Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie

Summary

Low-Intensity Pulsed echografie stimulatie (LIPUS) is een modaliteit voor niet-invasieve mechanische stimulatie van endogene of gemanipuleerde cellen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. In dit artikel wordt beschreven hoe implementeren van LIPUS om een epi-fluorescentie Microscoop en minimaliseren van akoestische impedantie mismatch langs het pad van de echografie om te voorkomen dat ongewenste mechanische artefacten.

Abstract

Door zich te concentreren in lage-intensiteit ultrageluid pulsen die doordringen van de zachte weefsels, vertegenwoordigt LIPUS een veelbelovende biomedische technologie voor het op afstand en veilig manipuleren neurale afvuren, hormonale secretie en genetisch geherprogrammeerd cellen. Echter wordt de vertaling van deze technologie voor medische toepassingen momenteel gehinderd door een gebrek aan biofysische mechanismen waarmee gericht weefsels gevoel en te reageren op LIPUS. Een geschikte benadering voor het identificeren van deze mechanismen zou moeten gebruiken van optische biosensoren in combinatie met LIPUS om te bepalen onderliggende signaalroutes. Echter, de LIPUS tot en met een fluorescentie Microscoop kan leiden tot ongewenste mechanische artefacten als gevolg van de aanwezigheid van fysieke interfaces die weerspiegelen, absorberen en akoestische golven breken. Dit artikel bevat een stapsgewijze procedure om op te nemen LIPUS aan verkrijgbare rechtop epi-fluorescentie microscopen terwijl het minimaliseren van de invloed van fysieke interfaces de akoestische weg. Een eenvoudige procedure is beschreven te bedienen een transducer één element echografie en voldoen aan de focale zone van de transducer brengen het objectieve focal point. Het gebruik van LIPUS is geïllustreerd met een voorbeeld van LIPUS-geïnduceerde calcium transiënten in gekweekte menselijke glioblastoma cellen gemeten met behulp van calcium imaging.

Introduction

Veel ziekten vereist enige vorm van invasieve medische interventie. Deze procedures zijn vaak duur en riskant en vereisen herstel periodes dus het toevoegen van een last aan stelsels voor gezondheidszorg. Niet-invasieve therapeutische modaliteiten hebben het potentieel om veiligere en goedkopere alternatieven voor conventionele chirurgische ingrepen. Huidige niet-invasieve benaderingen zoals farmacotherapie of Transcraniële magnetische stimulatie zijn echter vaak beperkt door afwegingen tussen weefsel penetratie, Spatio resolutie en ongewenste effecten van de af-target. In dit verband vormt een gerichte echografie een veelbelovende niet-invasieve technologie met het potentieel om te manipuleren van de biologische functies diep in de weefsels met hoge Spatio nauwkeurigheid en beperkte af-target effecten.

Gerichte echografie stimulatie bestaat uit het leveren van akoestische energie op exacte locaties diep in levende organismen. Afhankelijk van de akoestische pulse parameters, kan deze energie hebben een verscheidenheid van medische toepassingen. Bijvoorbeeld, heeft de Food and Drug Administration het gebruik van High-intensity geconcentreerd ultrageluid (HiFU) goedgekeurd voor thermische ablatie van tumoren van de prostaat, tremor-veroorzakende hersengebieden, uteriene vleesbomen en zenuwuiteinden pijn veroorzaakt in de botmetastasen¹ . HiFu-gemedieerde microbubble cavitatie wordt ook gebruikt voor Transient openen de bloed - hersen barrière voor de beoogde levering van systemisch bestuurde therapeutics². De ruimtelijke-piek pulse-gemiddelde intensiteit (I_sppa) en de ruimtelijke-piek temporele-gemiddelde intensiteit (ik_{nieuwsagentschap}) gebruikt voor HiFU toepassingen zijn meestal boven verschillende kW cm^-2 en produceren pulse druk van enkele tientallen MPa. Deze intensiteitswaarden zijn ver boven de FDA-goedgekeurde ik_sppa en ik_{nieuwsagentschap} limieten voor diagnostische echografie, 190 W cm^-2 en 720 mW cm^-2, respectievelijk³. In tegenstelling, hebben recente studies aangetoond dat niet-destructieve gepulseerde echografie stimulatie die binnen of in de buurt van het bereik van de plafonds voor de intensiteit diagnostische echografie (LIPUS) kan worden effectief te ver en veilig manipuleren neurale afvuren^{4, 5,6,7,8}, hormonale secretie^9,10 en bioengineered cellen¹¹. Toch zijn de cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee cellen voelen en reageren op echografie nog steeds onduidelijk, uitschakeling van klinische vertaling van LIPUS. Vandaar, in de afgelopen jaren onderzoek naar kunstmatige membranen, gekweekte cellen en dieren gestimuleerd met echografie hebben een stroomversnelling te onthullen biofysische en fysiologische processen gemoduleerd door LIPUS^{12,13, 14},^,15.

Geluid bestaat uit een trilling teeltmateriaal via een fysiek medium. Een echografie is een geluid met een frequentie hoger dan de mens hoorbare bereik (i.e., boven 20 kHz). In de omgeving van een laboratorium, zijn ultrasone golven over het algemeen geproduceerd door piëzo-elektrische omvormers die bevatten een materiaal dat naar aanleiding van een elektrisch veld oscillerende in een specifieke bandbreedte van hoge-frequentie trilt. Er bestaan twee soorten omvormers: één element transducers en transducer matrices. Piëzo-elektrische omvormers van één element bezitten een gebogen oppervlak dat fungeert als een focus lens en vandaar concentreert akoestische energie in een bepaald gebied genaamd de focale zone. Enkel element omvormers zijn veel goedkoper en gemakkelijker te bedienen dan transducer matrices. Dit artikel zal zich richten op één element omvormers.

De grootte van de focale zone van een gerichte enkel element transducer hangt af van de geometrische eigenschappen van de akoestische lens en de akoestische frequentie. Om te bereiken een focale millimeter-grootte-zone met een enkel element transducer, zijn ultrasone frequenties in het bereik MHz in het algemeen vereist. Akoestische golven op deze frequentie zijn helaas zeer snel verzwakt wanneer doorgegeven in een ijle medium zoals lucht. Aldus, moeten MHz ultrasone golven worden gegenereerd en doorgegeven aan het monster in een dichtere materiaal zoals water. Dit is de eerste uitdaging bij de integratie van de LIPUS modaliteit aan een microscoop.

Een tweede uitdaging is om te minimaliseren van de fysieke interfaces tussen materialen met verschillende akoestische impedances (dat is een product van materiële dichtheid en de akoestische snelheid) langs het akoestische pad. Deze interfaces kunnen reflecteren, breken, scatter en absorberen van akoestische golven, waardoor het moeilijk te kwantificeren van het bedrag van akoestische energie effectief geleverd aan een monster. Ze kunnen ook ongewenste mechanische artefacten maken. Bijvoorbeeld, maken reflecties geproduceerde loodrecht op akoestische mismatch impedantie interfaces backpropagating golven die met vooruit-teeltmateriaal ones interfereren. De storing weg annuleren de golven elkaar op vaste regio's van ruimten genaamd knooppunten en samengevat op afwisselende regio's anti-knooppunten, creëren van zogenaamde staande golven (Figuur 1). Het is belangrijk voor de Vejle te kunnen beheren of elimineren van deze experimentele interfaces in vitro als ze niet in vivo bestaat.

Meting van de fluorescentie van optische verslaggevers is een bekende methode om te ondervragen transparante biologische monsters in real-time en met geen fysieke storingen. Deze aanpak is dus ideaal voor LIPUS studies zoals elke fysieke sondes aanwezig in het sonicated gebied mechanische artefacten introduceren zal. Dit protocol beschrijft de uitvoering en de werking van LIPUS naar een commerciële epi-fluorescentie Microscoop.

Protocol

1. groeiende cellen op akoestisch transparant Polyester Film

1. De grootte van een 12 mm gat aan de onderkant van een standaard 35 mm cultuur schotel met behulp van een verticale pers-boor boor. De boor langzaam en Oogbescherming dragen. Verwijderen van stukken van plastiek gekoppeld aan de onderkant van de schotel een mes gebruiken voor het maken van een glad oppervlak aan de externe zijde (Figuur 2).
2. Breng een dunne laag van de marine-grade epoxy of lijm aan de oppervlakte van de externe onderkant van de schotel.
3. Plaats een foliën van polyester (2,5 µm dikte) tegen de externe onderkant van de schotel en druk stevig om ervoor te zorgen dat de epoxy/lijm verspreidt zich gelijkmatig tussen de film en de dikke plastic oppervlak. Trek voorzichtig de film in een centrifugale wijze met vingers maken een vlakke ondergrond (Figuur 2).
4. Wanneer de epoxy/lijm is opgedroogd, kort spoelen-droog de polyester-onderkant schotel met 95% ethanol en steriliseren door het plaatsen van de schotel en de binnenkant oppervlakte van het deksel onder een sterke 254 nm UV excitatie bron. Aanpassen van de duur en intensiteit te leveren een dosis UV van ongeveer 330 mJ cm^-2 voor de volledige vernietiging van de meeste soorten micro-organismen. Deze energie komt ongeveer overeen met een duur van 5 min. het gebruik van een 1000 μW cm^-2 UV belichting.
5. Aliquot verkrijgbare extracellulaire matrix eiwitten mengsels (EMPM) in kleine buizen (50-100 µL) en winkel hen bij-20 ° C of minder onder steriele omstandigheden.
6. Verdund in een steriele omgeving (bijvoorbeeld binnen een bioveiligheid kabinet), een bevroren voorraad van EMPM met een gewenste kweekmedium aan 1:100. Werken op het ijs om te voorkomen dat EMPM polymerisatie bij kamertemperatuur. Snel Breng 100 µL van het middellange mengsel op de polyester film. Plaats het deksel terug op de schotel te handhaven van de steriliteit.
7. Incubeer EMPM-gecoate polyester onder gerechten in een cel cultuur CO₂ incubator bij 37 ° C gedurende 6-12 uur.
8. Na incubatie het overtollige medium gecombineerd en direct het zaad van het oppervlak met cellen bij de gewenste dichtheid. Werken onder steriele toestand te handhaven van de steriliteit.

2. LIPUS uitvoering

1. Plaats een waterreservoir onder de doelstelling van een rechtop Microscoop met groot volume van de werken en zonder verlichting hardware in het transmissiepad.
2. Met behulp van verkrijgbare optomechanische onderdelen, plaats een monsterhouder onder de doelstelling en een transducer houder onder de monsterhouder. Voor latere monster zoeken en echografie uitlijning, deze twee houders op vertaling stadia te koppelen.
   1. Plaats de bewegende delen en aandrijvingen van vertaling stadia buiten de tank of boven de waterlijn om waterschade te voorkomen. Gebruik alleen niet-corrosieve materialen zoals geanodiseerd aluminium of roestvrij staal voor ondergedompeld optomechanische onderdelen.
3. Vul de tank met gedeïoniseerd en ontgaste water vóór gebruik te maken van de onderdompeling transducer. De waterlijn moet samenvallen met het horizontale vlak van de monsterhouder (Figuur 3).
   Noot: Gedeïoniseerd water voorkomt dat elektrische koppeling in aanwezigheid van hoge elektrische velden. Ontgassing zal ook voorkomen dat verstrooiing en wijzigingen van akoestische golven. Afvoer water na elk experiment met behulp van een pomp of het ventiel zodat de waterlijn is lager dan de positie van de transducer. Ook, vervangen of filteren van water vaak en sanering de watertank om te voorkomen dat de groei van micro-organismen.

3. schuine akoestische excitatie

1. Met behulp van commercieel verkrijgbare optomechanische onderdelen, oriënteren de transducer in een schuine positie ten opzichte van de optische weglengte. Dit zal ervoor zorgen dat om het even welk weerspiegeld golven zal uitgaan uit de buurt van het monster (Figuur 3 en Figuur 4).

4. rijden van de Transducer

Opmerking: Echografie omvormers oscillerende elektrische energie omzetten in mechanische expansie/contractie van een piëzo-elektrische materiaal. Deze conversie produceert energieverlies in de vorm van warmte-energie. Vandaar, terwijl omvormers een piek ingangsspanning limiet bezit, ze ook te beschikken over een elektrische stroom te beperken om te voorkomen dat schade door hitte op het piëzo-elektrisch element:

Fietsen met de plicht de relatieve fractie van tijd van elektrische simulatie, P de elektrisch vermogen (in watt), V_rms de kwadratische-gemiddelde Ingangsspanning (in volt) van de alternatieve spanningsbron en Z de elektrische impedantie (in ohm).

met V_pp de piek-tot-piek ingangsspanning toegepast op de transducer.

1. Maak een sinusgolf formulier met de gewenste frequentie, aantal cycli per puls, en pulse herhaling frequentie met behulp van een commerciële functiegenerator. De relatief hoge Vpp moest effectief rijden standaard ultrasoon transducers vaak vereist echter de toevoeging van een versterker aan het versterken van de output (dat wil zeggen, verhoging van de amplitude van V_pp) van de functiegenerator.
   Opmerking: bijvoorbeeld een transducer de fabrikant geeft aan dat de macht-limiet voor een bepaalde transducer 35 is W. Zal een sinusoïdale piek-tot-piek Ingangsspanning (V_in) van 500 mV bij een plicht cyclus van 50% en versterkt door een 50 dB/100 W versterker worden binnen de grenzen van de macht van deze transducer?
   1. Bereken de spanning na versterking voor de beantwoording van deze vraag. Voor een radio-frequentie (RF)-eindversterker, wordt de amplificatie factor (dB) gedefinieerd door:
      
      De versterkte spanning heeft dus een amplitude uitvoer V_pp (V_pp = V_uit) van:
      Met behulp van de vergelijkingen 1 en 2, en het gebruik van 50 Ω als elektrische impedantie, wordt de bijbehorende kracht gegenereerd door deze spanning is:
      
      Deze stimulatie is daarom binnen de grenzen van de macht van de transducer.
   2. Met behulp van het voorbeeld hierboven, berekenen de golfvorm parameters (Vpp, frequentie, impulstijd en pulse herhaling frequentie) die overeenkomen met de maxima van het vermogen en de spanning die door de fabrikant van de transducer. Zorg ervoor dat deze grenzen om te voorkomen beschadiging van de transducer en andere verbonden instrumenten respecteren.
2. Kies een functiegenerator die binnen een frequentiebereik compatibel met de echografie transducer werkt. Stel de frequentie van de functiegenerator op de piek van de nominale frequentie van de transducer.
3. Maak een sinusvormige spanning puls van de gewenste duur en frequentie van de herhaling met behulp van de burst-modus van de functiegenerator. Piek-tot-piek de kruisspanning naar een gewenste waarde. Zorg ervoor dat de impulstijd is korter dan de verstreken tijd tussen twee opeenvolgende pulsen.
4. Controleer of de golfvorm correspondeert met het gewenste signaal door de uitvoer van de functiegenerator te koppelen aan de inbreng van een oscilloscoop.
5. Sluit de uitgang van de functiegenerator voor de ingang van een RF-eindversterker (Figuur 4). Zorg ervoor dat de stimulatie parameters binnen de grenzen van de transducer van fabrikant.

5. beam uitlijning

1. Kies een hydrofoon die met een frequentie bereik en akoestische intensiteit compatibel met de frequentie en intensiteit van de echografie transducer werkt.
2. Zorgvuldig brengen de punt van een sonde hydrofoon de focus binnen het objectieve gezichtsveld op de positie die overeenkomt met de positie van het monster (Figuur 4).
3. Zorg ervoor dat zowel de sonde en de transducer in gedeïoniseerd en ontgaste water worden ondergedompeld. Het puntje van de hydrofoon met een fysiek object dan water niet bult als dit zal haar coating veranderen en invloed hebben op de waardering.
4. Een bruto pre uitlijning van de transducer door visueel positionering van de akoestische as richting de sonde hydrofoon uitvoeren Zorgt ervoor dat de afstand tussen de transducer van oppervlak en de tip hydrofoon overeen met ongeveer van de transducer brandpuntsafstand.
5. Sluit de uitgang aan op een van de de oscilloscoop signaalingang hydrofoon. De trigger van de synchronisatie van de functiegenerator verbinding te maken met een andere oscilloscoop-ingang. Visualiseren van beide signalen gelijktijdig op de oscilloscoop.
6. Rijden de transducer met paar echografie cycli bij een lage taakcyclus en lage amplitude om te voorkomen beschadiging van de sonde. Neem contact op met de de hydrofoon fabrikant veilige exploitatie voorwaarden om te voorkomen beschadiging van de hydrofoon tip.
7. Pas de knop s/divisie volgens de reistijd van echografie van de transducer van oppervlak aan de hydrofoon. Zoekt u een hydrofoon signaal op de oscilloscoop na de synchronisatie trigger.
8. Langzaam actuate de transducer met behulp van een gemotoriseerd of handmatig XYZ-fase. Laat de transducer in de positie die correleert met de maximale hydrofoon signaal (Figuur 4).
   Opmerking: Als er geen signaal is gevonden, is het mogelijk dat de intensiteit van de akoestische pulsen is te laag of die de lichtbundel is verkeerd uitgelijnd of wordt verspreid door een object. Controleer regelmatig de hydrofoon en transducer visueel vooraf uitgelijnd zijn en dat geen bubbels of fysiek voorwerp in het pad behalve de polyester film aanwezig zijn. Als geen signaal nog steeds gevonden wordt, verhogen de ingangsspanning met een klein bedrag te verhogen van de amplitude van hydrofoon signaal.

6. bepaling van echografie Pulse druk en intensiteit

1. Met de lichtbundel uitgelijnd, meten de amplitude van de piek-tot-piek van de uitgang op de oscilloscoop voor verschillende spanningen rijden de transducer hydrofoon. Zorg ervoor dat niet te overschrijden de limiet van de druk door de hydrofoon de fabrikant aanbevolen.
2. Het omzetten van deze metingen in druk en/of akoestische intensiteitswaarden met behulp van de methode van de kalibratie van de hydrofoon fabrikant.
   Opmerking: De akoestische intensiteit kan worden bepaald uit de druk en vice versa met behulp van de formule:
   
   met ik de akoestische druk (in W m^-2), P de akoestische druk (in Pa), ρ de dichtheid van het teeltmateriaal (1.000 kg m^-3 voor water) en c de snelheid van het geluid in het medium teeltmateriaal (voor water, c = 1.500 m s^-1).
3. Maak met behulp van deze metingen kalibratiekrommen.
   Opmerking: De druk vs. spanning en intensiteit vs. spanning bochten hebben een lineaire en parabolische vorm, respectievelijk.
4. De waarde van het druk en/of intensiteit van een gewenste drijvende spanning bepalen met behulp van de bijbehorende kalibratiekromme.

7. calcium-gevoelige/LIPUS Live-cel fluorescentie Imaging

1. Vervangen van de cel kweekmedium met een gewenste beeldvorming buffer met 5 µM van een cel-permeant calcium-gevoelige kleurstof (bijvoorbeeld Fluo-4 AM). Incubeer de cultuur schotel in een incubator van de CO-₂ bij 37 ° C gedurende 1 uur.
2. Cellen met de zelfde buffer vrij van kleurstof grondig te wassen.
3. Plaats de schotel in de monsterhouder. Prikkelen van de cellen met behulp van blauw licht verlichting (490 nm) en excitatie-intensiteit en de camera belichting om te voorkomen dat buitensporige bleken of pixel verzadiging aanpassen.
4. Uitvoeren van time-lapse geschikt zijn met behulp van de instellingen van de overname van de gewenste afbeeldingen. Gebruik een onderdompeling doelstelling voor betere beeldkwaliteit en met lange afstand om ongewenste reflecties (Zie Figuur 4).

Representative Results

Figuur 5 is een voorbeeld van LIPUS experiment multiplexed met calcium beeldvorming. Glioblastoma cellen (A-172) werden geteeld op EMPM gecoat polyester film in standaard kweekmedium (aangevuld met 10% serum en 1% antibiotica) en geïncubeerd met de calcium-gevoelige fluorescerende verslaggever Fluo-4 AM. Cellen werden beeld met behulp van een 10 X onderdompeling lens en verlicht met een witte LED lichtbron en fluorescentie licht werd verzameld met behulp van een standaard GFP filter set. LIPUS werd toegepast door handmatig door het rijden van een 4 MHz transducer met een pulse golfvorm van 158 V piek-tot-piek amplitude, 0,1 ms impulstijd en 10 ms pulse herhaling frequentie (dat wil zeggen, 1% taakcyclus). Deze parameters komen overeen met ik_sppa = 88 W cm^-2 (ruim onder de diagnostische grens van 190 W cm^-2)^{en ik}_{nieuwsagentschap} = 877 mW cm^-2 (iets boven de diagnostische 720 mW cm^-2), respectievelijk. Uit de resultaten blijkt deze stimulatie geproduceerd robuuste calcium waterstand (figuur 5B, 5 C, 5 D).

Voor korte puls is duur (dat wil zeggen, met geen aanzienlijke warmteontwikkeling tijdens de pols) en uitgaande van de warmtecapaciteit van het monster (dat wil zeggen, de cellen gegroeid op polyester film en ondergedompeld in waterige oplossing) vergelijkbaar met die van water, de verandering van temperatuur (∆T_max) geproduceerd tijdens elke pols kan worden geschat door¹⁶

 

met een impulstijd van 0,1 ms en pulse intensiteit van 88 W cm^-2

_Max ∆T = 0,12 x 0,0001 x 88 ≈ 1 m ° C

met 1% taakcyclus is de kleine hoeveelheid warmte gedeponeerd bij de focale zone tijdens elke puls 0.1 ms waarschijnlijk verwijderd door thermische geleiding tijdens de 9.9 ms overspannen tussen twee opeenvolgende pulsen. Vandaar, het robuuste calcium signalen gezien in figuur 5B, 5 C, 5 D zijn waarschijnlijk veroorzaakt door niet-thermische mechanism(s).

Figuur 1: de vorming van de staande golf in een reflecterende interface. De aanwezigheid van een interface tussen materialen met verschillende akoestische impedantie weerspiegelt een binnenkomende druk golf (blauw) met een golflengte λ. Aangezien beide golven in tegengestelde richtingen reizen, is een oscillerende faseverschuiving gevestigd. Boven: op dit moment is de faseverschuiving 180°, productie van destructieve interferentie van de staande golf (groene golf). Midden: Nadat de golven een afstand hebt verplaatst overeenkomend met λ/4 met betrekking tot het bovenste gedeelte, de faseverschuiving is null en beide golven versterken via constructieve storingen, produceren een staande golf van hogere amplitude. Onder: Nadat de golven hebben een extra afstand van λ/2 verplaatst (dus een totaal van λ / 4 + λ/2 = 3/4 λ van de hoogste verwijzing), de fase verschuiving wordt null weer, het produceren van een staande golf van hoge amplitude maar met omgekeerde polariteit. Opmerking sommige posities binnen het pad hebben een constante null druk (knooppunt, zwarte cirkels) terwijl andere standpunten voortdurend oscilleren tussen de minimale en maximale druk (ordende, groene cirkels). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: groeiende cellen op akoestisch transparante polyesterfolie. De figuur toont het onderste gedeelte van een 35 mm-schotel met een grote 12 mm gat in het midden. Het gat is vervolgens bedekt met een dunne polyester film. De film is stevig op de externe onderkant van de schotel met behulp van marine grade epoxy gelijmd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: uitvoering van de set-up van een echografie om een rechtop fluorescentie Microscoop. Een op maat gemaakte watertank wordt geplaatst onder een rechtop fluorescentie Microscoop zonder verzonden verlichting hardware. Een gemotoriseerde monsterhouder Geplaatst onder de doelstelling is aan onderdelen van de optomechanische bevestigd aan de trillingen tabel buiten de tank gekoppeld. De transducer is onder het monster geplaatst en gekoppeld aan een fase van de vertaling op de onderdelen van de optomechanische binnen de tank aangebracht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: schema van de gehele set-up. De set-up bevat een epi-fluorescentie rechtop fluorescentie Microscoop zodat fluorescentie beeldvorming van gekweekte cellen. De transducer wordt weergegeven met een schuine stand ten opzichte van de optische weglengte. Deze configuratie voorkomt neerwaarts reflectie van akoestische golven langs het akoestische pad, waardoor staande golf vorming en/of herhaalde stimulatie van het monster met meerdere echografie echo's. Een gewenste golfvorm wordt geproduceerd door een functiegenerator die kan worden handmatig ingeschakeld of elektronisch getriggerd door een computerinterface (Transistor-Transistor-Logic of Universal Serial Bus). De amplitude en de vertraging van het signaal door de hydrofoon naald (rood) gemeten kunnen worden geanalyseerd met behulp van een oscilloscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: voorbeeld van calcium LIPUS-geïnduceerde signalen in menselijke glioblastoma cellen A-172. (A) Raw fluorescentie afbeelding van A-172 cellen gegroeid op een 35 mm polyester-onder cultuur schotel en geladen met een cel-permeant versie van de calcium-indicator Fluo-4. De rode sporen vertegenwoordigen celbegrenzing automatisch geïdentificeerd door een computerprogramma en aangeduid als de regio's van belang (ROI). (B) tijdsverloop relatieve fluorescentie wijziging (F_t-F0/f₀, of ΔF/F₀) voor elke ROI tijdens een LIPUS experiment. Beelden werden verworven bij een snelheid van 1 beeld per seconde door een standaard CCD-camera en LIPUS werd toegepast voor 10 s tussen 20 en 30 frames. De golfvorm van de LIPUS bestaat uit 100 µsec pulsen met 400 cycli bij 4 MHz en herhaald elke 10 ms voor 10 s. (C) Plot met het tijdsverloop van de gemiddelde ΔF/F₀ berekend voor alle ROIs (foutbalken niet weergegeven). (D) Plot tonen het percentiel van ROI ΔF/F₀ boven de drempel van een zelfgedefinieerde activering tentoonstellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Een grote voordeel van geconcentreerd ultrageluid is haar vermogen om te leveren niet-gebeurt mechanisch en/of thermische energie aan biologische monsters met een hoge spatio-temporele precisie. Andere technieken die mechanisch stimuleren cellen meestal dienst invasieve fysische sondes (bijvoorbeeld cel-prikken) of de interactie van energierijke laserstralen met vreemde voorwerpen (bijvoorbeeld optisch pincet) vereist. Magnetische verwarming kan verhitten specifieke ruimtelijke locaties binnen biologische monsters maar vereist de aanwezigheid van buitenlandse magnetische nanodeeltjes. Aan de andere kant, nauwkeurige, niet-invasieve verwarming van kleine steekproef (bijvoorbeeld celculturen) in waterige media is mogelijk met behulp van infrarood of magnetron excitatie^17,18,19.

Aangezien de commerciële systemen kunnen uitvoeren van de echografie excitatie in combinatie met fluorescentie microscopie niet beschikbaar zijn, hebben vele biophysicists aangepaste systemen die zijn toegesneden op hun specifieke toepassingen^{8,12 gemaakt ,13,20}. De uitvoering van dergelijke systemen kunnen echter moeilijk voor niet-experts. In dit artikel beschreven de Basisbediening om te rijden een lichtbundel geconcentreerd ultrageluid richting het brandvlak van een rechtop epi-fluorescentie Microscoop doel terwijl het beperken van akoestische reflecties en staande golven voorwerpen die worden geproduceerd bij mismatch akoestische impedantie interfaces. Deze akoestische artefacten zijn geen meestal expliciet rekening in de gepubliceerde literatuur.

Als de interface van de vloeistof-deeltjes gevormd door de voorste lens van een ondergedompeld doelstelling met behulp van een akoestische lichtbundel loodrecht op de optische weglengte, de bundel zal uiteindelijk ondervindt of, als een doelstelling van de lucht wordt gebruikt, wordt het water-lucht interface boven het monster. Deze interfaces zal weerspiegelen de akoestische golven terug naar het monster, productie van staande golven (Zie Figuur 1). Wilt verminderen of voorkomen van deze overwegingen, is het aanbevolen om de positie van de transducer met een schuine hoek ten opzichte van de optische weglengte van.

Het gebruik van polyester-onder cultuur gerechten niet alleen minimaliseren akoestische reflecties geproduceerd door de dikke plastic cultuur gerechten onderkant, hierdoor ook het Vejle ter stimulering van het monster van onder met een rechtop Microscoop. Dit is een voorkeur configuratie in vergelijking met een omgekeerde Microscoop positie een ondergedompeld transducer met een schuine oriëntatie ten opzichte van de optische weglengte.

Dit protocol is ontworpen voor gebruik met gerichte echografie omvormers, maar Vejle kan ook niet-gericht (vlakke) echografie omvormers ook gebruiken. Merk op dat, aangezien LIPUS is bedoeld voor precieze stimulatie van gewenste gebieden binnen weefsel, gerichte ultrasoon transducers voor zowel in vitro als in vivo toepassingen in het algemeen de voorkeur. Akoestische balken geproduceerd door vlakke omvormers zijn ook breder, waardoor het moeilijker om reflecties en andere mechanische artefacten te verminderen.

De focale zone van een enkel element gericht echografie transducer is afhankelijk van vele parameters, zoals het element diameter, de akoestische frequentie en de correcte snelheid van het teeltmateriaal. Voor een standaard MHz transducer beperkt het focusgebied is meestal een millimeter of sub millimeter regio. Een wisselwerking bestaat tussen de grootte van de focale zone en het vermogen van de akoestische lichtbundel te penetreren binnen weefsel zonder teveel verlies als gevolg van demping: hoe hoger de frequentie, hoe kleiner de focale zone maar hoe zwakker de penetratie.

Effectief stimuleren van cellen gevisualiseerd onder een Microscoop, moet de akoestische focale zone van de transducer overlappen met de optische brandvlak van de doelstelling. Voor dit doel is het noodzakelijk nauwkeurig uitlijnen de akoestische balk met behulp van een commercieel beschikbare hydrofoon. Er zijn twee hoofdtypen hydrophones: hydrofoon naalden en vezel optische systemen. Beide typen kunnen worden gebruikt. Tijdens de uitlijning is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de akoestische intensiteit binnen de grenzen van de druk van de hydrofoon is en dat de frequentie van de transducer binnen het frequentiebereik van de hydrofoon gevoeligheid is.

Gebruik de kalibratie geleverd door de fabrikant (indien beschikbaar) de spanning amplitude output van de hydrofoon omzetten in werkelijke akoestische druk (hydrophones zijn meestal gekalibreerd met een nummer in V Pa^-1 - of vergelijkbare eenheden). Hydrophones hebben meestal ook een preferentiële oriëntatie (directionaliteit) met betrekking tot de akoestische bundel, dus bij voorkeur wordt de hydrofoon plaatsen in dezelfde richting van de akoestische as. Als dat niet mogelijk, hydrophones wellicht een grafiek van demping vs. directionele hoek, waardoor directionele na correctie na de metingen zijn genomen.

Beam uitlijning kan een frustrerende taak, vooral wanneer een transducer met een smalle focale zone. Het hydrofoon signaal moet worden weergegeven met een vertraging ten opzichte van de besturen van de transducer pols. Deze vertraging komt overeen met de tijd genomen door de echografie reis van van de transducer oppervlak naar de hydrofoon-sonde (in water, geluidsgolven reizen met een snelheid van ongeveer 1.500 m s^-1) (Zie Figuur 4). Opmerking dat de vertraging van RF signalen reizen door elektriciteitskabels is klein, slechts ongeveer 3 ns m^-1, die in het onderhavige geval, kunnen veilig worden genegeerd. Een manier om te testen of de lichtbundel is goed uitgelijnd is het berekenen van de afstand tussen omvormer en hydrofoon met behulp van de vertraging bij de oscilloscoop en de bekende goede snelheid in water gemeten. Bijvoorbeeld, wordt een vertraging van ongeveer 17 µs verwacht voor een transducer met een brandpuntsafstand van 25 mm.

Als het gebruik van commerciële hydrofoon niet mogelijk is (bijvoorbeeld ongebruikelijke transducer frequentie met niet overeenkomende hydrophones of beperkte ruimte voor het plaatsen van de hydrofoon), de akoestische lichtbundel kan worden afgestemd op de pulse-echo methode²⁰. Dit wordt meestal gedaan door het eerste plaatsen een klein reflecterend voorwerp van een grootte vergelijkbaar of kleiner zijn dan de diameter van de lichtbundel van de transducer in de focus binnen het gezichtsveld van de Microscoop. De transducer wordt vervolgens gebruikt als akoestische emitter (verzenden ultrasone pulsen) en ontvanger (om te ontdekken de echo van de reflecterende object). Merk op dat in deze configuratie, een speciale versterker nodig is om het coming out van de transducer vrij klein echo-signaal versterken.

Voor de goede werking van RF-instrumenten is het belangrijk dat alle kabels en verbindingen met instrumenten overeenkomende elektrische impedantie, anders ongewenste elektrische reflecties zal optreden en de elektrische golfvorm wijzigen. Dit is meestal het geval met de meeste bajonet Neill-Concelman (BNC) kabels en RF apparatuur hebben 50 Ω impedantie. Sommige oscilloscopen, echter, hebben een hoge ingangsimpedantie van 1 MΩ en dus zal weerspiegelen dat een RF signaal gevoed via een 50 Ω BNC kabel. In dit geval moet een eenvoudige 50 Ω feed-via terminator worden ingevoegd tussen het einde van de BNC-kabel en de oscilloscoop van input te beëindigen correct het signaal zonder verlies.

Deze methode is technisch beperkt door de instrumentatie die is gebruikt voor het leveren van ultrasone pulsen en uit te voeren van de fluorescentie imaging. Een standaard single-photon fluorescentie Microscoop zou bijvoorbeeld alleen inschakelen voor beeldvorming van tweedimensionale monsters. Echter het kan het uitvoeren van meer complexe LIPUS beeldvorming van driedimensionale monsters zoals hersenen plakjes of kleine organen met behulp van meerdere foton excitatie.

Een andere uitdaging met LIPUS experimenten is te onderscheiden van mechanische vs. thermische effecten bijgebracht door akoestische balken. Een schuin naar de optische weglengte van mechanische verplaatsing kan worden gedetecteerd als het verdringt de afbeelding in de vliegtuig-as (x, y) of defocuses van het monster in de z-as. Deze verplaatsingen, is afhankelijk van de gecombineerde optische resolutie van de Microscoop camera en doel. Bovendien, als deze ontwerpresoluties alleen tijdens ultrasoonapparaat optreden zou, zou een moeten gebruiken een framesnelheid hoog genoeg om de temporele overlap tussen blootstelling en pulsstand duur van de camera te synchroniseren.

Om te onderzoeken echografie-geïnduceerde thermische effecten, de gebruik conventionele fysieke sondes voor het meten van de temperatuur wordt niet aangeraden vanwege onvermijdelijke trillingen van de sonde. De hier beschreven techniek is echter goed geschikt voor het meten van temperatuurveranderingen met behulp van genetisch-gecodeerde hittegevoelige fluorescentie verslaggevers of hittegevoelige kleurstoffen^21,22. Naarmate er meer biocompatibel fluorescerende verslaggevers beschikbaar komen, zal deze techniek in de toekomst, de studie van echografie effecten op veel andere biofysische parameters inschakelen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
upright microscope with large working volume	Thorlabs	CERNA
upright microscope with large working volume	Scientifica	SliceScope
optomechanical components	Thorlabs	n/a
needle hydrophone	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone	Precision Acoustics	n/a
fiber optic hydrophone	ONDA Corporation	HFO series
fiber optic hydrophone	Precision Acoustics	n/a
oscilloscope	Keysight Technology	DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator	Keysight Technology	33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier	Electronic Navigation Industries (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier	Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer	Olympus	focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer	Benthowave Instrument	HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer	Precision Acoustics	Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer	Ultrasonic-S-lab	HiFu transducers made to order
high-density Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns	Chemplex	CAT.NO:107