Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Genterapi inspirert Polycation belegg for beskyttelse av DNA Origami nanostrukturer

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58771
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

Summary

Her vises en protokoll for beskyttelse av DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rik media med naturlig kationisk polysakkarid chitosan og syntetisk lineær polyethyleneimine (LPEI) belegg.

Abstract

DNA origami nanostrukturer holder en enorme potensial som skal brukes for biologisk og medisinsk bruk. Men indusere lav-salt forhold og nucleases i fysiologiske væsker rødsprit og nedbrytning av selv montert DNA nanostrukturer. I ikke-viral gen levering overvinnes enzymatisk degradering av DNA ved innkapsling av negativt ladde DNA i et kationisk skall. Her, inspirert av genet levering fremskritt, en enkel, ettrinns og robust metode presenteres for stabilisering av DNA origami nanostrukturer av belegg dem med chitosan og lineær polyethyleneimine. Det polycation belegget beskytter effektivt DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rik media. Denne metoden bevarer også full adresserbarhet av enzym - og aptamer-baserte functionalization av DNA nanostrukturer.

Introduction

DNA er en allsidig byggekloss for programmerbare selvstendig montering av nanoskala strukturer1. Den mest populære metoden for å lage DNA nanostrukturer er DNA origami teknikken, som er basert på det selv-montering av en lang runde, enkelt strandet DNA stillaset ved hjelp av hundrevis av kortere figur-bestemme syntetiske stift tråder2. I dag, er etableringen av DNA nanostrukturer nesten alle geometri og morfologi lett mulig. DNA nanostrukturer kan være site-specifically functionalized med høy presisjon3,4 og kan programmeres til å gjennomgå allosteric conformational endringer5,6. Derfor bruker DNA som byggemateriale, har en unik mulighet til å opprette programmerbare og responsive spesialdesignede nanostrukturer for programmer i biosensing, diagnostikk og narkotika-leveranser. DNA nanostrukturer er imidlertid utsatt for fordøyelsen av exo- og endo-nucleases og gitter-basert 3D DNA origami nanostrukturer krever vanligvis hřy salinitet buffere (f.eks., 5-20 mM Mg2) å opprettholde deres integritet7,8.

Rask nedbrytning av DNA ved nucleases finnes i blod og ekstracellulær matrix er en stor utfordring for effektiv i vivo levering av genetisk produkter i celler9. For å overkomme denne begrensningen i ikke-viral gen levering, er DNA blandet med en kationisk polymer på en definert N/P kostnad forholdet (forholdet mellom aminer i polycation til fosfater i DNA)10. Komplekset av DNA med en kationisk polymer, kjent som polyplex, beskytter DNA fra nuclease-mediert fornedrelse og forbedrer sin mobilnettet opptak11. Inspirert av genet levering fremskritt, oligolysine12, oligolysine-polyethylene glycol (PEG) copolymers13, poly (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-baserte polymerer14og virus kapsid proteiner15 har blitt brukt for stabilisere DNA origami nanostrukturer.

Nylig vi rapportert en metode for beskyttelse av DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rike medier ved hjelp av naturlige kationisk polysakkarid chitosan og syntetisk lineær polyethyleneimine (LPEI) ble rapportert16. Denne artikkelen er en tilpasning av våre tidligere arbeid og beskriver detaljert protokollen for utarbeidelsen av polyplexes, deres karakterisering, teste stabiliteten i naken og beskyttet nanostrukturer i lav-salt og nuclease-rik media og undersøker den adresserbarhet av enzym - og aptamer-functionalized DNA origami nanostrukturer på polycation belegg.

Protocol

1. klargjør Polycation lager løsning

  1. LPEI lager løsning
    1. Legge til 10 mg av LPEI i en glass kanne inneholder < 10 mL av H2O.
    2. For å løse LPEI, legge HCl (32%) til å nå pH 2.0.
    3. Justere pH 7.0 ved å legge NaOH (10 M).
    4. Juster volumet til det siste konsentrasjonen av 1 mg/mL.
    5. Filtrer LPEI lager løsningen gjennom en 0.22 µm membran.
  2. Chitosan lagerløsning
    1. Oppløse 16,6 mg av chitosan oligosaccharide laktat (Mw ~ 5 kDa, 60% oligosaccharide komposisjon, deacetylated fra chitin med 90%) i 1 mL av eddiksyre (10%) vandige media å forberede en lagerløsning med en konsentrasjon av 10 mg/mL.

2. rensing av DNA Origami nanostrukturer

  1. Mix 100 µL av DNA origami utvalget (5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl buffer (betegnet som TB) inkludert 18 mM MgCl2) med tilsvarende volumet av 22 mM MgCl supplert2 TB (100 µL) i en 1,5 mL tube.
  2. Legge til 200 µL av rensing buffer (15% (w/v) pinne 8000, 5 mM Tris, 1 mM EDTA og 505 mM NaCl). Bland forsiktig ved tube inversjon.
  3. Spinne prøven 16.000 × g ved romtemperatur (r.t.) for 25 min.
  4. Forkast nedbryting nøye og resuspend pellet 16 mM MgCl2 supplert TB buffer. Nedbryting og pellet inneholder overflødig stift tråder og utfelt DNA origami, henholdsvis.
  5. Inkuber prøven for en dag r.t. på 650 rpm i en thermomixer. Dette trinnet er for resuspendering av DNA origami.

3. Agarose Gel geleelektroforese (alder)

  1. Legge til 1.6 g av agarose og 80 mL 0,5 x TAE buffer (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 10 mM eddiksyre, pH 8) i et glass beaker å forberede en 2% agarose gel. Mikrobølgeovn for 5 min. Swirl innholdet begeret i 1 min i et vannbad. Legg 352 µL av MgCl2 (2,5 M) å forberede gel med 11 mM MgCl2. Før flekken gel med 10 µL av DNA gel flekken.
  2. Hell gel løsningen i en tørr gel boks og sette en gel geleelektroforese kam. La løsningen stivne på r.t. i 15-30 min.
  3. Supplere kjører buffer (0,5 x TAE buffer) med 11 mM MgCl2.
  4. Bland 10-20 µL av utvalget med 20% av 6 x lasting buffer (30% (v/v) glyserol, 0,25% (w/v) bromophenol blå, 0,25% (w/v) xylen cyanol FF) og laste den inn i agarose gel brønnene.
  5. Kjøre gel på 70 V på r.t. for 2,5 - 3 h.
  6. Visualisere gel med en UV-skanner.

4. negative flekken overføring elektronmikroskop (nsTEM)

  1. Bruk 5 µL av fortynnet nanostructure eller polyplex en glød-utladet karbon-belagt Cu400 TEM rutenett. La det adsorberes for ca. 1 min.
  2. Drain overflødig væske fra kanten av rutenettet av filter papir.
  3. Bruke 5 µL av en 2% uranyl acetate vandig løsning og vente 1 min.
  4. Bruk filter papir kanten for å tømme helt overflødig væske fra kanten av rutenettet.
  5. La rutenettet tørke før injisere det i TEM.

5. Polyplex-formasjonen

Merk: Illustrerende eksempel for å forberede en polyplex bestående av DNA origami og chitosan på N/P 0,01-8 prosenter.

  1. Beregne antall aminer per polycation ved hjelp av Formel-1 (tabell 1).
  2. Måle konsentrasjonen av renset DNA origami bruker en ultra violet spektrofotometer på 260 nm. Bruke 2 µL TB bufferen samt blank for å kalibrere maskinen. Beregne "nmol av fosfat" bruker formel-2.
  3. Forberede 15 µL av DNA origami inkludert 1 nmol av fosfat.
  4. Bruk formel-3 til å beregne volumet av chitosan, som kreves for å forberede polyplex på N/P 0,01-8. For eksempel for å forberede polyplex N/P 8, 1,8 µL av chitosan (0,8 mg/mL) er nødvendig (N/P er 8, nmol av fosfat er 1, molekylvekt av chitosan er 5000 g/mol, konsentrasjonen av chitosan lagerløsning er 0,8 mg/mL og aminer per chitosan er 28). Legge til 13,2 µL av TB 1,8 µL av chitosan (0,8 mg/mL). Legge til 15 µL av kitosan løsning (0,8 mg/mL) 15 µL av DNA origami fra trinn 5.3 å få en DNA origami-chitosan polyplex med NP 8. Polyplex er dannet spontant.
  5. Gjenta trinn 5.4 å forberede polyplexes på forskjellige N/P forhold.
  6. Utfør en alder som beskrevet i trinn 3 (figur 1A). Inkluder den nakne DNA origami kontroll.
  7. Bilde av polyplex som beskrevet i trinn 4 (figur 2).

    Formel 1) antall Amin grupper pr. polycation
    Equation 1

    Formel-2) Molo med fosfat
    =Equation 2

    Formel-3) Volum (µL) av polycations
    =Equation 3

6. utpakking med dekstran sulfat

  1. Beregne antall sulfat grupper pr. dekstran sulfat bruker formel-4 (tabell 2).
  2. Beregne volumet av dekstran sulfat trengs for decomplexation av polyplex på en A / P forholdet ved hjelp av formel-5. A / P lade forholdet er forholdet mellom sulfat gruppene med polyanion (A) til fosfat grupper (P) av DNA origami. Mye dekstran sulfat er nødvendig for en effektiv decomplexation for polyplexes (f.eks 500-1000). For eksempel å decomplex polyplex forberedt i del 5 (polyplex inneholder 1 nmol av fosfat) på A / P 1000, 3,6 µL av dekstran sulfat 40 kDa (50 mg/mL) er nødvendig (A / P er 1000, nmol av fosfat 1, molekylvekt av dekstran sulfat 40.000 g/mol konsentrasjonen av dekstran sulfat lagerløsning er 50 mg/mL og sulfat er 220). Legge til 3,6 µL av dekstran sulfat (50 mg/mL) av polyplex fra trinn 5.4 og bland godt.
  3. Hvis arbeider med en chitosan polyplex, legge NaOH for å forenkle decomplexation prosessen. Legge NaOH for en siste konsentrasjon av 10 mM. Hoppe denne steg for LPEI polyplexes.
  4. Utfør en alder som beskrevet i trinn 3 (figur 1B). Inkluder naken DNA origami og polyplex som kontroll.

    Formel-4) antall sulfat grupper pr. polyanion =
    Equation 4

    Formel-5) Volum (µL) på dekstran sulfat
    =Equation 5

7. stabilitet mot Mg uttømming

  1. Vask 20 µL av en DNA origami eller den tilsvarende polyplex (inkludert 2 nmol fosfat) med 4 x 600 µL Mg null bufferen (5 mM Tris, 1 mM EDTA og 30 mM NaCl) bruke kolonnen ultrafiltrasjon (MWCO ~ 3 kDa). Spinn hver vask 14.000 × g på r.t. for 3-5 minutter.
  2. Samle de gjenværende løsningen (80 µL) og ruge på 37 ° C for en dag på 650 rpm i en thermomixer.
  3. Hvis du tester LPEI polyplex, kan du legge til 2,5 µL av MgCl2 (500 mM) for en siste konsentrasjon av 16 mM MgCl2. Legg deretter til 7 µL av dekstran sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (tilsvarende a / P 1000) å rakne kjernen DNA nanostrukturer (utpakking, se trinn 6).
    Merk: Hoppe over dette trinnet hvis arbeider med chitosan polyplex eller naken DNA origami.
  4. Følg nsTEM avbildning som beskrevet i trinn 3 (figur 2).

8. DNase jeg titrering analysen av nakne DNA Origami nanostrukturer

  1. Mix 3 µL av nakne DNA origami inkludert 1 nmol fosfat med 2 µL av 10 x DNase jeg buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7.6) 1 µL av MgCl2 (250 mM), 12 µL av vann i 0,2 mL PCR rør. Legge til 2 µL av DNase jeg (10 x). Justere lager konsentrasjonen av DNase jeg (10 x) å få siste DNase jeg konsentrasjoner av 0.25-2 U/mL.
  2. Inkuber prøvene ved 37 ° C i 1-2 h i en thermocycler.
  3. Fordype prøvene i isen og deaktivere nucleolytic aktiviteten ved å legge til 2 µL av 500 mM dithiothreitol (DTT) og 2,5 µL av EGTA (33 mM).
  4. Analysere eksemplene bruker en alder som beskrevet i trinn 3.

9. stabiliteten i Polyplexes mot DNase jeg

  1. Blanding 4 µL av en polyplex (inkludert 1 nmol av fosfat, forberedt på forskjellige N/P forhold) med 1,5 µL av en DNase jeg buffer (10 x), 8 µL av TB og 1,5 µL av DNase I (100 U/mL) i en 0,2 mL PCR rør.
  2. Inkuber utvalget for 24 h på 37 ° C i en thermocycler.
  3. Legg 2 µL av proteinasen K (20 mg/mL) å fordøye DNase I. ruge i 30 min på 37 ° C i en thermocycler.
    Merk: i stedet for enzymatisk fordøyelsen, kjemiske deaktivering av DNase jeg legge 1,5 µL av DTT (500 mM) og 2 µL av EGTA (33 mM) kan utføres.
  4. Legge til 3,6 µL av dekstran sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (tilsvarende a / P 1000) å rakne kjernen DNA nanostrukturer.
  5. Utfør alder som beskrevet i trinn 3 (figur 3A, Figur 3 c). Inkluder ny DNA origami kontroll for å måle og sammenligne bandet intensiteten på gel.
  6. Avgiftsdirektoratet bandet på alder og ekstrakt DNA origami av skvis fryse utvinning kolonne basert på protokollen leveres av leverandøren.
  7. Følg nsTEM avbildning som beskrevet i trinn 4 (figur 2).

10. stabilitet mot fosterets bovin Serum (FBS)

  1. Blanding 4 µL av nakne DNA origami eller den tilsvarende polyplex (inkludert 1 nmol av fosfat) med 17 µL av TB + 10% FBS i 0,2 mL PCR rør. Bruk ferske tinte FBS.
  2. Inkuber prøven på 37 grader i en termisk cycler 24 h.
  3. Fordype eksemplet i en isbadet.
  4. Hvis du tester polyplex, utføre utpakking prosessen ved å legge til 3,6 µL av dekstran sulfat-40 kDa (50 mg/mL). I tillegg legge NaOH hvis arbeider med chitosan polyplexes (se trinn 6.3)
  5. Utfør en alder som beskrevet i trinn 3. Inkluder den nye DNA origami kontroll for å måle og sammenligne bandet intensiteten på gel.
  6. Avgiftsdirektoratet bandet på alder og ekstra DNA origami av en klem fryse utvinning kolonne.
  7. Legge 2 µL av proteinasen K (20 mg/mL) til utdraget DNA origami løsningen (20 µL) i et 0,2 mL PCR rør. Inkuber i 30 min på 37 ° C i en thermocycler å fordøye serumproteiner som er bundet til nanostrukturer.
  8. Vask prøven med 5 x 500 µL av TB inkludert 16 mM MgCl2 bruke kolonnen ultracentrifugation (MWCO ~ 100 kDa) å vaske proteinasen K (MW ~ 28,9 kDa) unna. Spinn hver vask 14.000 × g på r.t. for 3-5 minutter.
  9. Utføre nsTEM avbildning som beskrevet i trinn 4 (Figur 3).
    Merk: Gel utdraget prøven fra trinn 10.6 kan direkte brukes for nsTEM bildebehandling. Imidlertid kan avbilding være svært utfordrende på grunn av feste serumproteiner til DNA origami nanostrukturer. Proteinasen K behandling (trinn 10,7-10.9) anbefales derfor å lette avbildingsprosessen.

11. testing adresserbarhet av pepperrot Peroxidase enzym (HRP)-functionalized DNA Origami på belegg med Polycations

  1. Rense selv montert biotinylated-NR (Biotin-NR) som beskrevet i trinn 2.
  2. Inkuber 200 µL av renset Biotin-NR (36 nM, i 16 mM supplert TB buffer) med 200 µL av HRP-konjugerte streptavidin (540 nM, TB buffer). Legge til 4,8 µL MgCl2 (500 mM) en siste konsentrasjon av 14 mM. Ruge på r.t. 12 h på 650 rpm i en thermomixer
  3. Rense HRP-functionalized NR (HRP-NR) av en PEG rensing metoden (som beskrevet i trinn 2) for å fjerne ubundet HRP enzymer. Resuspend utfelt HRP-NR i TB inkludert 16 mM MgCl2.
  4. Mix 6.5 µL av renset HRP-NR (36 nM) med 6,5 µL av polycations for variant å forberede polyplex på N/P prosenter av 1, 2, 4, 10 og 20 (med formel 3).
  5. Gjenta trinn 11.2-11.4 for ikke-biotinylated NR. Som HRP enzymet kan binde nonspecifically til DNA origami, ikke-biotinylated DNA origami, som er behandlet med HRP enzymer og PEG renset (lik Biotin-NR), vil tjene som kontrollen i analysen.
  6. Mix 6.5 µL av destillert vann med 6,5 µL av polycations for variant tilsvarer definerte N/P prosenter av 1, 2, 4, 10 og 20. Avhandlinger prøver tjene som gruppen tomt.
  7. Legge til løsningen i trinn 11.4-11,6 (12.5 µL) til en 96-brønns plate inkludert sine 72.5 µL HEPES bufferen (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 1% DMSO pH 7.4) og bland godt.
  8. Legge til 10 µL av 2, 2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).
  9. Legg til 5 µL av H2O2 (12 mM) og bland godt pipettering opp og ned. H2O2 starter reaksjonen.
  10. Måle absorbans ved 421 nm over 4 h med en multimode plate leseren (figur 4A).

12. testing adresserbarhet av Hemin-bindende Aptamers (HBA)-functionalized DNA Origami på belegg med Polycations

  1. Rense den HBA functionalized-NR (HBA-NR) som beskrevet i trinn 2. Resuspend utfelt HBA-NR i TB med 6 mM MgCl2 (høyere saltkonsentrasjon fører til aggregering av HBA-NR).
  2. Bland 10 µL av HBA-NR (40 nM) med 10 µL av polycations på varierende konsentrasjon å forberede polyplex av definerte N/P prosenter av 1, 2, 10 og 20.
  3. Bland 10 µL av nakne-NR (40 nM) eller destillert vann med 10 µL av polycations i ulike konsentrasjoner tilsvarer N/P prosenter av 1, 2, 10 og 20.
  4. Legge til 20 µL forberedt løsningen fra trinn 12.2 og 12.3 i 96-brønnen platen inkludert 60 µL HEPES bufferen (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 1% DMSO pH 7.4) og bland godt. Inneholde minst én tom eksempel erstatte 20 µL polyplex eller polycation løsningen (fra trinn 12.2 og 12.3) med vann.
  5. Legge til 5 µL av hemin (0.04 mM) etterfulgt av 10 µL av ATBS (15 mM). Plass platen på en orbital shaker i 5 min.
  6. Legg til 5 µL av H2O2 (12 mM) og bland godt pipettering opp og ned.
  7. Måle absorbans ved 421 nmover 30 min med multimode plate leseren (figur 4B).

Representative Results

Tre DNA origami nanostrukturer av ulike konfigurasjoner ble utformet, inkludert en nanorod (NR), en nanobottle (NB) og en trådramme nanostructure (WN) (3D-modeller av nanostrukturer er illustrert i figur 2). Feltet NR og NB ble designet basert på en square og honeycomb gitter, henholdsvis, caDNAno17 og WN ble opprettet med Daedalus programvare18. En omfattende protokoll for design og selvstendig montering av DNA nanostrukturer har vært publisert19,20,21,22. Figurer stiften tråder var bestilt, selv montert og ytterligere renset basert på en protokoll beskrevet av Stahl et al. 23 (trinn 2).

Polyplexes var preget av gel retardasjon analysen og nsTEM bildebehandling. På blande DNA origami med polycations, ble et skifte i naken nanostructure bandet mot katoden observert (figur 1A). Dette kan tilskrives counterbalancing av negativ ladning av fosfat grupper ved binding til polycations og den totale størrelsen øke av komplekset. Legge til ekstra mye av polyanions som dekstran sulfat kan reversere polyplex dannelsen. I denne forbindelse, dekstran sulfat av høyere molekylvekt (MW ~ 40 kDa) viste seg å være mer effektiv for decomplexation forhold til lavere molekylvekt dekstran sulfat (MW ~ 4 kDa) (figur 1B).

Mens imaging LPEI polyplexes av uranyl acetate negative flekken TEM, var det vanskelig å avbilde partikler. Var hypotesen at LPEI kan hindre uranyl acetate fra binding til fosfat ryggraden på grunn av stramme skjerming av DNA origami. Derfor før nsTEM bildebehandling, ble mye dekstran sulfat lagt til LEPI polyplexes. Den avslørt DNA origami nanostrukturer viste ingen tegn til defekt eller nedbryting. I motsetning, var chitosan polyplexes vellykket fotografert uten behov for polyanion behandling (figur 2).

Alle naken DNA nanostrukturer (uavhengig av deres forskjellige konfigurasjoner) var denaturert helt etter en dag med inkubering på 37 ° C i Mg null buffer, som bekreftes av nsTEM bildebehandling. Derimot nanostrukturer belagt med LPEI eller chitosan på N/P≥1 holdt seg intakt. Tilsvarende DNase jeg titrering analyser viste mottakelighet av ubeskyttet nanostrukturer mot enzymatisk fordøyelsen. Mens nakne nanostrukturer var helt fordøyd i nærvær av 1 U/mL DNase jeg etter 2 h, LEPI eller chitosan innkapslet DNA origami holdt intakt i supplert Mg null buffer med 10 U/mL DNase jeg i minst en dag (figur 2). Høyere stabilitet mot nucleolytic fordøyelsen ble oppnådd ved å øke N/P forholdet mellom polyplexes. I tillegg beskytter LPEI DNA nanostrukturer mer effektivt i forhold til chitosan (Figur 3A, Figur 3C), sannsynligvis på grunn av høyere kostnader tetthet av LEPI, og dermed høyere forpliktende tilhørighet mot DNA24 . Ingen forskjell ble observert mens du bruker LPEI av ulike molekylvekt (figur3B).

Adresserbarhet av funksjonelle grupper i DNA nanostrukturer etter innkapsling i en polymer shell er en viktig funksjon. Videre ble polycation belegg kompatibiliteten med pepperrot peroxidase enzym (HRP) og hemin-bindende aptamers (HBA) functionalized DNA origami undersøkt. Tre biotinylated stift tråder utsparinger stakk fra overflaten av NR og deretter functionalized med HRP-konjugert streptavidin (tre enzymer per DNA origami). Den katalytisk svært aktive (Kd: 439 nM) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3 ") ble valgt for disse eksperimentene25. Opptil 24 stift tråder var utsparinger stakk fra NR overflaten med et 5-nm lengde linker (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3 ") etterfulgt av PS2. M sekvens (24 aptamers per DNA origami). Ingen bemerkelsesverdig hindring av enzymatisk eller aptamer aktivitet ble observert på belegg HRP - eller HBA-functionalized DNA origami med LPEI og chitosan variant N/P prosenter (Figur 4A-B)16. Men har den kinetiske av HRP enzym blitt dramatisk endret etter binding til DNA origami (Figur 4C).

Figure 1
Figur 1 : Representant alder bilder av polyplex formasjon og utpakking. (A) electrophoretic mobilitet Skift analysen for NB blandet med chitosan på N/P prosenter 0,01-8. Hver fil inneholder 1 nmol NB. Første lane er referansen NB. (B) utpakking av polyplexes av polyanionic dekstran sulfat (DS). Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Negative flekken TEM micrographs DNA origami og polyplexes. 3D modell og nsTEM micrographs av nakne DNA origami nanostrukturer (kolonne 1 og 2). nsTEM micrographs LPEI polyplexes (etter utpakking) og chitosan polyplexes (kolonner 3 og 4). nsTEM bilder av nakne og beskyttet DNA origami (polyplex) utsatt for Mg nedbryting (kolonner 5, 6 og 7), enzymatisk degradering (kolonner 8 og 9), serum fordøyelse (kolonner 10 og 11) for en dag på 37 ° C. LPEI-5 kDa ble brukt i denne analysen. Naken DNA nanostrukturer var dårligere utover deteksjon på en alder i nærvær av 1 U/mL DNase jeg eller TB + 10% FBS etter 2 timer med inkubering på 37 ° C. Skalere barer: 100 nm. Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant resultatene av DNase jeg beskyttelse analyser. (A) DNase jeg beskyttelse analysen for polyplexes av WN med LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa og LPEI-25 kDa forberedt på N/P forholdet mellom 2, 4, 8 og 10. Prøvene ble utsatt for 10 U/mL DNase jeg for 24 h på 37 ° C. Siste lane er kontrollen WN. Polyplexes var decapsulated før lasting i gel. (B) normalisert mener bandet intensiteten for polyplexes av DNA origamis med forskjellige LPEI utdraget fra alder bilde-A. Y-aksen representerer normalisert mener bandet intensitet. (C) The DNase jeg beskyttelse analysen av chitosan-WN polyplexes forberedt på N/P prosenter av 1, 2, 4, 10 og 20. Prøvene ble utsatt for 10 U/mL DNase jeg for 24 h på 37 ° C. Lane 6 er kontroll polyplex (N/P 20). Siste lane er kontrollen WN. Alle chitosan polyplexes var decapsulated før lasting i gel. Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representant resultatene av kolorimetrisk enzym - og aptamer-functionalized DNA origami analyser. (A) kolorimetrisk analysen av enzym-functionalized nanostrukturer (HRP-NR) belagt med chitosan 3.7 h etter reaksjon starten. (B) kolorimetrisk analysen av aptamer-functionalized nanostrukturer (HBA-NR) belagt med chitosan, 6 min etter reaksjon oppstart. Y-aksen representerer normalisert absorbansen. (C) overvåking kolorimetrisk analysen HRP og HRP-NR over tid. Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Kationisk polymerer Chitosan LPEI-5 kDa LPEI-10 kDa LPEI-25 kDa
Molekylvekt av polymer (kDa) 5 5 10 25
Molecualr vekten av monomer (g/mol) 161 43 43 43
Antall Amin per monomer 1 1 1 1
Antall Amin per polymer 28 116 232 581

Tabell 1. Beregne antall Amin grupper pr. polycation.

Molekylvekt av dekstran sulfat (kDa) 4 40
Molekylvekt av monomer (g/mol) 366 366
Antall sulfat per monomer 2 2
Antall sulfat per polymer 22 220

Tabell 2. Beregne antall sulfat grupper pr. polyanion.

Discussion

I den selv-montering av DNA origami, stifte tråder vanligvis legges i 5-10 overflødig forhold til stillaset. Disse overflødig stift tråder også binder seg til den polycation og form polyplexes i området monometer som er mer vanskelig å skilles fra DNA origami polyplexes. Derfor er en avgjørende skritt i polyplex-formasjonen fjerne overflødig stift tråder og bruke godt renset DNA origami nanostrukturer.

Andre metoder har blitt utviklet for stabilisere DNA nanostrukturer som cyclization av DNA tilnærmingene via en klikk reaksjon26. Som alkyne - og azide-endret stift tråder er nødvendig for dannelsen av sammenstøt single-strandet ringer, denne teknikken er begrenset for stabilisering av små nanostrukturer slik en DNA-catenane, og det er ikke lett skaleres for større DNA origami strukturen som brukes i denne protokollen. Nylig Gerling et enl.27 rapportert en metode for å lage kovalente cyclobutene pyrimidine dimer (CPD) bånd mellom nærliggende thymidines i DNA nanostrukturer med ultrafiolett bestråling. Selv om denne metoden er område-selektiv og skalerbar, er dens effektivitet i å beskytte DNA origami mye lavere enn polycation belegg. For eksempel CPD-stabilisert DNA origami objekter holde ut bare 0,4 U/mL DNase jeg 1t, mens polyplexes var stabil i nærvær av 10 U/mL DNase jeg for minst en dag.

I korte trekk genterapi inspirert chitosan og LPEI belegg er en rimelig, ettrinns og effektiv metode å løse langsiktig stabilitet i DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmet og nuclease-rik media. Reversibilitet av polyplex formasjonen forenkler anvendelsen i flere trinn diagnostiske tester hvor beskyttelse av DNA origami mot nucleolytic fornedrelse eller salt-uttømming er avgjørende i ett trinn, men kan forårsake problemer i andre trinn som DNA forsterkning. I tillegg er polycation belegg en potensiell tilnærming for å øke cellulære opptaket av DNA origami nanostrukturer for narkotikarelaterte levering programmer28.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konflikter av interesse knyttet til denne rapporten.

Acknowledgments

Dette prosjektet har mottatt støtte fra EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon program under grant avtalen nr. 686647. TEM bilder ble registrert på en Morgagni drives på 80 kV på EM anlegget i Wien Biocenter Core fasiliteter GmbH (VBCF). Vi vil gjerne takke Tadija Kekic for assistanse i grafisk design og Elisa De LIano for å utforme trådramme-nanostructure.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10× DNase I reaction buffer New England Biolab (NEB) B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) Alfa Aesar J65535
Amicon ultracentrifugation columns Merck Millipore UCF500308, UCF510024
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide Sigma-Aldrich 523682
Design-specific staple strands Integrate DNA Technologies (IDT)
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) Sigma-Aldrich 75027
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) Sigma-Aldrich 42867
DNA gel loading dye (6×) ThermoFischer sceintific R0611
DNase I (RNase free) New England Biolab (NEB) M0303
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) Sigma-Aldrich EDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Biorad 7326165
Hemin Sigma-Aldrich H9039
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) Sigma-Aldrich 216763
LPEI-25 kDa Polysciences, Inc 23966-1
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) ThermoFischer sceintific NP0004
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) Carl Roth O263.1
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 Sigma-Aldrich 765090
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 Sigma-Aldrich 764582
Proteinase K solution (20 mg/ml) ThermoFischer sceintific AM2548
Streptavidin-conjugated HRP ThermoFischer sceintific N100
SYBER safe DNA gel stain ThermoFischer sceintific S33102

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond. Science. 347 (6224), 1260901 (2015).
  2. Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  3. Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites. Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).
  4. Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).
  5. Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
  6. Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
  7. Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
  8. Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture. ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).
  9. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress. The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).
  10. Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. Gene therapy and DNA delivery systems. International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  12. Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation. Nature Communication. 8, 15654 (2017).
  13. Agarwal, N. P., Matthies, M., Gür, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami. Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).
  14. Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., Järvihaavisto, E., Mikkilä, J., Tenhu, H., Nonappac,, Kostiainen, M. A. Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates. Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).
  15. Perrault, S. D., Shih, W. M. Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability. ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).
  16. Ahmadi, Y., De Llano, E., Barišić, I. (Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures. Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).
  17. Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
  18. Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6293), 1534 (2016).
  19. Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
  20. Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).
  21. Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).
  22. Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles. Journal of Visualized Experiment. (99), May 52486 (2015).
  23. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  24. Grigsby, C. L., Leong, K. W. Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).
  25. Li, T., Dong, S., Wang, E. G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work. Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).
  26. Cassinelli, V. 1, Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).
  27. Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies. Science Advances. , 1157 (2018).
  28. Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).

Tags

Kjemi problemet 143 DNA origami polyplex langsiktige stabilisering nucleolytic fornedrelse gen-terapi functionalization
Genterapi inspirert Polycation belegg for beskyttelse av DNA Origami nanostrukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy … More

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures. J. Vis. Exp. (143), e58771, doi:10.3791/58771 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter