Summary

الإرسال المتعدد وركزت التحفيز بالموجات فوق الصوتية مع الفحص المجهري الأسفار

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

التحفيز بالموجات فوق الصوتية نابض المنخفضة الكثافة (لبوس) وسيلة لتحفيز ميكانيكية غير الغازية من الخلايا الذاتية أو هندسيا مع عالية الدقة المكانية والزمانية. توضح هذه المقالة كيفية تنفيذ لبوس إلى مجهر برنامج التحصين الموسع-الأسفار وكيفية التقليل من عدم تطابق مقاومة الصوتية على طول المسار بالموجات فوق الصوتية لمنع القطع الميكانيكية غير المرغوب فيها.

Abstract

من خلال التركيز نبضات الموجات فوق الصوتية المنخفضة الكثافة التي تخترق الأنسجة الرخوة، يمثل لبوس تكنولوجيا الطب الحيوي واعدة للتلاعب بأمان وعن بعد إطلاق العصبية وإفراز الهرمونات والخلايا التي أعيدت برمجتها وراثيا. ومع ذلك، ترجمة هذه التكنولوجيا لأغراض التطبيقات الطبية حاليا يعوقها الافتقار إلى الآليات الفيزيائية الحيوية التي تستهدف أنسجة الإحساس والاستجابة للبوس. سيكون نهجاً مناسباً لتحديد هذه الآليات لاستخدام أجهزة الاستشعار البصرية في تركيبة مع ليبوس لتحديد الكامنة وراء مسارات الإشارات. ومع ذلك، يجوز الأخذ بتنفيذ لبوس مجهر الأسفار القطع الميكانيكية غير مرغوب فيه بسبب وجود واجهات المادية التي تعكس، واستيعابها وينكسر الموجات الصوتية. تعرض هذه المقالة إجراء خطوة بخطوة لإدماج لبوس للمجاهر المتوفرة تجارياً تستقيم برنامج التحصين الموسع-الأسفار مع التقليل من تأثير واجهات البدنية على طول المسار الصوتي. ويرد وصف إجراءات بسيطة لتشغيل محول عنصر مفرد بالموجات فوق الصوتية وإدخال المنطقة المحورية لمحول في جهة موضوعية. ويتضح استخدام ليبوس مع مثال للعابرين التي يسببها ليبوس الكالسيوم في الخلايا المستزرعة جليوبلاستوما البشرية تقاس باستخدام التصوير بالكالسيوم.

Introduction

العديد من الأمراض تتطلب شكلاً من أشكال التدخل الطبي الغازية. هذه الإجراءات غالباً ما تكون باهظة الثمن، ومحفوفة بالمخاطر وتتطلب فترات الانتعاش وهكذا إضافة عبئا على نظم الرعاية الصحية. الطرائق العلاجية عدم الغازية لديها القدرة على توفير بدائل أرخص وأكثر أمنا للإجراءات الجراحية التقليدية. ومع ذلك، هي غالباً ما تكون محدودة النهج غير الغازية الحالية مثل العلاج الصيدلاني أو transcranial التحفيز المغناطيسي بالمفاضلة بين اختراق الأنسجة والقرار الزمانية المكانية والآثار غير المرغوب فيها خارج الهدف. وفي هذا السياق، يشكل الموجات فوق الصوتية مركزة تكنولوجيا غير الغازية واعدة مع القدرة على التعامل مع الوظائف البيولوجية داخل الأنسجة بدرجة عالية من الدقة الزمانية المكانية ومحدودة خارج الهدف آثار عميقة.

التحفيز بالموجات فوق الصوتية المركزة يتكون من إيصال الطاقة الصوتية في مواقع دقيقة عميقة داخل الكائنات الحية. يمكن أن يكون هذا الطاقة استناداً إلى المعلمات نبض الصوتية، مجموعة متنوعة من الاستخدامات الطبية. على سبيل المثال، إدارة الأغذية والعقاقير قد وافقت على استخدام عالية الكثافة “وركزت فوق الصوتية” (هيفو) للاستئصال الحراري لاورام البروستاتا والتسبب في الهزة مناطق الدماغ والرحمية والنهايات العصبية المسببة للألم في العظام الانبثاث1 . بوساطة هيفو ميكروبوبلي التجويف يستخدم أيضا لعابر فتح حاجز الدم في الدماغ للتنفيذ الهادف للمداواة تدار النظامية2. كثافة متوسط نبض المكانية الذروة (أناجنا) وذروة المكانية الزمانية متوسط كثافة (أناالميثيل) المستخدمة هيفو التطبيقات عادة أعلاه عدة كيلوات سم-2 وتنتج ضغط النبض من عدة عشرات من الآلام والكروب الذهنية. قيم كثافة هذه هي أعلى بكثير من وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير أناجنا ، وحدودالميثيل للتشخيص بالموجات فوق الصوتية، 190 ث سم-2 و 720 ميغاواط سم-2، على التوالي3. وفي المقابل، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن التحفيز غير مدمرة نابض بالموجات فوق الصوتية الموجودة داخل أو بالقرب من نطاق حدود كثافة الموجات فوق الصوتية التشخيصية (لبوس) يمكن أن تكون فعالة التعامل مع العصبية عن بعد و بأمان إطلاق4، 5،،من67،8و9،إفراز الهرمونات10 والمحوره وراثيا الخلايا11. حتى الآن، لا تزال الآليات الخلوية والجزيئية التي خلايا الإحساس وتستجيب للموجات فوق الصوتية غير واضحة، النافية للترجمة السريرية للبوس. ومن ثم، في السنوات القليلة الماضية، دراسات الأغشية الاصطناعية، والخلايا المزروعة والحيوانات حفز بالموجات فوق الصوتية قد اكتسبت زخما لكشف الفيزيائية والعمليات الفسيولوجية والتضمين لبوس12،13، ،من 1415.

الصوت يتكون من الاهتزاز الدعاية من خلال وسيلة مادية. الموجات فوق الصوتية صوت مع تردد فوق النطاق مسموعة البشرية (أي فوق 20 كيلو هرتز). في مختبر، والموجات فوق الصوتية تصدر عموما كهرضغطية محولات الطاقة التي تحتوي على مادة يهتز في الاستجابة إلى حقل كهربائي تتأرجح في عرض النطاق ترددي عالية التردد محددة. يوجد نوعان من محولات الطاقة: واحدة عنصر محولات الطاقة والمصفوفات محول طاقة. عنصر واحد كهرضغطية محولات الطاقة تمتلك سطح منحن الذي يعمل كعدسة تركيز ويركز الطاقة الصوتية ومن ثم إلى منطقة محددة تسمى منطقة التركيز. محولات الطاقة عنصر واحد من كثير أرخص وأسهل للعمل من الصفائف محول طاقة. هذه المادة سوف تركز على محولات الطاقة عنصر واحد.

يعتمد حجم المنطقة المحورية لمحول عنصر واحد مركزة على الخصائص الهندسية للعدسة الصوتية وعن الترددات الصوتية. لتحقيق منطقة ملليمتر-حجم تنسيق مع محول عنصر واحد، ترددات الموجات فوق الصوتية في النطاق MHz مطلوبة عادة. لسوء الحظ، هي سريعة جداً يخفف الموجات الصوتية في مثل هذا التردد عندما يتم نشرها في وسيلة ضعيفة مثل الهواء. وهكذا، الموجات فوق الصوتية ميغاهرتز تحتاج إلى نشرها على العينة في مادة أكثر كثافة مثل المياه والتي تم إنشاؤها. وهذا يشكل التحدي الأول في إدماج أسلوب ليبوس مجهر.

وتحدي ثاني هو للتقليل من الواجهات المادية بين مواد مختلفة من ممانعات الصوتية (والذي نتاج للكثافة المادية والسرعة الصوتية) على طول المسار الصوتي. يمكن أن تعكس هذه الواجهات، ينكسر، مبعثر وامتصاص الموجات الصوتية، مما يجعل من الصعب تحديد مقدار الطاقة الصوتية تسليمها فعلياً بعينه. أنها قد أيضا إنشاء القطع الميكانيكية غير المرغوب فيها. على سبيل المثال، إنشاء واجهات مقاومة عدم تطابق عمودي الصوتية المنتجة تأملات موجات باكبروباجاتينج التي تتداخل مع تلك التي يروجون للأمام. على طول مسار التدخل، الموجات إلغاء بعضها البعض في المناطق الثابتة من المساحات التي تسمى العقد ونلخص في منطقة تسمى العقد المضادة، بالتناوب خلق موجات دائمة ما يسمى (الشكل 1). من المهم experimentalist لتكون قادرة على التحكم أو القضاء على هذه الواجهات التجريبية في المختبر كما أنها قد لا تكون موجودة في الجسم الحي.

قياس الأسفار من الصحفيين الضوئية طريقة معروفة لاستجواب عينات بيولوجية شفافة في الوقت الحقيقي، ومع لا اضطراب المادية. وهكذا هذا النهج يعتبر مثاليا للدراسات لبوس كما سيعرض أي تحقيقات المادية الموجودة في منطقة سونيكاتيد القطع الميكانيكية. ويصف هذا البروتوكول بتنفيذ وتشغيل لبوس مجهر تجاري برنامج التحصين الموسع-الأسفار.

Protocol

1-زراعة الخلايا على فيلم البوليستر سمعيا شفافة التصفح بحجم 12 مم ثقب في الجزء السفلي من صحن الثقافة القياسية 35 ملم باستخدام الصحافة-حفر عمودي. نقل التدريبات ببطء وملابس حماية العين. إزالة قطعة من البلاستيك تعلق على الجزء السفلي من الطبق باستخدام شفرة لإنشاء سطح أملس على الجانب الخارجي…

Representative Results

الرقم 5 مثال عن تجربة ليبوس متعدد مع تصوير الكالسيوم. جليوبلاستوما الخلايا (A-172) كانت تزرع على امبم المغلفة البوليستر الفيلم في مستنبت القياسي (تستكمل مع المضادات الحيوية المصل و 1% 10%) والمحتضنة مع المراسل المراعية للكالسيوم الفلورية فلوو-4 صباحا. الخلايا ت…

Discussion

مزايا رئيسية لمركزه بالموجات فوق الصوتية هو قدرته على توصيل الطاقة الميكانيكية أو الحرارية غير إينفاسيفيلي للعينات البيولوجية مع عالية الدقة الزمانية. تقنيات أخرى تهدف إلى حفز ميكانيكيا الخلايا عادة ما توظف الغازية المسابير المادية (على سبيل المثال، الخلية دس) أو يتطلب تفاعل أشعة ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور ميخائيل شابيرو ورزنيك نيكيتا لمناقشات مثمرة. هذا العمل كانت تدعمها أموال بدء التشغيل من “الغربية جامعة ل” العلوم الصحية، والمعاهد الوطنية للصحة منح R21NS101384.

Materials

upright microscope with large working volume Thorlabs CERNA
upright microscope with large working volume Scientifica SliceScope
optomechanical components Thorlabs n/a
needle hydrophone ONDA Corporation HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone Precision Acoustics n/a
fiber optic hydrophone ONDA Corporation HFO series
fiber optic hydrophone Precision Acoustics n/a
oscilloscope Keysight Technology DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator Keysight Technology 33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier Electronic Navigation Industries (ENI) 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer Olympus focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer Benthowave Instrument HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer Precision Acoustics Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer Ultrasonic-S-lab HiFu transducers made to order
high-density Matrigel Corning VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns Chemplex CAT.NO:107

References

  1. Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
  2. Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. . Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).
  3. Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
  4. Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
  5. Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
  6. Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
  7. Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
  8. Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
  9. Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
  10. Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
  11. Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
  12. Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
  13. Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
  14. Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
  15. Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
  16. O’Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
  17. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
  18. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
  19. Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
  20. Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
  21. Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
  22. Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).

Play Video

Cite This Article
Lacroix, J. J., Ozkan, A. D. Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58781, doi:10.3791/58781 (2019).

View Video