1
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 Sigma-Aldrich 765090
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 Sigma-Aldrich 764582
Proteinase K solution (20 mg/ml) ThermoFischer sceintific AM2548
Streptavidin-conjugated HRP ThermoFischer sceintific N100
SYBER safe DNA gel stain ThermoFischer sceintific S33102

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond. Science. 347 (6224), 1260901 (2015).
  2. Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  3. Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites. Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).
  4. Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).
  5. Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
  6. Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
  7. Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
  8. Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture. ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).
  9. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress. The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).
  10. Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. Gene therapy and DNA delivery systems. International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  12. Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation. Nature Communication. 8, 15654 (2017).
  13. Agarwal, N. P., Matthies, M., Gür, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami. Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).
  14. Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., Järvihaavisto, E., Mikkilä, J., Tenhu, H., Nonappac,, Kostiainen, M. A. Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates. Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).
  15. Perrault, S. D., Shih, W. M. Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability. ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).
  16. Ahmadi, Y., De Llano, E., Barišić, I. (Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures. Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).
  17. Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
  18. Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6293), 1534 (2016).
  19. Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
  20. Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).
  21. Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).
  22. Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles. Journal of Visualized Experiment. (99), May 52486 (2015).
  23. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  24. Grigsby, C. L., Leong, K. W. Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).
  25. Li, T., Dong, S., Wang, E. G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work. Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).
  26. Cassinelli, V. 1, Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).
  27. Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies. Science Advances. , 1157 (2018).
  28. Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).

Tags

Kemi spørgsmålet 143 DNA origami polyplex langsigtet stabilisering nucleolytic nedbrydning genterapi functionalization
Genterapi inspireret Polycation Coating til beskyttelse af DNA Origami nanostrukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy … More

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures. J. Vis. Exp. (143), e58771, doi:10.3791/58771 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter