여기, 키토 산 천연 양이온 다 당 류 및 합성 선형 polyethyleneimine (LPEI) 코팅을 사용 하 여 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures의 보호를 위한 프로토콜 제공 됩니다.
DNA 종이 접기 nanostructures 생물학 및 의료 응용 프로그램에 사용할 수 있는 엄청난 잠재력을 보유. 그러나, 낮은 소금 조건과 생리 적 체액에서 nucleases 유도 자기 조립된 DNA nanostructures의 저하 및 변성. 비 바이러스 성 유전자 전달, DNA의 효소 저하 양이온 셸에서 부정 청구 DNA의 캡슐화에 의해 극복 이다. 여기, 유전자 배달 발전, 단순 하 고에 의해 영감을 한 단계 및 강력한 방법론은 제시한 DNA 종이 접기 nanostructures의 안정화에 대 한 chitosan와 선형 polyethyleneimine 코팅. Polycation 코팅 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures를 효율적으로 보호합니다. 이 메서드는 또한 DNA nanostructures의 효소 및 aptamer 기반 기능화의 전체 접근성을 유지합니다.
DNA는 자기 조립 나노 구조1의 프로그래밍에 대 한 다양 한 빌딩 블록 이다. DNA nanostructures를 만들기 위한 가장 인기 있는 방법은 DNA 종이 접기 기술에 근거 하는 자기 조립 긴 원형, 단일 좌초 된 DNA의 짧은 모양 결정 합성 스테이플의 수백의 도움으로 비 계2가닥. 오늘, 거의 모든 형상과 형태에서 DNA nanostructures의 생성은 쉽게 가능 합니다. DNA nanostructures 높은 정밀도3,4 site-specifically functionalized 수 고 allosteric 구조적 변화5,6을 프로그래밍할 수 있습니다. 따라서, DNA를 사용 하 여 건축 자재로 바이오 센 싱, 진단 및 약물 전달에 응용 프로그램, 프로그래밍 가능 하 고 반응이 맞춤형 nanostructures를 만드는 독특한 기회를 제공 합니다. 그러나, DNA nanostructures는 엑 소-및 엔도소화에 취약-nucleases, 및 격자 기반 3D DNA 종이 접기 nanostructures 일반적으로 높은 염 분 버퍼 필요 (예., 5-20 m m Mg+ 2)을 유지 하기 위해 그들의 무결성7,8.
Nucleases 혈액과 세포 외 매트릭스에 의해 DNA의 급속 한 저하 효율적인 vivo에서 납품에 유전자 제품의 셀9에 중요 한 장애 이다. 비 바이러스 성 유전자 전달에서이 제한을 극복 하기 위해 DNA는 정의 된 충전 N/P 비율 (DNA에서 인산 염을 polycation에 있는 아민의 비율)10에서 양이온 폴리머 혼합입니다. 양이온 중합체, polyplex로 알려진 DNA의 복합 nuclease 중재 저하에서 DNA를 보호 하 고 그것의 세포질 통풍 관11를 향상 시킵니다. 유전자 전달 발전, oligolysine12, oligolysine-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 공중 합체13, 폴 리 (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)에 의해 영감-기반 고분자14및 바이러스 capsid 단백질15 DNA 종이 접기 nanostructures 안정화에 대 한 사용 되었습니다.
최근, 우리 DNA 종이 접기 nanostructures Mg 소진에 보호 하는 방법을 보고 하 고 천연 양이온 다 당 류 키토 산 및 합성 선형 polyethyleneimine (LPEI)를 사용 하 여 nuclease 리치 미디어는 보고16. 이 문서는 우리의 이전 작품의 적응 이다 하 고 polyplexes, 그들의 특성, 낮은 소금 및 nuclease 리치 미디어에서 적나라 하 고 보호 nanostructures의 안정성 테스트 및 검사의 준비에 대 한 자세한 프로토콜에 설명 합니다는 polycation 코팅 시 효소 및 aptamer 기능성된 DNA 종이 접기 nanostructures의 접근성.
에 자기 조립 DNA 종이 접기의 주식 물가 일반적으로 추가 5-10 초과 비율에 발판. 이러한 초과 주식 가닥도는 polycation 및 polyplexes monometer 범위에서 DNA 종이 접기 polyplexes에서 분리 하기가 더는 바인딩할. 따라서, polyplex 형성에 중요 한 단계는 초과 주식 가닥을 제거 하 고 잘 순화 된 DNA 종이 접기 nanostructures 사용입니다.
다른 방법은 통해 클릭 반응26DNA 가닥의 cyclization 같은 DNA nanostructures 안정화에 대 한 개발 되었습니다. 이 기술은 작은 nanostructures 같은 DNA catenane의 안정화에 대 한 제한 되며 그것은 쉽게 큰 DNA 종이 접기에 대 한 확장 가능한 주식 가닥 alkyne 아 지 드 수정 연동된 단일 가닥 링의 대형을 위한 필요는, 이 프로토콜에 사용 된 같은 구조. 최근, Gerling 동부 표준시는l.27 보고 DNA nanostructures 자외선 방사선 조사를 사용 하 여 내 이웃 thymidines 사이 화학식 cyclobutene pyrimidine 이합체 (일일) 채권을 만들기 위한 방법. 비록이 방법 사이트 선택 하 고 확장 가능한 DNA 종이 접기 보호의 효율은 polycation 코팅 보다 훨씬 낮은. 예를 들어 일일 비용 안정화 DNA 종이 접기 개체 견딜만 0.4 U/mL DNase 내가 1 시간 동안 polyplexes 안정 10 U/mL DNase 존재 나 적어도 하루에 대 한.
간단히, 유전자 치료 영감 키토 산 및 LPEI 코팅은 낮은-비용, 단계 및 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures의 장기 안정성을 해결 하기 위해 효율적인 방법. Polyplex 대형의 가역 다단계 진단 테스트 nucleolytic 저하 또는 소금 고갈에 대 한 DNA 접기의 보호 한 단계에서 매우 중요 하지만 다른 DNA 단계에서 문제가 발생할 수 있습니다에서 응용 프로그램을 용이 하 게 증폭입니다. 또한, polycation 코팅은 약물 전달 응용 프로그램28DNA 종이 접기 nanostructures의 세포질 통풍 관을 강화 하기 위한 잠재적인 접근 이다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트는 부여 계약 번호 686647에서 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램에서 자금을 받았다. 가장 이미지 Morgagni 80에서 운영 하는에 기록 되었다 kV EM 시설에서 비엔나 Biocenter 코어 시설 GmbH (VBCF는)의. 우리는 와이어 프레임 nanostructure 디자인 그래픽 디자인 및 Elisa 드 LIano에 Tadija Kekic 감사 하 고 싶습니다.
10× DNase I reaction buffer | New England Biolab (NEB) | B0303 | |
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) | Alfa Aesar | J65535 | |
Amicon ultracentrifugation columns | Merck Millipore | UCF500308, UCF510024 | |
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide | Sigma-Aldrich | 523682 | |
Design-specific staple strands | Integrate DNA Technologies (IDT) | ||
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) | Sigma-Aldrich | 75027 | |
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) | Sigma-Aldrich | 42867 | |
DNA gel loading dye (6×) | ThermoFischer sceintific | R0611 | |
DNase I (RNase free) | New England Biolab (NEB) | M0303 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) | Sigma-Aldrich | EDS | |
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | Biorad | 7326165 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) | Sigma-Aldrich | 216763 | |
LPEI-25 kDa | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) | ThermoFischer sceintific | NP0004 | |
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) | Carl Roth | O263.1 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 | Sigma-Aldrich | 765090 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 | Sigma-Aldrich | 764582 | |
Proteinase K solution (20 mg/ml) | ThermoFischer sceintific | AM2548 | |
Streptavidin-conjugated HRP | ThermoFischer sceintific | N100 | |
SYBER safe DNA gel stain | ThermoFischer sceintific | S33102 |