Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

ריפוי גנטי בהשראת Polycation ציפוי הגנה על ה-DNA אוריגמי Nanostructures

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58771
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

Summary

כאן מוצג פרוטוקול להגנה על ה-DNA nanostructures אוריגמי בתקשורת מדולדל מ"ג ו נוקלאז עשיר באמצעות רב-סוכר cationic טבעי משקם, ציפויים סינטטיים ליניארי polyethyleneimine (LPEI).

Abstract

ה-DNA אוריגמי nanostructures החזק של פוטנציאל עצום לשמש ליישומים ביולוגי ורפואי. עם זאת, תנאי מלח נמוכה, nucleases של נוזלים פיזיולוגיים לגרום דנטורציה והשפלות של עצמי שהורכב nanostructures DNA. ב המסירה הגן נגיפי, השפלה אנזימטי של ה-DNA היא להתגבר על ידי העטיפה של ה-DNA טעונים שלילית במעטפת cationic. במסמך זה, בהשראת ג'ין משלוח הפיתוחים, פשוטה, צעד אחד ומתודולוגיה חזקים מוצג לייצוב DNA אוריגמי nanostructures על ידי ציפוי אותם עם משקם, polyethyleneimine ליניארית. הציפוי polycation מגן ביעילות על הדנ א nanostructures אוריגמי בתקשורת מדולדל מ"ג ו נוקלאז עשיר. שיטה זו גם משמר את מיעון מלא של אנזים aptamer מבוססות functionalization של ה-DNA nanostructures.

Introduction

הדנ א הוא אבן בניין רב תכליתי עבור לתכנות הרכבה עצמית של מבנים ננו1. השיטה הפופולרית ביותר ליצירת DNA nanostructures היא הטכניקה אוריגמי הדנ א, אשר מבוססת על הרכבה עצמית של דנ א נטוש זמן מעגלי, יחיד לגרדום בסיועם של מאות הידוק סינתטי שקובעים צורה קצרה קווצות2. היום, היצירה של ה-DNA nanostructures כמעט כל הגיאומטריה, מורפולוגיה הוא ריאלי בקלות. ה-DNA nanostructures יכול להיות functionalized site-specifically עם דיוק גבוהה3,4 , ניתן לתכנת עוברים שינויים הסתגלותי allosteric5,6. לפיכך, באמצעות DNA כחומר בניין מציע הזדמנות ייחודית ליצירת לתכנות ומגיב אישית מעוצבת nanostructures עבור יישומים ב- biosensing, אבחון ומסירת סמים. לעומת זאת, ה-DNA nanostructures רגישים לעיכול על ידי exo- אנדו-nucleases, מבוסס סריג nanostructures אוריגמי DNA 3D בדרך כלל דורשים מאגרי מליחות גבוהה (למשל., מ מ 5-20 מ ג+2) כדי לשמור על שלהם שלמות7,8.

השפלה מהירה של ה-DNA על-ידי nucleases נוכח מטריצה חוץ-תאית ודם היא מכשול גדול יעיל ויוו משלוח של מוצרים גנטיים לתוך תאים9. על מנת להתגבר על מגבלה זו, במשלוח ג'ין נגיפי DNA מעורבב עם פולימר cationic-מוגדר N/P תשלום יחס (היחס בין אמינים ב polycation צמודה פוספטים בדנ א)10. המתחם של ה-DNA עם פולימר cationic, המכונה polyplex, מגן על ה-DNA מפני השפלה בתיווך נוקלאז ומשפר את ספיגת הסלולר שלה11. בהשראת החידושים משלוח ג'ין, oligolysine12, oligolysine-פוליאתילן גליקול (PEG) copolymers13, פוליפוני (2-דלמטלמינו-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-בסיס פולימרים14ווירוס capsid חלבונים15 השתמשו לייצוב DNA אוריגמי nanostructures.

לאחרונה דיווחנו שיטה להגנה על הדנ א nanostructures אוריגמי ב מדולדל Mg, מדיה עשירה נוקלאז באמצעות משקם את רב-סוכר cationic טבעי ו- polyethyleneimine ליניארית סינתטי (LPEI) דווח על16. מאמר זה הוא עיבוד של העבודה הקודמת שלנו ומתאר את פרוטוקול מפורט עבור הכנת polyplexes, שלהם אפיון, בדיקות יציבות nanostructures עירום ומוגן מלח נמוכה ומדיה עשירה נוקלאז ובודקים מיעון של אנזים - ו aptamer-functionalized nanostructures אוריגמי הדנ א על ציפוי polycation.

Protocol

1. הכנת פתרון Polycation מניות

  1. פתרון מניות LPEI
    1. להוסיף 10 מ ג של LPEI לתוך גביע זכוכית המכיל < 10 מ"ל של H2O.
    2. ימס לגמרי LPEI, להוסיף HCl (32%) עד הגיעו pH 2.0.
    3. להתאים את ה-pH אל 7.0 באמצעות הוספת NaOH (10 מ').
    4. לכוון את עוצמת הקול כדי הריכוז הסופי של 1 מ"ג/מ"ל.
    5. Filtrate הפתרון מניות LPEI דרך קרום 0.22 מיקרומטר.
  2. פתרון מניות משקם
    1. להמיס 16.6 מ ג של לקטט פחמימה # מיון הפחמימות משקם (Mw ~ 5 kDa, הרכב פחמימה # מיון הפחמימות 60%, deacetylated מן כיטין על ידי 90%) ב 1 מ"ל של חומצה אצטית (10%) מדיה מימית כדי להכין פתרון מניות עם ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל.

2. טיהור של ה-DNA אוריגמי Nanostructures

  1. מיקס 100 µL של אוריגמי לדנ (5 מ מ טריס, EDTA 1 מ"מ, 5 מ"מ NaCl מאגר (מסומן בתור טרה-בתים) כולל 18 מ מ MgCl2) עם נפח 22 מ"מ MgCl המקביל בתוספת2 טרה-בתים (100 µL) צינור 1.5 מ ל.
  2. להוסיף 200 µL טיהור מאגר (15% (w/v) פג 8,000, 5 מ מ טריס, 1 מ"מ EDTA ו 505 מ"מ NaCl). מערבבים בעדינות על ידי צינור היפוך.
  3. ספין המדגם ב g × 16,000 בטמפרטורת החדר (ר. ט) במשך 25 דקות.
  4. למחוק את תגובת שיקוע בזהירות, resuspend בגדר במאגר 16 מ מ TB2 בתוספת MgCl. את תגובת שיקוע, בגדר מכילות רצועות הידוק עודף זירז DNA אוריגמי, בהתאמה.
  5. תקופת דגירה המדגם של יום אחד בכל מכשיר הקשר-650 סל ד ב thermomixer. השלב זה עבור resuspension מלאה של ה-DNA אוריגמי.

3. Agarose בג'ל (גיל)

  1. להוסיף 1.6 גרם של agarose ו- 80 מ ל מאגר x TAE 0.5 (20 מ מ טריס, 0.5 מ מ EDTA, חומצה אצטית 10 מ מ, pH 8) לתוך גביע זכוכית להכנת ג'ל agarose 2%. מיקרוגל עבור 5 דק מערבולת בתוכן הספל עבור 1 דקות באמבט מים. הוסף µL 352 של MgCl2 (2.5 מטר) כדי להכין את הג'ל עם 11 מ"מ MgCl2. מראש מכתים את הג'ל עם µL 10 של ה-DNA ג'ל כתם.
  2. יוצקים את הפתרון ג'ל לתוך קופסת ג'ל יבשים ולהוסיף מסרק ג'ל אלקטרופורזה. תן את הפתרון לחזק את מכשיר הקשר למשך 15-30 דקות.
  3. תוספת למאגר פועל (0.5 x מאגר טה) עם 11 מ"מ MgCl2.
  4. לערבב 10-20 µL של המדגם עם 20% 6 x טעינת מאגר (30% (v/v) גליצרול, 0.25% (w/v) bromophenol כחול, 0.25% (w/v) קסילן cyanol FF), ירגישו כמו הבארות ג'ל agarose.
  5. להפעיל את הג'ל 70 V-מכשיר הקשר עבור 2.5 - 3 שעות.
  6. דמיינו את הג'ל עם סורק UV.

4. שלילי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים הכתם (nsTEM)

  1. החל µL 5 של ננו-מבנה מדולל או את polyplex על זוהר-שוחרר מצופים פחמן Cu400 TEM רשת. תן לו לספוח עבור ca. 1 דקות.
  2. ניקוז עודפי נוזלים מן הקצה של הרשת ע י חתיכת נייר סינון.
  3. החל µL 5 של תמיסה מימית uranyl אצטט 2% ולחכות 1 דקות.
  4. משתמש הקצה נייר סינון כדי לרוקן לחלוטין את עודפי נוזלים מן הקצה של הרשת.
  5. תיתן הרשת להתייבש לגמרי לפני הזרקת זה לתוך TEM.

5. Polyplex צורה

הערה: דוגמה להמחשה להכנת polyplex כגון ה-DNA אוריגמי, משקם ב- N/P 0.01-8 יחסי.

  1. לחשב את מספר אמינים לכל polycation באמצעות הנוסחה-1 (טבלה 1).
  2. למדוד את ריכוז מטוהרים אוריגמי הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים אולטרה ויולט ב-260 ננומטר. להשתמש µL 2 טרה-בתים המאגר הריק כדי לכייל את המכונה. לחשב את "nmol של פוספט" באמצעות נוסחה-2.
  3. להכין µL 15 של מבנה ה-DNA אוריגמי כולל nmol 1 של פוספט.
  4. השתמש 3 נוסחה לחישוב הנפח של משקם, אשר נדרש עבור הכנת את polyplex ב- N/P 0.01-8. לדוגמה, כדי להכין את polyplex-N/P 8, µL 1.8 של משקם (0.8 מ"ג/מ"ל) יש צורך (N/P הוא 8 nmol של פוספט הוא 1, המשקל המולקולרי של משקם הוא 5000 g/mol, ריכוז של פתרון מניות משקם 0.8 מ"ג/מ"ל, המספר של אמינים לכל משקם הוא 28). להוסיף µL 13.2 משחפת µL 1.8 של משקם (0.8 מ"ג/מ"ל). להוסיף 15 µL של פתרון משקם (0.8 מ"ג/מ"ל) 15 µL של ה-DNA אוריגמי משלב 5.3 כדי לקבל polyplex אוריגמי-משקם של ה-DNA עם NP 8. Polyplex נוצר באופן ספונטני.
  5. חזור על שלב 5.4 להכין polyplexes-יחסים N/P שונים.
  6. מבצע עידן כמתואר בשלב 3 (איור 1 א'). לכלול את אוריגמי הדי ערומה כמו שליטה.
  7. תמונה של polyplex כפי שמתואר בשלב 4 (איור 2).

    נוסחה-1) מספר קבוצות אמין לכל polycation
    Equation 1

    נוסחה-2) השומה של פוספט
    =Equation 2

    נוסחה-3) נפח (µL) polycations
    =Equation 3

6. decapsulation עם לתוספי סולפט

  1. לחשב את מספר קבוצות sulphate לכל לתוספי סולפט באמצעות נוסחה-4 (טבלה 2).
  2. חישוב הנפח של סולפט לתוספי צורך את decomplexation של polyplex-מראש A / P יחס באמצעות נוסחה-5. A / P לחייב יחס הוא היחס בין קבוצות סולפט polyanion (א) לקבוצות פוספט (P) של ה-DNA אוריגמי. כמות עודפת של סולפט לתוספי יש צורך של decomplexation יעיל של polyplexes (לדוגמה: 500-1, 000). לדוגמה, כדי decomplex את polyplex המוכנים בסעיף 5 (polyplex מכיל nmol 1 של פוספט)-A / P 1000, µL 3.6 של לתוספי סולפט 40 kDa (50 מ"ג/מ"ל) יש צורך (A / P הוא 1000, nmol של פוספט הוא 1, המשקל המולקולרי של לתוספי סולפט הוא 40,000 גר'/מול הריכוז של לתוספי סולפט פתרון מניות הוא 50 מ"ג/מ"ל והוא מספר סולפט 220). להוסיף µL 3.6 של לתוספי סולפט (50 מ"ג/מ"ל) polyplex מהשלב 5.4 ומערבבים היטב.
  3. אם עובד עם polyplex משקם, להוסיף NaOH כדי להקל על התהליך decomplexation. להוסיף NaOH של ריכוז סופי של 10 מ מ. לדלג על שלב זה עבור LPEI polyplexes.
  4. מבצע עידן כמתואר בשלב 3 (איור 1B). כוללים עירום DNA אוריגמי polyplex הפקד.

    נוסחה-4) מספר קבוצות sulphate לכל polyanion =
    Equation 4

    נוסחה-5) ףקיהב לתוספי סולפט (µL)
    =Equation 5

7. יציבות כלפי דלדול מ ג

  1. לשטוף µL 20 של אוריגמי דנ א או את polyplex המתאים (כולל 2 nmol פוספט) עם µL 4 x 600 מ ג-אפס מאגר (5 מ מ טריס, 1 מ"מ EDTA ו- 30 מ מ NaCl) באמצעות העמודה אולטראפילטרציה (MWCO ~ 3 kDa). ספין כל כביסה ב g × 14,000-מכשיר הקשר למשך 3-5 דקות.
  2. לאסוף את הפתרון הנותרים (80 µL), דגירה ב 37 ° C ליום אחד-650 סל ד ב thermomixer.
  3. אם בדיקות LPEI polyplex, להוסיף 2.5 µL MgCl2 (500 מ מ) עבור ריכוז סופי של 16 מ מ MgCl2. לאחר מכן, הוסף µL 7 של לתוספי סולפט-40 kDa (50 מ"ג/מ"ל) (שווה ערך ל A / P 1000) לפענח את ליבת ה-DNA nanostructures (decapsulation, ראו שלב 6).
    הערה: לדלג על שלב זה אם עובד עם polyplex משקם או עירום DNA אוריגמי.
  4. בצע הדמיה nsTEM כפי שמתואר בשלב 3 (איור 2).

8. DNase אני טיטור וזמינותו של עירום DNA אוריגמי Nanostructures

  1. לערבב 3 µL של אוריגמי DNA עירום כולל פוספט nmol 1 עם 2 µL של 10 x DNase אני מאגר (100 מ מ טריס-HCl, 25 מ מ MgCl2, 5 מ מ CaCl2, pH 7.6), µL 1 MgCl2 (250 מ מ), µL 12 מים 0.2 מ ל PCR צינורות. להוסיף 2 µL של DNase אני (10 x). התאם את ריכוז DNase מניות אני (10 x) כדי לקבל DNase הסופית אני ריכוזים של 0.25-2 U/mL.
  2. דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 h ב- thermocycler.
  3. לטבול את דגימות קרח ולבטל את הפעילות חד-תאית על-ידי הוספת 2 µL של 500 מ מ dithiothreitol (DTT) ו- 2.5 µL של EGTA (33 מ מ).
  4. לנתח את הדגימות באמצעות עידן כמתואר בשלב 3.

9. יציבות של Polyplexes לקראת DNase אני

  1. לערבב 4 µL של polyplex (כולל nmol 1 של פוספט, מוכן במלון יחסים N/P שונים) עם µL 1.5 של DNase לי מאגר (10 x), µL 8 של טרה-בתים ו- 1.5 µL של DNase אני (100 U/mL) ב- 0.2 מ ל PCR צינור.
  2. דגירה המדגם במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס thermocycler.
  3. להוסיף 2 µL של proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) לעכל את DNase א תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס thermocycler.
    הערה: במקום עיכול אנזימטי, כימי שחרור משרות של DNase אני על-ידי הוספת µL 1.5 של DTT (500 מ מ) 2 µL של EGTA (33 מ מ) יכול להתבצע.
  4. להוסיף µL 3.6 של לתוספי סולפט-40 kDa (50 מ"ג/מ"ל) (שווה ערך ל A / P 1000) לפענח את ליבת ה-DNA nanostructures.
  5. לבצע גיל כמתואר בשלב 3 (3A איור, איור 3C). לכלול אוריגמי DNA טריים כמו שליטה על מדידה והשוואה בין עוצמות הלהקה על הג'ל.
  6. לסלק את הלהקה על גיל, תמצית אוריגמי DNA על-ידי לחיצה להקפיא עמודה החילוץ בהתבסס על פרוטוקול שסופקו על-ידי הספק.
  7. בצע הדמיה nsTEM כפי שמתואר בשלב 4 (איור 2).

10. יציבות כלפי העובר סרום שור (FBS)

  1. לערבב 4 µL של עירום DNA אוריגמי או שלה polyplex המקביל (כולל nmol 1 של פוספט) עם µL 17 של טרה-בתים + 10% FBS ב 0.2 מ ל PCR צינורות. השתמש FBS המופשרים טרי.
  2. דגירה המדגם-37 הלעפה תרוטרפמט ב הצנטרפוגה תרמי במשך 24 שעות ביממה.
  3. לטבול את הדגימה באמבט קרח.
  4. אם בודקים את polyplex, לבצע את התהליך decapsulation על-ידי הוספת µL 3.6 של לתוספי סולפט-40 kDa (50 מ"ג/מ"ל). בנוסף, להוסיף NaOH אם עובד עם polyplexes משקם (ראה שלב 6.3)
  5. מבצע עידן כמתואר בשלב 3. לכלול את אוריגמי DNA טריים כמו שליטה על מדידה והשוואה בין עוצמות הלהקה על הג'ל.
  6. לסלק את הלהקה על העידן ולחלץ את אוריגמי דנ א לפי עמודה החילוץ של ההקפאה לסחוט.
  7. להוסיף 2 µL של proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) שחולצו DNA אוריגמי הפתרון (20 µL) צינור PCR 0.2 מ"ל. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס thermocycler כדי לעכל חלבונים בסרום חייב את nanostructures.
  8. לשטוף את הדגימה עם 5 x 500 µL של טרה-בתים כולל 16 מ מ MgCl2 באמצעות העמודה ultracentrifugation (MWCO ~ 100 kDa) לשטוף proteinase K (MW ~ 28.9 kDa) משם. ספין כל כביסה ב g × 14,000-מכשיר הקשר למשך 3-5 דקות.
  9. לבצע הדמיה nsTEM כפי שמתואר בשלב 4 (איור 3).
    הערה: המדגם שחולצו ג'ל מהשלב 10.6 עשויה ישירות לשמש עבור הדמיה nsTEM. אולם, ההדמיה יכולה להיות מאתגרת מאוד בשל הקובץ המצורף של חלבונים בסרום nanostructures אוריגמי הדנ א. לכן, טיפול proteinase K (שלבים 10.7-10.9) מומלץ להקל על תהליך ההדמיה.

11. בדיקה של מיעון של חזרת Peroxidase האנזים (HRP)-functionalized DNA אוריגמי עם ציפוי עם Polycations

  1. לטהר את עצמי שהורכב biotinylated-ע נ (ביוטין-NR) כפי שמתואר בשלב 2.
  2. דגירה µL 200 של ביוטין מטוהרים-NR (36 nM, ב- 16 מ"מ בתוספת מאגר טרה-בתים) עם 200 µL של streptavidin מצומדת HRP (540 nM, במאגר טרה-בתים). להוסיף 4.8 µL של MgCl2 (500 מ מ) ריכוז סופי של 14 מ מ. דגירה-ר. ט במשך 12 שעות ב- 650 סל ד ב thermomixer
  3. לטהר HRP-functionalized ע נ (HRP-NR) על ידי שיטת טיהור פג (כפי שמתואר בשלב 2) כדי להסיר את אנזימי HRP לא מאוגד. Resuspend את precipitated HRP-NR ב כולל 16 מ מ MgCl2טרה-בתים.
  4. µL 6.5 שילוב של מטוהרים HRP-ע נ (36 ננומטר) עם 6.5 µL של polycations של variant ריכוזים כדי להכין את polyplex ב- N/P יחס של 1, 2, 4, 10 ו- 20 (באמצעות נוסחה 3).
  5. חזור על הצעדים 11.2 11.4 NR הלא-biotinylated. כאשר האנזים HRP עלול להיקשר הלא ספציפית ל DNA אוריגמי, אוריגמי DNA שאינם biotinylated, אשר מטופלת עם אנזימי HRP ופג מטוהרים (בדומה ביוטין-NR), ישמש פקד וזמינותו.
  6. µL 6.5 תערובת של מים מזוקקים עם 6.5 µL של polycations של variant ריכוזים התואם יחס N/P מוגדר של 1, 2, 4, 10 ו- 20. תזות דגימות לשמש הקבוצה הריקה.
  7. להוסיף את הפתרון מוכן בשלבים 11.4-11.6 (12.5 µL) צלחת 96-ובכן כולל 72.5 µL HEPES מאגר (25 מ מ HEPES, 20 מ מ אשלגן כלורי, 200 מ"מ NaCl, 0.05% טריטון X-100, דימתיל סולפוקסיד 1%, pH 7.4) ומערבבים היטב.
  8. להוסיף 10 µL של 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 מ מ).
  9. מוסיפים 5 µL של2O H2 (12 מ"מ) ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. H2O2 יוזם את התגובה.
  10. למדוד את ספיגת-421 nm מעל 4 שעות עם קורא כינוייהם צלחת (איור 4A).

12. בדיקה של מיעון של המין-איגוד Aptamers (HBA)-functionalized DNA אוריגמי עם ציפוי עם Polycations

  1. לטהר את HBA functionalized-ע נ (HBA-NR) כפי שמתואר בשלב 2. Resuspend HBA precipitated-ע נ ב TB בתוספת 6 מ מ MgCl2 (גבוה יותר ריכוז המלחים מוביל המצבור של HBA-NR).
  2. מיקס 10 µL של HBA-NR (40 ננומטר) עם 10 µL של polycations-ריכוז משתנות כדי להכין polyplex של מוגדר N/P יחס של 1, 2, 10 ו- 20.
  3. מיקס 10 µL של עירום-NR (40 ננומטר) או מים מזוקקים עם 10 µL של polycations בריכוזים שונים המתאימים N/P יחס של 1, 2, 10 ו- 20.
  4. הוסף את הפתרון µL 20 מוכן שלבים 12.2 ו- 12.3 לצלחת 96-ובכן כולל µL 60 HEPES מאגר (25 מ מ HEPES, 20 מ מ אשלגן כלורי, 200 מ"מ NaCl, 0.05% טריטון X-100, דימתיל סולפוקסיד 1%, pH 7.4) ומערבבים היטב. כוללים לדוגמה ריק אחד לפחות החלפת 20 µL polyplex או polycation הפתרון (מתוך שלבים 12.2 ו- 12.3) עם מים.
  5. להוסיף 5 µL של המין (0.04 מ מ) ואחריו 10 µL של ATBS (15 מ מ). מניחים את הצלחת על תפקודי לב / נשימה במשך 5 דקות.
  6. מוסיפים 5 µL של2O H2 (12 מ"מ) ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  7. למדוד את ספיגת-421 nmover 30 דקות עם הקורא כינוייהם צלחת (איור 4B).

Representative Results

שלושה nanostructures אוריגמי הדנ א של תצורות שונות עוצבו, כולל nanorod (ע נ), nanobottle (NB), עם מסגרת תיל ננו-מבנה (WN) (דגמי תלת-ממד של nanostructures מומחשים איור 2). את ע נ ו את NB תוכננו בהתבסס על סריג חלת דבש סקוור, בהתאמה, באמצעות caDNAno17 ו את WN נוצרה באמצעות תוכנה דדלוס18. פרוטוקול מקיף על העיצוב, הרכבה עצמית של ה-DNA nanostructures כבר פורסם כבר19,20,21,22. להדק צורה ספציפית גדילי היו הורה, התאספו עצמית וטיהרו נוספות בהתבסס על פרוטוקול מתוארת על ידי שטל ואח. 23 (שלב 2).

Polyplexes התאפיינו ג'ל פיגור assay והדמיה nsTEM. על ערבוב אוריגמי DNA עם polycations, נצפתה משמרת בלהקה עירום ננו-מבנה כלפי הקתודה (איור 1א'). זאת ניתן לייחס לניסיוני אישום שלילי של פוספט קבוצות על איגוד polycations והגודל הכולל עלייה של המתחם. הוספת סכום נוסף של polyanions כגון לתוספי סולפט, באפשרותך להפוך את היווצרות polyplex. בהקשר זה, סולפט לתוספי משקל מולקולרי גבוה יותר (MW ~ 40 kDa) הראה תהיה יעילה decomplexation לעומת נמוך משקל מולקולרי לתוספי סולפט (MW ~ 4 kDa) (איור 1B).

תוך הדמיה LPEI polyplexes על ידי uranyl אצטט שלילי הכתם TEM, זה היה קשה לשיקוף כל החלקיקים. זה היה שיערו LPEI הזה עלול לעכב אצטט uranyl מ מחייב לשדרת פוספט עקב מיגון חזק של ה-DNA אוריגמי. לכן, לפני nsTEM הדמיה, כמות עודפת של סולפט לתוספי נוספה LEPI polyplexes. Nanostructures אוריגמי הפרומים דנ א הראה שום סימן של פגם או ריקבון. להפך, משקם polyplexes היו בהצלחה עם תמונה ללא צורך polyanion טיפול (איור 2).

כל עירום DNA nanostructures (ללא התחשבות תצורות שונות שלהם) היו denatured לחלוטין אחרי יום אחד של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במאגר Mg-אפס, כפי שאושר על-ידי הדמיה nsTEM. לעומת זאת, nanostructures מצופה LPEI או משקם ב- N/P≥1 נותרו על כנן. באופן דומה, DNase אני טיטור מבחני הראה את הרגישות של nanostructures לא מוגן כלפי עיכול אנזימטי. בעוד nanostructures ערומה לגמרי היו מתעכל בנוכחות 1 DNase U/mL אני לאחר 2 h, LEPI או משקם אנקפסולציה אוריגמי DNA נשאר ללא שינוי מאגר אפס מ"ג בתוספת DNase U/mL 10 אני למשך תקופה מינימלית של יום אחד (איור 2). יציבות גבוהה יותר לקראת עיכול חד-תאית הושג על-ידי הגדלת שיעור N/P polyplexes. בנוסף, LPEI מגן nanostructures DNA יותר ביעילות לעומת משקם (איור 3א, איור 3C), כנראה עקב הצפיפות תשלום גבוה יותר של LEPI, וכך, זיקה חזקה יותר לכיוון ה-DNA24 . אין הבדל נצפתה תוך שימוש LPEI של משקל מולקולרי שונה (איור3B).

מיעון של קבוצות פונקציונליות ב- DNA nanostructures לאחר אנקפסולציה בתוך שריון פולימרי היא תכונה חשובה. יתר על כן, התאימות של ציפוי polycation עם חזרת peroxidase אנזים (HRP), מחייב המין aptamers (HBA) functionalized DNA אוריגמי נבדק. והחינמית סיכות biotinylated היו וצווארי מפני השטח של נאט ו, ואז functionalized עם streptavidin HRP מצומדת (שלושה אנזימים אוריגמי דנ א). פעיל catalytically ביותר (Kd: 439 ננומטר) HBA aptamer PS2. מ' (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') נבחרה עבור ניסויים אלה25. עד 24 רצועות הידוק היו וצווארי מהמשטח NR עם מקשר (linker) אורך 5-nm (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') ואחריו את PS2. רצף מ' (24 aptamers אוריגמי דנ א). ללא מעצורים יוצא דופן של אנזימטי או פעילות aptamer נצפתה על ציפוי דנ א functionalized HRP או HBA אוריגמי עם LPEI, משקם ב- N/P משתנה יחסי (איור 4A-B)16. עם זאת, קינטי של האנזים HRP באופן דרמטי השתנה לאחר איגוד אוריגמי דנ א (איור 4C).

Figure 1
איור 1 : גיל נציג תמונות של היווצרות polyplex ו- decapsulation. (א) electrophoretic ניידות shift וזמינותו של NB מעורבב עם משקם ב- N/P יחס של 0.01-8. כל ליין מכיל 1 nmol NB. במסלול הראשון הוא ההתייחסות NB. Decapsulation (B) של polyplexes על ידי polyanionic לתוספי סולפט (DS). איור זה השתנה מ שפורסמו בעבר איור16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : כתם שלילי micrographs TEM של ה-DNA אוריגמי, polyplexes. Micrographs תלת-ממד מודל, nsTEM של ה-DNA עירום אוריגמי nanostructures (עמודים 1 ו- 2). micrographs nsTEM LPEI polyplexes (לאחר decapsulation), polyplexes משקם (עמודות 3 ו- 4). nsTEM תמונות של עירום ומוגן DNA אוריגמי (polyplex) נתון דלדול Mg (עמודות 5, 6 ו-7), השפלה אנזימטי (עמודות 8 ו-9), סרום עיכול (עמודות 10 ו-11) ליום אחד ב 37 º C. LPEI-5 kDa היה בשימוש זה וזמינותו. עירום DNA nanostructures היו השפיל מעבר איתור על עידן בנוכחות DNase U/mL 1 אני או טרה-בתים + 10% FBS לאחר שעתיים של דגירה ב 37 º C. גודל ברים: 100 ננומטר. איור זה השתנה מ שפורסמו בעבר איור16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : תוצאות נציג DNase אני מבחני הגנה. (א) DNase אני assay הגנה עבור polyplexes של WN עם kDa LPEI-5, LPEI-10 kDa kDa LPEI-25 מוכן ב- N/P יחס של 2, 4, 8 ו-10. הדגימות היו נתונים DNase U/mL 10 אני במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס. השביל האחרון הוא הפקד מהסכנה. Polyplexes היו decapsulated לפני טעינה אל הג'ל. (B) עוצמת הלהקה רשע מנורמלת עבור polyplexes של ה-DNA origamis עם שונה LPEI מופק גיל תמונה-א ציר Y מייצג הלהקה רשע מנורמל בעוצמה. DNase ה (ג) אני מוכן הגנה וזמינותו של polyplexes משקם-WN ב- N/P יחס של 1, 2, 4, 10 ו- 20. הדגימות היו נתונים DNase U/mL 10 אני במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס. ליין 6 הוא polyplex הבקרה (N/P 20). השביל האחרון הוא הפקד מהסכנה. כל polyplexes משקם היו decapsulated טעינה מוקדמת אל הג'ל. איור זה השתנה מ שפורסמו בעבר איור16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נציג התוצאות של מבחני אוריגמי DNA ערכי צבע מוחלטים אנזים - ו aptamer-functionalized. (א) וזמינותו ערכי צבע מוחלטים של functionalized-אנזים nanostructures (HRP-NR) מצופה משקם 3.7 h בתחילת התגובה. (B) assay ערכי צבע מוחלטים של aptamer-functionalized nanostructures (HBA-NR) מצופה משקם, 6 דקות לאחר החניכה התגובה. ציר Y מייצג את ספיגת מנורמל. (ג) ניטור וזמינותו ערכי צבע מוחלטים של HRP, HRP-NR לאורך זמן. איור זה השתנה מ שפורסמו בעבר איור16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פולימרים cationic משקם KDa LPEI-5 KDa LPEI-10 LPEI-25 kDa
משקל מולקולרי של פולימר (kDa) 5 5 10 25
משקל Molecualr של מונומר (g/mol) 161 43 43 43
מספר אמין לכל מונומר 1 1 1 1
מספר אמין לכל פולימר 28 116 232 581

טבלה 1. חישוב של מספר קבוצות אמין לכל polycation.

משקל מולקולרי של לתוספי סולפט (kDa) 4 40
המשקל המולקולרי של מונומר (g/mol) 366 366
מספר sulphate לכל מונומר 2 2
מספר sulphate לכל פולימר 22 220

בטבלה 2. חישוב של מספר קבוצות sulphate לכל polyanion.

Discussion

ב הרכבה עצמית של ה-DNA אוריגמי, גדילים סיכות בדרך כלל מתווספות יחס עודף של 5-10 לגרדום. אלה גדילי הידוק עודף גם לאגד polycation ואת טופס polyplexes בטווח monometer אשר עוד יותר קשה להיפרד מ- DNA אוריגמי polyplexes. ומכאן, שלב קריטי במבנה polyplex הוא להסיר את הגדילים הידוק עודף ולהשתמש nanostructures אוריגמי DNA מטוהרים היטב.

פותחו שיטות אחרות לייצוב DNA nanostructures כמו cyclization של גדילי הדנ א באמצעות תגובת לחץ26. אלקין - ו אזיד-השתנה גדילי סיכות נדרשים להיווצרות מושחלות חד-גדילי, טכניקה זו מוגבל לייצוב קטן nanostructures כזה catenane ה-DNA, זה לא ברצון מדרגי אוריגמי דנ א גדולים יותר מבנה כגון אלו המשמשים פרוטוקול זה. לאחרונה, Gerling ואחל'27 דיווח שיטה ליצירת קשרי ערכיות cyclobutene פירימידין דיימר (שיקגו) קשרים בין thymidines השכנות בתוך הדנ א nanostructures באמצעות הקרנה על-סגול. למרות ששיטה זו הוא אתר סלקטיבית ומדרגי, היעילות שלה בהגנה על ה-DNA אוריגמי הוא הרבה יותר ציפוי polycation נמוך. לדוגמה, אובייקטים אוריגמי DNA מיוצב רופאות לסבול רק 0.4 DNase U/mL אני לשעה בעוד polyplexes היו יציבים בנוכחות DNase U/mL 10 אני ליום אחד לפחות.

בקצרה, ריפוי גנטי בהשראת משקם, ציפוי LPEI בעלות נמוכה, צעד אחד ושיטת יעיל לפנות את היציבות לטווח ארוך של DNA nanostructures אוריגמי בתקשורת מדולדל מ"ג ו נוקלאז עשיר. הפיכות של היווצרות polyplex מקלה על היישום שלה ב בדיקות אבחון רב שלבי, שבו ההגנה של ה-DNA אוריגמי נגד חד-תאית השפלה או מלח-דלדול חיונית בשלב אחד אך עלול לגרום לבעיות בשלבים אחרים כגון ה-DNA הגברה. בנוסף, ציפוי polycation היא גישה פוטנציאל לשיפור ספיגת הסלולר של ה-DNA nanostructures אוריגמי עבור סמים-מסירה יישומים28.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים הקשורים בדו ח זה.

Acknowledgments

הפרויקט קיבל מימון אופק 2020 תוכנית של האיחוד האירופי מחקר וחדשנות תחת גרנט הסכם מס 686647. תמונות TEM נרשמו ביום Morgagni פעלו 80 kV במתקן EM של וינה Biocenter הליבה מתקנים GmbH (VBCF). ברצוננו להודות Tadija Kekic לסיוע ב- Elisa דה LIano ועיצוב גרפי לעיצוב של ננו-מבנה מסגרת תיל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10× DNase I reaction buffer New England Biolab (NEB) B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) Alfa Aesar J65535
Amicon ultracentrifugation columns Merck Millipore UCF500308, UCF510024
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide Sigma-Aldrich 523682
Design-specific staple strands Integrate DNA Technologies (IDT)
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) Sigma-Aldrich 75027
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) Sigma-Aldrich 42867
DNA gel loading dye (6×) ThermoFischer sceintific R0611
DNase I (RNase free) New England Biolab (NEB) M0303
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) Sigma-Aldrich EDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Biorad 7326165
Hemin Sigma-Aldrich H9039
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) Sigma-Aldrich 216763
LPEI-25 kDa Polysciences, Inc 23966-1
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) ThermoFischer sceintific NP0004
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) Carl Roth O263.1
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 Sigma-Aldrich 765090
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 Sigma-Aldrich 764582
Proteinase K solution (20 mg/ml) ThermoFischer sceintific AM2548
Streptavidin-conjugated HRP ThermoFischer sceintific N100
SYBER safe DNA gel stain ThermoFischer sceintific S33102

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond. Science. 347 (6224), 1260901 (2015).
  2. Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  3. Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites. Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).
  4. Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).
  5. Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
  6. Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
  7. Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
  8. Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture. ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).
  9. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress. The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).
  10. Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. Gene therapy and DNA delivery systems. International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  12. Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation. Nature Communication. 8, 15654 (2017).
  13. Agarwal, N. P., Matthies, M., Gür, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami. Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).
  14. Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., Järvihaavisto, E., Mikkilä, J., Tenhu, H., Nonappac,, Kostiainen, M. A. Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates. Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).
  15. Perrault, S. D., Shih, W. M. Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability. ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).
  16. Ahmadi, Y., De Llano, E., Barišić, I. (Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures. Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).
  17. Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
  18. Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6293), 1534 (2016).
  19. Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
  20. Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).
  21. Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).
  22. Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles. Journal of Visualized Experiment. (99), May 52486 (2015).
  23. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  24. Grigsby, C. L., Leong, K. W. Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).
  25. Li, T., Dong, S., Wang, E. G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work. Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).
  26. Cassinelli, V. 1, Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).
  27. Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies. Science Advances. , 1157 (2018).
  28. Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).

Tags

כימיה גיליון 143 אוריגמי דנ א polyplex ייצוב ארוכי טווח חד-תאית השפלה ריפוי גנטי functionalization
ריפוי גנטי בהשראת Polycation ציפוי הגנה על ה-DNA אוריגמי Nanostructures
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy … More

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures. J. Vis. Exp. (143), e58771, doi:10.3791/58771 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter