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Chemistry

Gentherapie inspiriert Polykation Beschichtung zum Schutz der DNA Origami Nanostrukturen

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58771
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

Summary

Hier ist ein Protokoll zum Schutz der DNA Origami Nanostrukturen in Mg-erschöpft und Nuklease-Rich Media mit natürlichen kationischen Polysaccharid Chitosan und synthetischen linearen Polyethyleneimine (LPEI) Beschichtungen vorgestellt.

Abstract

DNA-Origami Nanostrukturen halten ein immenses Potenzial für biologische und medizinische Anwendungen verwendet werden. Jedoch induzieren salzarme Bedingungen und Nukleasen in physiologischen Flüssigkeiten Denaturierung und Abbau von selbst-zusammengebauten DNA Nanostrukturen. In nicht-viralen gen Lieferung wird enzymatischen Abbau der DNA durch die Kapselung der negativ geladenen DNA in einer kationischen Shell überwunden. Hierin, inspiriert von gen Lieferung Zuführungen, eine einfache Onestep und robuste Methode wird für die Stabilisierung der DNA Origami Nanostrukturen von präsentiert beschichten sie mit Chitosan und lineare Polyethyleneimine. Die Polykation Beschichtung schützt effizient DNA Origami Nanostrukturen in Mg-erschöpft und Nuklease-Rich Media. Diese Methode schont die volle Adressierbarkeit von Enzym und Aptamer-basierten Funktionalisierung der DNA Nanostrukturen.

Introduction

DNA ist ein vielseitiger Baustein für die programmierbare Selbstorganisation von nanoskaligen Strukturen1. Die populärste Methode für die Erstellung von DNA Nanostrukturen ist die DNA Origami Technik, basierend auf der Selbstmontage eines langen kreisförmigen, single stranded DNA-Stränge Gerüst mit Hilfe von Hunderten von kürzeren Form bestimmen synthetische Grundnahrungsmittel2. Heute ist die Erstellung von DNA-Nanostrukturen in nahezu beliebiger Geometrie und Morphologie ohne weiteres machbar. DNA-Nanostrukturen können mit hoher Präzision3,4 ortspezifisch funktionalisiert werden und allosterische Konformationsänderungen5,6unterziehen programmiert werden können. Mit der DNA als Baustoff bietet somit die einmalige Gelegenheit, programmierbare und reaktionsschnelle speziell angefertigte Nanostrukturen für Anwendungen in Biosensoren, Diagnostik und Drug-Delivery zu schaffen. DNA-Nanostrukturen sind jedoch anfällig für die Verdauung von Exo- und Endo-Nukleasen und Gitter-basierte 3D DNA Origami Nanostrukturen erfordern in der Regel hohen Salzgehalt Puffer (zB., 5-20 mM Mg+ 2) weiterhin ihre Integrität-7,-8.

Der schnelle Abbau der DNA durch Nukleasen in Blut und der extrazellulären Matrix ist ein großes Hindernis für die effiziente in Vivo -Lieferung von Genprodukten in Zellen9. Um diese Einschränkung in nicht-viralen gen Lieferung zu überwinden ist ein kationisches Polymer bei einer definierten N/P kostenlos Ratio (Verhältnis von Aminen in Polykation, die Phosphate in DNA)10DNA beigemischt. Der Komplex von DNA mit einem kationischen Polymer, bekannt als Polyplex, schützt DNA vor Nuklease-vermittelten Abbau und erhöht die zelluläre Aufnahme11. Inspiriert von gen Lieferung Zuführungen, Oligolysine12, Oligolysine-Polyethylen-Glykol (PEG) Copolymere13, Poly (2-Dimethylamino-Ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-basierte Polymere14und Virus-Kapsid-Proteine-15 sind für die Stabilisierung der DNA Origami Nanostrukturen benutzt worden.

Vor kurzem berichteten wir eine Methode für den Schutz der DNA Origami Nanostrukturen in Mg-erschöpft und Nuklease-Rich-Media mit der natürlichen kationischen Polysaccharid-Chitosan und synthetischen linearen Polyethyleneimine (LPEI) war gemeldeten16. Dieser Artikel ist eine Anpassung unserer früheren Arbeiten und beschreibt das ausführliche Protokoll für die Zubereitung von Polyplexes, deren Charakterisierung, testen die Stabilität des nackt und geschützten Nanostrukturen in salzarme und Nuklease-Rich Media und Prüfung der Adressierbarkeit von Enzym und Aptamer funktionalisiert DNA Origami Nanostrukturen auf Polykation Beschichtung.

Protocol

1. Vorbereitung Polykation Lager-Lösung

  1. LPEI-Stammlösung
    1. Fügen Sie 10 mg von LPEI in einem Glas Becher mit < 10 mL H2O.
    2. LPEI vollständig zu lösen, fügen Sie HCl (32 %) bis pH 2.0 zu erreichen.
    3. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 durch Zugabe von NaOH (10 M).
    4. Stellen Sie die Lautstärke auf die Endkonzentration von 1 mg/mL.
    5. Filtrat LPEI Vorratslösung durch eine Membran 0,22 µm.
  2. Chitosan-Stammlösung
    1. Auflösen von 16,6 mg Chitosan Oligosaccharid Lactat (Mw ~ 5 kDa, 60 % Oligosaccharid Komposition, deacetylated aus Chitin um 90 %) in 1 mL Essigsäure (10 %) wässrigen Medien zur Vorbereitung einer Stammlösung mit einer Konzentration von 10 mg/mL.

2. Reinigung der DNA Origami Nanostrukturen

  1. Mix 100 µL der Probe DNA Origami (in 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl Puffer (gekennzeichnet als TB) einschließlich 18 mM MgCl2) durch die gleiche Menge an 22 mM MgCl2 TB ergänzt (100 µL) in einer 1,5 mL Tube.
  2. Fügen Sie 200 µL Puffer Reinigung (15 % (w/V) PEG 8.000 5 mM Tris, 1 mM EDTA und 505 mM NaCl). Mischen Sie durch Umkehrung der Schlauch vorsichtig.
  3. Drehen Sie die Probe bei 16.000 × g bei Raumtemperatur (r.t.) für 25 min.
  4. Den Überstand sorgfältig verwerfen und das Pellet in 16 mM MgCl2 ergänzt TB Puffer Aufschwemmen. Überstand und das Pellet enthalten überschüssiges Grundnahrungsmittel Stränge und ausgefällte DNA Origami.
  5. Eines Tages zu r.t. 650 u/min in einem Thermomixer inkubieren Sie Probe. Dieser Schritt ist für komplette Wiederfreisetzung des DNA-Origami.

(3) Agarose-Gelelektrophorese (Alter)

  1. Fügen Sie 1,6 g Agarose und 80 mL 0,5 X TAE Puffer (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 10 mM Essigsäure, pH 8) in ein Glasgefäß, eine 2 % Agarose-Gel vorzubereiten. Mikrowelle für 5 min. Schwenken den Inhalt des Bechers für 1 min in einem Wasserbad. Fügen Sie 352 µL MgCl2 (2,5 M), das Gel mit 11 mM MgCl2vorzubereiten. Pre Gel mit 10 µL DNA-Gel Fleck Fleck.
  2. Gießen Sie die Gel-Lösung in eine trockene Gel-Box und fügen Sie einen Gel-Elektrophorese-Kamm. Lassen Sie die Lösung bei r.t. für 15-30 min zu festigen.
  3. Ergänzen Sie den laufenden Puffer (0,5 x TAE-Puffer) mit 11 mM MgCl2.
  4. Mischen Sie 10-20 µL der Probe mit 20 % von 6 x laden Puffer (30 % (V/V) Glycerin, 0,25 % (w/V) Bromophenol blue, 0,25 % (w/V) Xylol Cyanol FF) und laden Sie sie in die Agarose-Gel-Brunnen.
  5. Führen Sie das Gel bei 70 V bei r.t. für 2,5 - 3 h.
  6. Visualisieren Sie das Gel mit einem UV-Scanner.

4. negative Fleck Transmissions-Elektronenmikroskopie (NsTEM)

  1. 5 µL verdünnter Nanostruktur oder die Polyplex auf einem Schein entladen Kohlenstoff-beschichtete Cu400 TEM Raster anwenden. Lassen sie adsorbieren, für ca. 1 min.
  2. Lassen Sie überschüssige Flüssigkeit vom Rand des Rasters, indem ein Stück Filterpapier.
  3. 5 µL einer 2 % igen Uranyl Acetat wässrigen Lösung anwenden und 1 min warten.
  4. Verwenden Sie Filterpapier Rand, um überschüssige Flüssigkeit vom Rand des Rasters vollständig zu entleeren.
  5. Lassen Sie das Gitter vollständig trocknen, bevor die Injektion in die TEM.

5. Polyplex Bildung

Hinweis: Anschauliches Beispiel für die Vorbereitung einer Polyplex bestehend aus DNA-Origami und Chitosan N/P 0.01-8-Verhältnisse.

  1. Berechnen Sie die Anzahl von Aminen pro Polykation mit dem Formel-1 (Tabelle 1).
  2. Messen die Konzentration des gereinigten DNA Origami mit einem ultra Violet Spektralphotometer bei 260 nm. Verwenden Sie 2 µL TB Puffer als Rohling, um die Maschine zu kalibrieren. Berechnen Sie die "Nmol Phosphat" mit Formel-2.
  3. Bereiten Sie 15 µL DNA-Origami-Struktur inklusive 1 Nmol von Phosphat.
  4. Verwenden Sie Formel-3 das Volumen von Chitosan, berechnen, die notwendig ist für die Vorbereitung der Polyplex bei N/P 0.01-8. Zum Beispiel zur Vorbereitung der Polyplex N/P 8 1,8 µL von Chitosan (0,8 mg/mL) benötigt (N/P ist 8, Nmol von Phosphat ist 1, Molekulargewicht von Chitosan ist 5.000 g/Mol, Konzentration von Chitosan-Stammlösung ist 0,8 mg/mL und die Anzahl der Amine pro Chitosan ist 28). Fügen Sie 13.2 µL TB 1.8 µL von Chitosan (0,8 mg/mL hinzu). Fügen Sie 15 µL Chitosan-Lösung (0,8 mg/mL) zu 15 µL DNA Origami aus Schritt 5.3 eine DNA Origami-Chitosan Polyplex mit NP 8 bekommen. Die Polyplex ist spontan gebildet.
  5. Wiederholen Sie Schritt 5.4 Polyplexes bei verschiedenen N/P-Verhältnis vorzubereiten.
  6. Führen Sie ein Alter, wie in Schritt 3 (Abbildung 1A) beschrieben. Schließen Sie das nackte DNA Origami als Kontrolle.
  7. Bild der Polyplex wie in Schritt 4 (Abbildung 2) beschrieben.

    Formel-1-) Anzahl von Amin Gruppen pro Polykation
    Equation 1

    Formel 2) Maulwurf von Phosphat
    =Equation 2

    Formel-3) Volumen (µL) von polycations
    =Equation 3

(6) Delamination mit Dextran Sulfat

  1. Berechnen Sie die Anzahl der Sulfat-Gruppen pro Dextran Sulfat mit Formel-4 (Tabelle 2).
  2. Berechnen Sie das Volumen von Dextran Sulfat benötigt für die Decomplexation der Polyplex an einen vordefinierten A / P-Verhältnis mit Formel-5. Die A / P charge Ratio ist das Verhältnis zwischen den Sulfat Polyanions (A) den Phosphat-Gruppen (P) der DNA Origami. Ein Übermaß an Dextran Sulfat ist für eine effiziente Decomplexation von Polyplexes (z.B. 500-1.000) erforderlich. Zum Beispiel die Polyplex decomplex bereit in Abschnitt 5 (Polyplex enthält 1 Nmol Phosphat) bei A / P 1.000, 3,6 µL Dextran Sulfat 40 kDa (50 mg/mL) ist erforderlich (A / P beträgt 1.000, Nmol von Phosphat ist 1, das Molekulargewicht von Dextran Sulfat 40.000 g/Mol die Konzentration von Dextran Sulfat-Stammlösung ist 50 mg/mL und Zahl von Sulfat ist 220). Die Polyplex aus Schritt 5.4 3,6 µL Dextran Sulfat (50 mg/mL) hinzufügen und gut verrühren.
  3. Arbeiten mit einem Chitosan Polyplex fügen Sie NaOH um den Decomplexation zu erleichtern hinzu. Fügen Sie NaOH für eine Endkonzentration von 10 mM. Überspringen Sie diesen Schritt für LPEI Polyplexes.
  4. Führen Sie ein Alter, wie in Schritt 3 (Abbildung 1 b) beschrieben. Gehören Sie ein nackter DNA Origami und Polyplex als Kontrolle.

    Formel-4) Anzahl der Sulfat-Gruppen pro Polyanions =
    Equation 4

    Formel-5) Volumen (µL) von Dextran Sulfat
    =Equation 5

7. Stabilität gegenüber Mg Erschöpfung

  1. Waschen Sie 20 µL einer DNA Origami oder die entsprechenden Polyplex (einschließlich 2 Nmol Phosphat) mit 4 x 600 µL des Mg-Null-Puffers (5 mM Tris, 1 mM EDTA und 30 mM NaCl) über die Ultrafiltration Spalte (MWCO ~ 3 kDa). Drehen Sie jede Wäsche bei 14.000 × g bei r.t. für 3-5 min.
  2. Sammeln Sie die restliche Lösung (80 µL) und eines Tages bei 650 u/min in einem Thermomixer bei 37 ° C inkubieren.
  3. Wenn LPEI Polyplex testen, fügen Sie 2,5 µL MgCl2 (500 mM hinzu) für eine Endkonzentration von 16 mM MgCl2. Fügen Sie dann 7 µL Dextran Sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (Äquivalent zu A / P 1.000), den Kern DNA Nanostrukturen zu entwirren (Delamination, siehe Schritt 6).
    Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn mit Chitosan Polyplex oder nackte DNA Origami arbeiten.
  4. NsTEM Bildgebung zu folgen, wie in Schritt 3 (Abbildung 2) beschrieben.

8. DNase ich Titration Assay von nackter DNA Origami Nanostrukturen

  1. Mix 3 µL nackte DNA Origami einschließlich 1 Nmol Phosphat mit 2 µL 10 X Röhren DNase I (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7.6) 1 µL MgCl2 (250 mM), 12 µL Wasser in 0,2 mL PCR-Puffer. Fügen Sie 2 µL der DNase I (10 X). Passen Sie die Lager Konzentration der DNase ich (10 X) endgültige DNase bekommen ich Konzentrationen von 0,25-2 U/mL.
  2. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für ca. 1-2 h in einem Thermocycler.
  3. Tauchen Sie die Proben im Eis und deaktivieren Sie die Nucleolytic-Aktivität durch Zugabe von 2 µL 500 mM Dithiothreitol (DTT) und 2,5 µL der EGTA (33 mM).
  4. Analysieren Sie die Proben unter Verwendung Alter, wie in Schritt 3 beschrieben.

(9) die Stabilität des Polyplexes in Richtung DNase ich

  1. Mix 4 µL einer Polyplex (einschließlich 1 Nmol von Phosphat, zubereitet auf verschiedene N/P-Verhältnis) mit 1,5 µL einer DNase I-Puffer (10 X), 8 µL TB und 1,5 µL DNase tube ich (100 U/mL) in ein 0,2 mL PCR.
  2. Inkubieren Sie die Probe für 24 h bei 37 ° C in einem Thermocycler.
  3. Fügen Sie 2 µL Proteinase K (20 mg/mL), die DNase I. Inkubation für 30 min bei 37 ° C in einem Thermocycler zu verdauen.
    Hinweis: anstelle von enzymatischen Verdauung, chemische Deaktivierung der DNase I durch Hinzufügen von 1,5 µL von DVB-t (500 mM) und 2 µL der EGTA (33 mM) ausgeführt werden können.
  4. 3.6 µL Dextran Sulfat-40 kDa (50 mg/mL) hinzufügen (Äquivalent zu A / P 1.000), den Kern DNA Nanostrukturen zu entwirren.
  5. Führen Sie Alter, wie in Schritt 3 (Abb. 3A, Abbildung 3) beschrieben. Sind frische DNA Origami als Steuerung für Messen und vergleichen die Band Intensitäten auf das Gel.
  6. Verbrauchsteuern Sie die Band auf dem Alter und dem Extrakt der DNA Origami von einem Spritzer Extraktion Spalte basierend auf dem Protokoll vom Lieferer gelieferten fixieren.
  7. NsTEM Bildgebung zu folgen, wie in Schritt 4 (Abbildung 2) beschrieben.

10. Stabilität gegenüber fetalen Bovine Serum (FBS)

  1. Mix 4 µL nackte DNA Origami oder ihre entsprechenden Polyplex (einschließlich 1 Nmol Phosphat) mit 17 µL TB + 10 % Rohre FBS in 0,2 mL PCR. Verwenden Sie frisch aufgetauten FBS.
  2. Inkubation der Probe bei 37 ° c in einem Thermocycler für 24 h.
  3. Tauchen Sie die Probe in ein Eisbad.
  4. Wenn die Polyplex zu testen, führen Sie die Delamination Prozess durch Zugabe von 3,6 µL Dextran Sulfat-40 kDa (50 mg/mL). Darüber hinaus fügen Sie NaOH, wenn mit Chitosan Polyplexes arbeiten (siehe Punkt 6.3)
  5. Führen Sie ein Alter, wie in Schritt 3 beschrieben. Enthalten Sie das frische DNA Origami als Steuerung für Messen und vergleichen die Band Intensitäten auf dem Gel.
  6. Verbrauchsteuern Sie die Band nach dem Alter und extrahieren Sie der DNA Origami ein Squeeze Einfrieren Extraktion spaltenweise zu.
  7. Die extrahierte DNA Origami Lösung (20 µL) in einem 0,2 mL PCR-Röhrchen 2 µL Proteinase K (20 mg/mL) hinzufügen. Inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C in einem Thermocycler Serumproteine gebunden an die Nanostrukturen zu verdauen.
  8. Waschen Sie die Probe mit 5 x 500 µL TB einschließlich 16 mM MgCl2 unter Verwendung der Ultrazentrifugation Spalte (MWCO ~ 100 kDa), Proteinase K zu waschen (MW ~ 28,9 kDa) entfernt. Drehen Sie jede Wäsche bei 14.000 × g bei r.t. für 3-5 min.
  9. Führen Sie NsTEM Bildgebung wie in Schritt 4 (Abbildung 3) beschrieben.
    Hinweis: Die Gel extrahierten Probe aus Schritt 10.6 kann direkt für NsTEM Bildgebung verwendet werden. Die Bildgebung könnte jedoch sehr anspruchsvoll durch die Befestigung des Serum-Proteine an die DNA Origami Nanostrukturen. Proteinase K Behandlung (Schritte 10.7 10.9) wird daher empfohlen, den imaging-Prozess zu erleichtern.

11. Prüfung der Adressierbarkeit von Meerrettich-Peroxidase-Enzym (HRP)-funktionalisiert DNA Origami bei Beschichtung mit Polycations

  1. Reinigen Sie die selbstgebaute biotinylierte-NR (Biotin-NR), wie in Schritt2 beschrieben.
  2. Inkubieren Sie 200 µL des gereinigten Biotin-NR (36 nM, 16 mm ergänzt TB Puffer) mit 200 µL des HRP-konjugierten Streptavidin (540 nM im TB-Puffer). Hinzu kommt eine Endkonzentration von 14 mM 4,8 µL MgCl2 (500 mM). Bei r.t. 12 h bei 650 u/min in einem Thermomixer inkubieren
  3. Reinigen Sie HRP funktionalisiert NR (HRP-NR) durch eine PEG-Reinigungsverfahren (wie in Schritt2 beschrieben) um die ungebundenen HRP-Enzyme zu entfernen. Aufzuwirbeln Sie die ausgefällte HRP-NR in TB 16 mM MgCl2einschließlich.
  4. Mix-6.5 µL des gereinigten HRP-NR (36 nM) mit 6,5 µL Polycations variant Konzentrationen Polyplex auf N/P-Verhältnis von 1, 2, 4, 10 und 20 (mit Formel 3) vorzubereiten.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 11.2-11.4 für nicht-biotinylierte NR. Da das Enzym HRP unspezifisch an das DNA-Origami, das nicht biotinylierte DNA Origami binden kann die HRP Enzyme mit PEG behandelt wird gereinigt (ähnlich wie Biotin-NR), wird wie das Steuerelement in der Probe dienen.
  6. Mix-6.5 µL destilliertes Wasser mit 6,5 µL Polycations variant Konzentrationen entsprechend der definierten N/P-Verhältnis von 1, 2, 4, 10 und 20. Thesen Beispiele dienen als die leere Gruppe.
  7. Die fertige Lösung in Schritten 11,4-11,6 (12,5 µL) hinzufügen einer 96-Well-Platte einschließlich 72,5 µL HEPES-Puffer (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05 % Triton x-100, 1 % DMSO, pH 7,4) und gut mischen.
  8. Fügen Sie 10 µL 2, 2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).
  9. Fügen Sie 5 µL von H2O2 (12 mM) und mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter. H2O2 initiiert die Reaktion.
  10. Messung der Extinktion bei 421 nm über 4 h mit einem multimode-Platte-Lesegerät (Abb. 4A).

12. Prüfung der Adressierbarkeit von Hämin-Bindung Aptamere (HBA)-funktionalisiert DNA Origami bei Beschichtung mit Polycations

  1. Reinigen Sie die HBA funktionalisiert-NR (HBA-NR), wie in Schritt2 beschrieben. Aufschwemmen der ausgefällten HBA-NR in TB mit 6 mM MgCl2 (höhere Salzkonzentration führt der Aggregation der HBA-NR) ergänzt.
  2. Mischung 10 µL der HBA-NR (40 nM) mit 10 µL des Polycations in unterschiedlicher Konzentration Polyplex definierten N/P-Verhältnis von 1, 2, 10 und 20 vorzubereiten.
  3. Mischung 10 µL nackt-NR (40 nM) oder destilliertem Wasser mit 10 µL des Polycations bei unterschiedlichen Konzentrationen N/P-Verhältnis von 1, 2, 10 und 20 entsprechend.
  4. Die 96-Well-Platte einschließlich 60 µL HEPES-Puffer die 20 µL vorbereitet-Lösung aus Schritte 12.2 und 12.3 hinzufügen (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05 % Triton x-100, 1 % DMSO, pH 7,4) und gut mischen. Enthalten Sie mindestens eine leere Probe 20 µL Polyplex oder Polykation Lösung (von Stufen, 12.2 und 12.3) durch Wasser ersetzen.
  5. Fügen Sie 5 µL Hämin (0,04 mM) gefolgt von 10 µL ATBS (15 mM). Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler für 5 min.
  6. Fügen Sie 5 µL von H2O2 (12 mM) und mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter.
  7. Messung der Extinktion bei 421 Nmover 30 min mit dem multimode Platte Leser (Abbildung 4 b).

Representative Results

Drei DNA-Origami-Nanostrukturen verschiedener Konfigurationen wurden entworfen, einschließlich einer Nanorod (NR), eine Nanobottle (NB) und ein Drahtmodell Nanostruktur (WN) (die 3D Modelle der Nanostrukturen sind in Abbildung 2dargestellt). Die NB und die NB wurden entwickelt, basierend auf dem Platz und Waben Gitter bzw., mit CaDNAno17 und die WN mit der Daedalus Software18erstellt wurde. Ein umfassendes Protokoll für die Gestaltung und Selbstorganisation von DNA Nanostrukturen wurde bereits19,20,21,22veröffentlicht. Die Form-spezifische Heftklammer Stränge wurden bestellt, selbst zusammengestellt und weiter gereinigt anhand eines Protokolls von Stahl Et al.beschrieben. 23 (Schritt 2).

Polyplexes waren geprägt von dem Gel Retardierung Assay und NsTEM Bildgebung. Beim Mischen der DNA Origami mit der Polycations, wurde eine Verschiebung in der nackt Nanostruktur-Band in Richtung der Kathode (Abb. 1A) beobachtet. Dies kann das Gegengewicht zu der negativen Ladung von Phosphat Gruppen auf Bindung an Polycations und die Gesamtgröße der Anlage zu erhöhen. Hinzufügen einen zusätzlichen Betrag von Polyanions wie Dextran Sulfat kann die Polyplex Bildung umkehren. In dieser Hinsicht, Dextran Sulfat von höherem Molekulargewicht (MW ~ 40 kDa) erwies sich als effizienter für die Decomplexation im Vergleich zu geringeren Molekulargewicht Dextran Sulfat (MW ~ 4 kDa) (Abbildung 1B).

Während imaging LPEI Polyplexes von Uranyl Acetat negative Fleck TEM, war es schwierig, alle Partikel Bild. Es wurde vermutet, dass LPEI Uranyl Acetat aus der Bindung an den Phosphat-Backbone durch enge Abschirmung des DNA Origami behindern könnte. Daher wurde ein Übermaß an Dextran Sulfat vor NsTEM Bildgebung, LEPI Polyplexes hinzugefügt. Entwirrt DNA Origami Nanostrukturen zeigten keine Anzeichen von Mangel noch Zersetzung. Im Gegensatz dazu wurden Chitosan Polyplexes erfolgreich mit keine Notwendigkeit für Polyanions Behandlung (Abbildung 2) abgebildet.

Alle nackte DNA Nanostrukturen (unabhängig von ihrer unterschiedlichen Konfigurationen) wurden komplett nach einem Tag der Inkubation bei 37 ° C in Mg-Null Puffer, denaturierte NsTEM Bildgebung bestätigt. Im Gegensatz dazu Nanostrukturen mit LPEI oder Chitosan bei N/P≥1 beschichtet, die intakt geblieben. In ähnlicher Weise DNase ich Titration Assays zeigte die Anfälligkeit der ungeschützten Nanostrukturen auf enzymatische Verdauung. Während nackte Nanostrukturen wurden vollständig verdaut, im Beisein von 1 U/mL DNase I nach 2 h, die LEPI oder Chitosan DNA Origami gekapselt intakt in blieb ergänzt Mg-Null Puffer mit 10 U/mL DNase ich für mindestens einen Tag (Abbildung 2). Höherer Stabilität gegenüber Nucleolytic Verdauung wurde erreicht, indem man das N/P-Verhältnis von der Polyplexes. Darüber hinaus schützt LPEI DNA Nanostrukturen mehr effizient im Vergleich zu Chitosan (Abb. 3A, Abbildung 3C), wahrscheinlich wegen der höheren Ladungsdichte LEPI und damit höhere Bindungsaffinität gegenüber der DNA24 . Keinen Unterschied bei der Verwendung von LPEI von unterschiedlichem Molekulargewicht beobachtet wurde (Abbildung3 b).

Die Adressierbarkeit von funktionellen Gruppen in DNA Nanostrukturen nach Kapselung in einer Polymer-Shell ist ein wichtiges Merkmal. Darüber hinaus wurde die Kompatibilität der Polykation Beschichtung mit Meerrettich-Peroxidase-Enzym (HRP) und Hämin-Bindung Aptamere (HBA) funktionalisiert DNA Origami untersucht. Drei biotinylierte Grundnahrungsmittel Stränge waren ragte aus der Oberfläche von der NR und dann funktionalisiert mit HRP-konjugierten Streptavidin (drei Enzyme pro DNA-Origami). Die katalytisch hochaktive (Kd: 439 nM) HBA Aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3 ") wurde für diese Experimente25gewählt. Bis zu 24 Heften Stränge waren ragte aus der NR-Oberfläche mit einer 5-nm Länge Linker (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3 ") gefolgt von der PS2. M-Sequenz (24 Aptamere pro DNA-Origami). Keine bemerkenswerten Behinderung der enzymatischen oder Aptamer-Aktivität wurde bei der Beschichtung von HRP oder HBA funktionalisiert DNA Origami mit LPEI und Chitosan bei Variante N/P-Verhältnis (Abbildung 4A-B)16beobachtet. Jedoch wurde die kinetische Enzym HRP drastisch nach der Bindung an die DNA Origami (Abb. 4C) geändert.

Figure 1
Abbildung 1 : Repräsentative Alter Bilder von Polyplex Bildung und Delamination. (A) die elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay für NB gemischt mit Chitosan bei N/P-Verhältnis von 0,01-8. Jede Spur enthält 1 Nmol NB Die erste Spur ist die Referenz NB (B) Delamination von Polyplexes durch anionisches Dextran Sulfat (DS). Diese Zahl wurde von einer zuvor veröffentlichten Abbildung16geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Negative Fleck TEM Mikrographen DNA Origami und Polyplexes. 3D Modell und NsTEM Mikrographen nackte DNA Origami Nanostrukturen (Spalten 1 und 2). NsTEM Mikrographen LPEI Polyplexes (nach Delamination) und Chitosan Polyplexes (Spalten 3 und 4). NsTEM Bilder von nackten und geschützten DNA-Origami (Polyplex) ausgesetzt Mg Erschöpfung (Spalten 5, 6 und 7), enzymatischen Abbau (Spalten 8 und 9), Serum Verdauung (Spalten 10 und 11) für einen Tag bei 37 ° C. LPEI-5 kDa wurde in diesem Test verwendet. Nackte DNA Nanostrukturen wurden darüber hinaus-Erkennung auf einem Alter im Beisein von 1 U/mL DNase ich degradiert oder TB + 10 % FBS nach 2 h Inkubation bei 37 ° C. Skalieren Sie Bars: 100 nm. Diese Zahl wurde von einer zuvor veröffentlichten Abbildung16geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Repräsentative Ergebnisse der DNase ich Schutz Assays. (A) die DNase ich Schutz Assay für Polyplexes WN mit LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa und LPEI-25 kDa bei N/P-Verhältnis von 2, 4, 8 und 10 vorbereitet. Die Proben wurden 10 U/mL DNase unterzogen ich 24 Stunden bei 37 ° C. Die letzte Spur ist das Steuerelement WN. Die Polyplexes waren Decapsulated vor der Verladung in das Gel. (B) die Intensität der normalisierten mittlere Band für Polyplexes DNA Origami mit verschiedenen entnommen LPEI Alter Bild-A. Y Achse repräsentiert normalisierte mittlere Band Intensität. (C) die DNase ich Schutz Assay von Chitosan-WN Polyplexes vorbereitet auf N/P Verhältnis von 1, 2, 4, 10 und 20. Die Proben wurden 10 U/mL DNase unterzogen ich 24 Stunden bei 37 ° C. Bahn 6 ist die Kontrolle Polyplex (N/P-20). Die letzte Spur ist das Steuerelement WN. Alle Chitosan Polyplexes wurden Decapsulated vor Verladung in das Gel. Diese Zahl wurde von einer zuvor veröffentlichten Abbildung16geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Ergebnisse Vertreter der kolorimetrischen Enzym und Aptamer funktionalisiert DNA Origami Assays. (A) der kolorimetrischen Assay Enzym funktionalisiert Nanostrukturen (HRP-NR) beschichtet mit Chitosan 3,7 h nach dem Start der Reaktion. (B) kolorimetrischen Probe Aptamer funktionalisiert Nanostrukturen (HBA-NR) mit Chitosan, 6 min nach der Einleitung der Reaktion überzogen. Y Achse repräsentiert die normalisierten Extinktion. (C) Überwachung der kolorimetrischen Assays HRP und HRP-NR im Laufe der Zeit. Diese Zahl wurde von einer zuvor veröffentlichten Abbildung16geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Kationische Polymere Chitosan LPEI-5 kDa LPEI-10 kDa LPEI-25 kDa
Molmasse des Polymers (kDa) 5 5 10 25
Molekularen Gewicht von Monomer (g/Mol) 161 43 43 43
Anzahl der Amin pro monomer 1 1 1 1
Anzahl der Amin pro polymer 28 116 232 581

Tabelle 1. Berechnung der Anzahl von Amin Gruppen pro Polykation.

Molekulargewicht von Dextran Sulfat (kDa) 4 40
Molekulargewicht von Monomer (g/Mol) 366 366
Anzahl von Sulfat pro monomer 2 2
Anzahl von Sulfat pro polymer 22 220

Tabelle 2. Berechnung der Anzahl der Sulfat-Gruppen pro Polyanions.

Discussion

Bei der Selbstmontage von DNA-Origami, die Grundnahrungsmittel Stränge sind in der Regel hinzugefügt in 5-10 überschüssige Verhältnis zum Schafott. Diese überschüssige Grundnahrungsmittel Stränge binden auch an die Polykation und Form Polyplexes im Bereich von Monometer weitere schwer von DNA Origami Polyplexes getrennt sind. Daher ist ein entscheidender Schritt in Polyplex Bildung zu entfernen der überschüssigen Grundnahrungsmittel Stränge und gut gereinigte DNA Origami Nanostrukturen.

Andere Methoden wurden zur Stabilisierung der DNA Nanostrukturen wie die Biosyntheseschritt der DNA-Stränge über einen Klick Reaktion26entwickelt. Da Alkinen und Azid-modifizierte Grundnahrungsmittel Stränge für die Bildung von Interlock einsträngige Ringe erforderlich sind, diese Technik ist für die Stabilisierung der kleinen Nanostrukturen solche DNA-Catenans begrenzt, und es ist nicht leicht skalierbar für größere DNA-origami Struktur wie in diesem Protokoll verwendet. Vor kurzem, Gerling et einl.27 berichtet eine Methode zum Erstellen von kovalente Cyclobutene Pyrimidine Dimer (CPD) Verbindungen zwischen benachbarten Thymidines in DNA Nanostrukturen mit UV-Bestrahlung. Obwohl diese Methode Website selektiv und skalierbar ist, ist seine Effizienz beim Schutz der DNA Origami viel niedriger als Polykation Beschichtung. Zum Beispiel ertragen CPD stabilisiert DNA Origami Objekte nur 0,4 U/mL DNase I für 1 h, während Polyplexes waren stabil im Beisein von 10 U/mL DNase ich für mindestens einen Tag.

Kurz gesagt, Gentherapie inspiriert Chitosan und LPEI Beschichtung ist ein Low-Cost, Onestep und effiziente Methode, um die langfristige Stabilität der DNA Origami Nanostrukturen in Mg-erschöpft und Nuklease-Rich Media zu richten. Die Reversibilität der Polyplex Bildung erleichtert die Anwendung in der mehrstufigen diagnostische Tests, wo der Schutz der DNA Origami gegen Nucleolytic Abbau oder Salz-Erschöpfung kommt es in einem Schritt aber verursachen Probleme in anderen Schritten wie DNA Verstärkung. Darüber hinaus ist Polykation Beschichtung einen möglichen Ansatz zur Verbesserung der zellulären Aufnahme von DNA Origami Nanostrukturen für Drug Delivery Anwendungen28.

Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.

Acknowledgments

Dieses Projekt wird finanziell von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm unter Grant Agreement Nr. 686647. TEM-Bilder wurden auf eine Morgagni betrieben bei 80 kV in der EM-Anlage von Vienna Biocenter Kern Einrichtungen GmbH (VBCF). Wir möchten Unterstützung bei der grafischen Gestaltung und Elisa De LIano Tadija Kekic danken, für die Gestaltung der Wireframe Nanostruktur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10× DNase I reaction buffer New England Biolab (NEB) B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) Alfa Aesar J65535
Amicon ultracentrifugation columns Merck Millipore UCF500308, UCF510024
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide Sigma-Aldrich 523682
Design-specific staple strands Integrate DNA Technologies (IDT)
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) Sigma-Aldrich 75027
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) Sigma-Aldrich 42867
DNA gel loading dye (6×) ThermoFischer sceintific R0611
DNase I (RNase free) New England Biolab (NEB) M0303
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) Sigma-Aldrich EDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Biorad 7326165
Hemin Sigma-Aldrich H9039
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) Sigma-Aldrich 216763
LPEI-25 kDa Polysciences, Inc 23966-1
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) ThermoFischer sceintific NP0004
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) Carl Roth O263.1
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 Sigma-Aldrich 765090
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 Sigma-Aldrich 764582
Proteinase K solution (20 mg/ml) ThermoFischer sceintific AM2548
Streptavidin-conjugated HRP ThermoFischer sceintific N100
SYBER safe DNA gel stain ThermoFischer sceintific S33102

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Chemie Ausgabe 143 DNA-Origami Polyplex langfristige Stabilisierung Nucleolytic Abbau Gentherapie Funktionalisierung
Gentherapie inspiriert Polykation Beschichtung zum Schutz der DNA Origami Nanostrukturen
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Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy … More

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures. J. Vis. Exp. (143), e58771, doi:10.3791/58771 (2019).

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