Summary
בעוצמה נמוכה פעמו אולטרסאונד גירוי (LIPUS) הוא מודאליות עבור גירוי מכני לא פולשנית של תאים אנדוגני או מהונדסים עם רזולוציה גבוהה של יכולות. מאמר זה מתאר כיצד ליישם את LIPUS כדי במיקרוסקופ epi-זריחה וכיצד למזער את אי התאמה של עכבה אקוסטיים לאורך השביל אולטרסאונד כדי למנוע חפצי מכני לא רצויים.
Abstract
על ידי התמקדות פולסים אולטרה סאונד בעוצמה נמוכה לחדור רקמות רכות, LIPUS מייצג טכנולוגיה ביו מבטיח מרחוק ובבטחה לתפעל ירי עצבית, הפרשת ההורמונים ותאים מחדש מבחינה גנטית. עם זאת, התרגום של טכנולוגיה זו עבור יישומים רפואיים היא כיום הקשו על ידי חוסר של מנגנונים הביו-פיסיקלי שבו ממוקד רקמות הגיוני ולהגיב LIPUS. בגישה מתאימה כדי לזהות מנגנונים אלה יהיה לשימוש אופטי ביולוגיים בשילוב עם LIPUS כדי לקבוע שבבסיס איתות המסלולים. עם זאת, יישום LIPUS כדי מיקרוסקופ פלורסצנטיות יכול להכיר רצויה חפצי מכני בשל נוכחותם של ממשקים פיזיים לשקף, לספוג, מסיטים גלים אקוסטיים. מאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב כדי לשלב את LIPUS כדי זמין מסחרית זקוף epi-זריחה מיקרוסקופים תוך מזעור ההשפעה של ממשקים פיזיים לאורך השביל אקוסטית. הליך פשוט מתואר לפעול מתמר אולטרסאונד רכיב אחד וכדי להכניס את אזור מוקד של המתמר מוקד אובייקטיבית. השימוש LIPUS מודגם עם דוגמה של סידן LIPUS-induced שנחשולי בתאים בתרבית גליובלסטומה האדם נמדד באמצעות הדמיית סידן.
Introduction
מחלות רבות דורשות צורה כלשהי של התערבות רפואית פולשנית. הליכים אלה לעיתים יקר, מסוכן, דורשים ותקופות התאוששות, ובכך להוסיף נטל מערכות הבריאות. פולשני שיטות טיפוליות יש פוטנציאל לספק חלופות בטוחות יותר וזול יותר ניתוחים קונבנציונלי. אולם, לגישות פולשני כגון גירוי מגנטי pharmacotherapy או טראנס מוגבלים לעיתים קרובות על ידי הפשרות בין חדירה לרקמות, ייתכן רזולוציה ואפקטים את המטרה לא רצויים. בהקשר זה, אולטרסאונד ממוקד מהווה טכנולוגיה לא פולשנית מבטיחה עם פוטנציאל לתמרן תפקודים ביולוגיים עמוק בתוך רקמות עם רמת דיוק גבוהה ייתכן ואפקטים את המטרה מוגבל.
אולטרסאונד ממוקד גירוי מורכב אספקת אנרגיה אקוסטית-מיקומים מדויקים עמוק בתוך אורגניזמים חיים. בהתאם הדופק אקוסטית פרמטרים, אנרגיה זו יכול להיות מגוון רחב של שימושים רפואיים. למשל, מינהל המזון והתרופות שאושרה השימוש אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה (HiFU) על אבלציה תרמי של גידולים בערמונית, אזורים במוח הגורמים רעד, מיומות, גרימת כאב חיבורי עצבים גרורות בעצמות1 . Microbubble המוביל בתיווך HiFu קוויטציה משמש גם לפתיחת מחסום הדם - מוח למסירה יישוב של הרפוי מערכתית בניהול2transiently. עוצמת הדופק הממוצע המרחבי-לשיא (אניsppa) ועוצמת טמפורלית הממוצע המרחבי-לשיא (אניspta) המשמש HiFU יישומים הם בדרך כלל מעל kW כמה ס מ-2 ולייצר לחץ דופק של כמה עשרות של MPa. אלו ערכי העוצמה גם הרבה מעל ה-FDA אישר ליsppa ואניspta מגבלות עבור אבחון אולטרסאונד, W 190 ס מ-2 ו- 720 mW ס מ-2,3בהתאמה. לעומת זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי גירוי אולטרסאונד פעמו הרסניות הנמצאים בתוך או ליד הטווח של אבחון אולטרסאונד בעוצמה גבולות (LIPUS) יכול להיות יעיל מרחוק ובבטחה לתפעל עצבית ירי4, 5,-6,-7,-8,9,הפרשת ההורמונים10 והנדס תאים11. ובכל זאת, מנגנוני תאית ומולקולרית שבו תאים לחוש ולהגיב אולטרסאונד עדיין אינן ברורות, מסלק קליניים תרגום של LIPUS. לכן, בשנים האחרונות, מחקרים של ממברנות מלאכותיות, תאים בתרבית וחיות מגורה עם אולטרסאונד קיבלו תנופה כדי לחשוף biophysical, תהליכים פיזיולוגיים מווסת על ידי LIPUS12,13, 14,15.
צליל מורכב רטט הפצת דרך תווך הפיזי. אולטרסאונד היא צליל עם תדירות בגובה שמיע אנושי (קרי, מעל 20 קילוהרץ). באווירה מעבדה, גלי אולטרסאונד מופקים בדרך כלל על ידי מתמרים פיזואלקטריים המכילים חומר רוטט בתגובה שדה חשמלי נדנוד פס בתדירות גבוהה ספציפיים. קיימים שני סוגי מתמרים: יחיד רכיב מתמרים ומערכים מתמר. מתמרים פיזואלקטריים רכיב יחיד בעלי משטח מעוגל אשר משמש עדשה התמקדות, ומכאן מתרכזת אנרגיה אקוסטית לתוך אזור מוגדר נקרא אזור מוקד. אלמנט יחיד מתמרים הם יותר זול וקל לתפעול מאשר מתמר מערכים. מאמר זה יתמקד מתמרים רכיב יחיד.
הגודל של האזור מוקד של מתמר ממוקד רכיב יחיד תלוי על מאפיינים גיאומטריים של העדשה אקוסטית תדירותו אקוסטית. כדי להשיג מילימטר-גודל אזור מיקוד עם מתמר רכיב יחיד, אולטרסאונד תדרים בטווח MHz נדרשים בדרך כלל. למרבה הצער, גלים אקוסטיים בתדר כזה הם מהר מאוד הקלוש כאשר הופץ במדיום רפים כגון אוויר. לפיכך, גלי אולטרסאונד MHz צריך להיות שנוצר להפיץ את הדגימה מהותי צפופה כמו מים. זה מהווה את האתגר הראשון בשילוב LIPUS לערוץ מיקרוסקופ.
האתגר השני הוא למזער ממשקים פיזיים בין חומרים עם שונה אקוסטית impedances (שהיא תוצר של צפיפות גשמי, המהירות אקוסטית) לאורך השביל אקוסטית. ממשקים אלה יכול לשקף, מסיטים, פיזור ולקלוט גלים אקוסטיים, ולכן קשה לכמת את כמות האנרגיה אקוסטית ביעילות למסור דגימה. הם גם עלולים ליצור חפצי מכני לא רצויים. למשל, השתקפויות אי-התאמה בניצב אקוסטית המיוצר עכבה ממשקים ליצור גלים backpropagating להפריע אלה הפצת קדימה. לאורך השביל הפרעות, הגלים לבטל אחד את השני בכל האזורים קבוע של רווחים בשם צמתים סכום למעלה-לסירוגין אזורים בשם אנטי-צמתים, יצירת גלים עומדים כביכול (איור 1). חשוב experimentalist היכולת לשלוט או לחסל אלה ניסיוני ממשקי חוץ גופית בתוך כפי שהם אינם יכולים להתקיים בתוך vivo.
פלורסצנטיות מדידה של כתבים אופטי הוא שיטה ידועה לחקור דגימות ביולוגיות שקוף בזמן אמת, עם הפרעות גופניות. גישה זו ולכן אידיאלי ללימודי LIPUS כמו כל רגשים הפיזית הנוכחים בשטח sonicated תציג חפצי מכני. פרוטוקול זה מתאר את יישום ותפעול של LIPUS כדי מיקרוסקופ אפינפרין מסחרי-זריחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול תאים על הסרט פוליאסטר שקוף המתקפלות
- תרגיל בגודל 12 מ"מ חור בתחתית לצלחת תרבות רגיל 35 מ מ באמצעות העיתונות-תרגיל אנכי. את התרגיל לאט לאט, לענוד הגנה העין. הסר את חתיכות הפלסטיק המצורף בתחתית המנה באמצעות סכין כדי ליצור משטח חלק בצד החיצוני (איור 2).
- למרוח שכבה דקה של ימית-כיתה אפוקסי או דבק על פני השטח החיצוני התחתון של המנה.
- במקום סרט של פוליאסטר (עובי 2.5 מיקרומטר) נגד מהמשטח התחתון חיצוני של המנה ולחץ בחוזקה כדי לוודא שהאפוקסי/הדבק מתפשט באופן שווה בין הסרט לבין משטח הפלסטיק עבה. משוך בעדינות את הסרט בצורה צנטריפוגלי עם האצבעות כדי ליצור משטח שטוח (איור 2).
- כאשר האפוקסי/הדבק התייבש, בקצרה שטיפה יבשה פוליאסטר-התחתון צלחת עם 95% אתנול ולחטא על-ידי הצבת המנה ובתוך המשטח של המכסה שלה תחת חזקה 254 ננומטר UV עירור מקור. להתאים את משך ועוצמת לספק מנה UV של 330 אמ ס מ-2 להרס מוחלט של רוב סוגי מיקרו אורגניזמים. אנרגיה זו כ מקביל משך זמן של 5 דקות באמצעות של-2 ס מ µW 1,000 UV תאורה.
- Aliquot מטריצה חוץ-תאית זמינים מסחרית חלבון תערובות (EMPM) ב שפופרות קטנות (µL 50-100) וחנות אותם ב-20 ° C או פחות בתנאים סטריליים.
- בסביבה סטרילית (למשל, בתוך ארון אבטחה), לדלל מלאי קפוא של EMPM עם המדיום התרבות הרצויה כדי מטריים. לעבוד על קרח כדי למנוע EMPM פלמור בטמפרטורת החדר. להחיל במהירות 100 µL של התערובת בינונית על הסרט פוליאסטר. מניחים את המכסה בחזרה על המנה כדי לשמור על עקרות.
- דגירה התחתון פוליאסטר מצופה EMPM מנות תרבות CO תא2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6-12 שעות.
- לאחר דגירה, תשאף המדיום עודף, זרע ישירות השטח עם תאים על הצפיפות הרצויה. עבודה בתנאי סטרילי כדי לשמור על עקרות.
2. LIPUS יישום
- מקום מיכל מים מתחת המטרה של מיקרוסקופ זקוף עם נפח עבודה גדול, ללא תאורה בחומרה נתיב השידור.
- באמצעות רכיבי optomechanical זמין מסחרית, מקום בעל מדגם מתחת המטרה ומחזיק מתמר מתחת המחזיק לדוגמה. הדגימה הבאים ליישור חיפוש ואולטרסאונד, הר אלה שני בעלי שלבים תרגום.
- מניחים את חלקי נע, מפעילים של שלבי התרגום מחוץ למיכל או מעל קו המים כדי למנוע נזקי מים. השתמש רק חומרי מתכלה כגון אלומיניום או נירוסטה עבור רכיבי optomechanical שקוע.
- למלא את המיכל מים יונים degassed לפני ניצול מתמר טבילה. קו המים צריך לחפוף עם מישור האופקי של בעל מדגם (איור 3).
הערה: מים יונים מונעת צימוד חשמלי בנוכחותו של שדות חשמליים גבוהה. Degassing תמנע גם פיזור והשינויים של גלים אקוסטיים. מרוקנים את המים לאחר כל הניסוי באמצעות משאבה או שסתום כך קו המים יורד מתחת המיקום של המתמר. בנוסף, להחליף או לסנן את המים לעתים קרובות וניקיון למיכל המים כנדרש, כדי למנוע צמיחה של מיקרואורגניזמים.
3. המלוכסן עירור אקוסטי
- באמצעות רכיבי optomechanical זמינים מסחרית, אוריינט המתמר בעמדה אלכסונית ביחס הנתיב אופטי. פעולה זו תבטיח כי כל משתקפת גלים יופנו מן המדגם (איור 3 ו- 4 באיור).
4. נהיגה מתמר
הערה: אולטרסאונד מתמרים להמיר אנרגיה חשמלית נדנוד מכני התרחבות להתכווצות של חומר פיזואלקטריים. המרה זו מפיקה אובדן אנרגיה בצורה של אנרגיית חום. לפיכך, בעוד מתמרים בעלי מגבלה קלט מתח שיא, הם גם בעלי גבול חשמל כדי למנוע נזק תרמי אלמנט פיזואלקטריים:
בחובתה מחזור השבר היחסי של זמן של סימולציה חשמל, P החשמל (בוואט), Vrms המתח שורש-ממוצע-הריבועים קלט (ב וולט) של מקור מתח חלופי ו- Z חשמל עכבה (ב אוהם).
עם Vpp המתח קלט שיא אל שיא שהוחל המתמר.
- ליצור טופס גל sinusoidal המכיל את התדירות הרצויה, מספר מחזורי לפי הדופק, ואין דופק תדירות חזרה באמצעות גנרטור פונקציה מסחרית. עם זאת, Vpp גבוה יחסית צריך לנהוג ביעילות את אולטרסאונד רגיל מתמרים, לעיתים קרובות דורש התוספת של מגבר כוח כדי להגביר את הפלט (קרי, להגדיל משרעת של Vpp) של הגנרטור פונקציה.
הערה: לדוגמה, היצרן של מתמר מציין את מגבלת כוח עבור מתמר נתון הוא 35. W Sinusoidal שיא אל שיא יזין מתח (Vב) של 500 mV-חובה מחזור של 50% ו מוגבר באמצעות 50 dB/100 W מגבר להיות בתוך מגבלת הכוח של מתמר הזה?- כדי לענות על שאלה זו, לחשב את המתח לאחר הגברה. עבור מגבר כוח תדרי רדיו (RF), הגורם הגברה (dB) מוגדרת על-ידי:
לכן, יש מתח מוגבר של משרעת פלט Vpp (Vpp = Vהחוצה) של:
באמצעות משוואות 1 ו-2, באמצעות 50 Ω כמו עכבה חשמלית, הכוח המקביל שנוצר על ידי מתח זה הוא:
לגירוי הזה לכן בתוך מגבלת הכוח של המתמר. - באמצעות הדוגמה לעיל, לחשב את צורת גל הפרמטרים (Vpp, תדירות, משך פעימה, תדירות החזרה דופק) התואמים מגבלות הכוח ומתח שסיפק היצרן של המתמר. ודא לכבד את מגבלות אלה כדי למנוע נזק המתמר ומכשירים אחרים המחוברים.
- כדי לענות על שאלה זו, לחשב את המתח לאחר הגברה. עבור מגבר כוח תדרי רדיו (RF), הגורם הגברה (dB) מוגדרת על-ידי:
- לבחור גנרטור פונקציה הפועלת בתוך טווח תדר תואם מתמר האולטרסאונד. התאם את התדירות של מחולל על תדירות שיא הנומינלי של המתמר.
- ליצור מתח sinusoidal הדופק הרצוי משך, תדירות חזרה באמצעות מצב פריצה של הגנרטור פונקציה. התאם מתח שיא אל שיא לערך הרצוי. ודא כי משך הדופק הוא קצר יותר מאשר הזמן שחלף בין שני פולסים עוקבים.
- בדוק כי waveform תואם האות הרצויה על-ידי חיבור הפלט של מחולל הקלט של תנודות.
- לחבר את הפלט של מחולל הקלט של מגבר RF כוח (איור 4). ודא כי הפרמטרים גירוי הם בגבולות היצרן של המתמר.
5. קרן יישור
- לבחור הידרופון ופועלת עם תדר בטווח ואקוסטית בעוצמה תואם תדירות ועוצמת מתמר אולטרסאונד.
- בזהירות להכניס את קצה בדיקה הידרופון מוקד בתוך שדה הראייה האובייקטיבית במיקום המתאים למיקום של המדגם (איור 4).
- ודא כי המכשיר והן מתמר שקועים במים יונים ו- degassed. לא להקפיץ את קצה ההידרופון עם אובייקט פיזי כלשהו מלבד מים זה לשנות את ציפוי שלה, להשפיע על המדידה.
- לבצע יישור קדם ברוטו של המתמר על-ידי חזותית מיקום ציר אקוסטית לעבר החללית הידרופון. מוודא כי המרחק בין פני השטח של המתמר הטיפ הידרופון שיתאימו כ אורך מוקד של המתמר.
- להתחבר ההידרופון פלט לאחת אות קלט של אוסצילוסקופ. להתחבר על ההדק סינכרון מ מחולל אותות קלט אוסצילוסקופ אחר. דמיינו שני אותות בו זמנית על אוסצילוסקופ.
- כונן המתמר עם כמה מחזורים אולטרסאונד מחזור נמוך, משרעת נמוכה כדי למנוע נזק החללית. בדוק בתנאים של ההידרופון יצרן פעולה בטוחה כדי למנוע נזק הטיפ הידרופון.
- התאם את כפתור s/חלוקה לפי משך הנסיעה של אולטרסאונד ממשטח של המתמר על ההידרופון. חפשו אות הידרופון אוסצילוסקופ לאחר ההדק סינכרון.
- לאט לאט להניע מתמר באמצעות שלב XYZ ממונע או ידנית. יוצאים המתמר למצב זה לא מופיע עם האות הידרופון מקסימלי (איור 4).
הערה: אם אין אות זוהה זה אפשרי כי האינטנסיביות של הפולסים אקוסטית הוא נמוך מדי או הקרן כי מיושרים או מפוזרים על-ידי אובייקט. בדוק בקביעות כי הידרופון של מתמר הן מבחינה ויזואלית מסודרים מראש כי אין בועות או האובייקט הפיזי נמצאים בנתיב מלבד הסרט פוליאסטר. אם אין אות עדיין מזוהה, תגביר את המתח קלט על-ידי כמות קטנה כדי להגדיל את משרעת הידרופון אות.
6. קביעת לחץ דופק באולטרסאונד ועוצמה
- בעזרת קרן מיושר, למדוד את משרעת השיא אל שיא של ההידרופון פלט-אוסצילוסקופ עבור מתחים שונים נהיגה המתמר. ודא שלא לחרוג ממגבלת לחץ המומלץ על ידי היצרן של ההידרופון.
- להמיר מדידות אלה לחץ ו/או ערכי העוצמה אקוסטית בשיטת הכיול שסיפק היצרן של ההידרופון.
הערה: ניתן לקבוע את עוצמת אקוסטית מן הלחץ ולהיפך תוך שימוש בנוסחה:
עם אני הלחץ אקוסטית (ב W ז-2), P לחץ אקוסטי (ב- Pa), ρ הצפיפות של הפצת חומר (1,000 ק"ג מ-3 למים) ו- c מהירות הקול ב הפצת בינוני (מים, c = 1,500 מ' s-1). - ליצור עקומות כיול באמצעות מדידות אלה.
הערה: לחץ לעומת מתח ועוצמה מול מתח העקומות יש צורה קווית, פרבוליות, בהתאמה. - לקבוע את הערך לחץ ו/או בעוצמה של מתח נהיגה הרצוי באמצעות עקומת כיול המתאימים.
7. סידן-רגיש/LIPUS לחיות תאים פלורסצנטיות הדמיה
- להחליף בינוני תרבות של התא עם מאגר ההדמיה הרצויה המכיל 5 מיקרומטר של צבע סידן תלויית התא-permeant (למשל, אני Fluo-4). דגירה המנה תרבות ב חממה2 CO ב 37 ° C עבור 1 h.
- לשטוף היטב תאים עם המאגר אותו ללא צבע.
- הכנס את המאכל בעל מדגם. לרגש את התאים באמצעות תאורה אור כחול (490 nm) ולהתאים את עוצמת עירור וחשיפת המצלמה כדי למנוע עודף רוויה הלבנה או פיקסל.
- לבצע הדמיה בצילום מואץ באמצעות הגדרות רכישת התמונה הרצויה. השתמש אובייקטיבית טבילה איכות תמונה טובה יותר, ועם זמן ומרחק עבודה כדי לצמצם השתקפויות רצויה (ראה איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 5 הוא דוגמה של ניסוי LIPUS מרובב עם סידן הדמיה. Glioblastoma תאים (A-172) היו גדל על EMPM מצופה פוליאסטר סרט בינוני תרבות רגיל (בתוספת 10% סרום ו 1% אנטיביוטיקה), מודגרות עם הכתב פלורסנט סידן רגיש Fluo-4 בבוקר. התאים היו עם תמונה באמצעות עדשה טבילה X 10 ומאוירות מקור אור LED לבן, אור זריחה נאסף באמצעות ערכה רגילה של מסנן ה-GFP. LIPUS הונחה על ידי באופן ידני על-ידי סחרור מתמר 4 מגה-הרץ עם צורת גל דופק 158 V משרעת השיא אל שיא, 0.1 ms הדופק משך, תדירות החזרה דופק 10 ms (קרי, מחזור 1% חיים). פרמטרים אלה שיתאימו אניsppa = 88 W ס מ-2 (מתחת למגבלת אבחון של W 190 ס מ-2)ואניspta = 877 ס"מ mW-2 (מעט מעל הגבול אבחון של mW 720 ס מ-2), בהתאמה. התוצאות מציגות לגירוי הזה מיוצר סידן חזקים הגבהים (איור 5B, 5 C, 5 D).
הדופק קצר המשכים (קרי, עם אין פיזור חום משמעותי במהלך הדופק) ובהנחה קיבול החום של המדגם (קרי, תאים שקוע בתוך תמיסה מימית של התבגרות בסרט פוליאסטר) דומה לזה של מים, השינוי של טמפרטורה (∆Tמקסימום) המיוצרים במהלך כל הדופק יכול להיות לפי אומדן16
עם משך פעימה של 0.1 ms ודופק בעוצמה של W 88 ס מ-2
∆Tמקסימום = 0.12 x 0.0001 x 88 ≈ 1 מ' ° C
עם מחזור 1%, כמות קטנה של חום שהופקדו באיזור מוקד במהלך לכל פעימה 0.1 ms סביר הוסר על-ידי הולכה תרמית במהלך ms 9.9 המורחב בין שני פולסים עוקבים. לפיכך, הסידן עמיד אותות ב איור 5B, 5 C, 5 D סביר המושרה על ידי mechanism(s)-thermal.
איור 1: היווצרות גל עומד על ממשק המשקף. הנוכחות של ממשק בין חומרים עם עכבה אקוסטיים שונים משקף נכנסות ללחץ גל (כחול) עם λ אורך הגל. מאז שני גלים לנוע בכיוונים מנוגדים, משמרת שלב נדנוד היא הוקמה. העליון: בשלב זה, המופע. ההתחלתי הוא 180°, הפקת התאבכות הורסת של הגל בעמידה (גל ירוק). האמצעי: אחרי הגלים עברו מרחק המתאים λ/4 ביחס בחלונית העליונה, המופע. ההתחלתי הוא null, בשני גלים להגביר דרך הפרעות בונה, בהפקת גל עומד של משרעת גבוהה יותר. התחתון: אחרי הגלים יש עברה של נוספים במרחק λ/2 (ומכאן סך של λ / 4 + λ/2 = 3/4 λ מההפניה העליון), השלב הופכים shift null שוב, בהפקת גל עומד משרעת גבוהה אך עם קוטביות ההופכי. הערה מספר משרות בתוך הנתיב שיש ובלחץ קבוע null (צומת, שחור מעגלים) ואילו תפקידים אחרים כל הזמן נעים בין לחצים מינימום ומקסימום (antinodes, עיגולים ירוקים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: גידול תאים על הסרט פוליאסטר שקוף המתקפלות. האיור מציג את החלק התחתון של תבשיל 35 מ מ עם חור גדול 12 מ מ במרכזו. החור הוא לאחר מכן מכוסה בשכבה דקיקה פוליאסטר. הסרט מודבק היטב לתחתית חיצוני של המנה באמצעות כיתה ימית אפוקסי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: יישום הגדרת אולטרסאונד כדי במיקרוסקופ פלורסצנטיות זקוף. מיכל מים בהזמנה אישית ימוקם תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות זקוף ללא תאורה המשודרת בחומרה. בעל מדגם ממונע מתחת המטרה מחוברת optomechanical רכיבים קבועים אל השולחן רטט מחוץ למיכל. המתמר מתחת המדגם, המצורפת שלב התרגום למוט optomechanical רכיבים בתוך הטנק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תרשים סכמטי של הסידור כולו. הסידור כולל מיקרוסקופ פלורסצנטיות זקוף epi-זריחה כדי לאפשר פלורסצנטיות הדמיה של תאים בתרבית. המתמר מוצג עם אוריינטציה אלכסונית ביחס הנתיב אופטי. תצורה זו מונע השתקפות לאחור של גלים אקוסטיים לאורך השביל אקוסטית, ובכך למנוע היווצרות גל עומד ו/או גירוי חוזרות של הדגימה עם הדים מרובים אולטרסאונד. Waveform הרצוי מופק על ידי גנרטור פונקציה שניתן באופן ידני דלוק או אלקטרונית המופעלות על-ידי ממשק המחשב (טרנזיסטור הטרנזיסטור-לוגיקה או אפיק טורי אוניברסלי). משרעת של עיכוב של האות נמדדת המחט הידרופון (אדום) ניתן לנתח באמצעות תנודות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: דוגמה של סידן LIPUS-induced אותות ב גליובלסטומה האנושי תאים A-172. (א) תמונת Raw זריחה של תאים A-172 גדל על צלחת תרבות למטה פוליאסטר 35 מ מ, נטען עם תא-permeant גירסה של סידן-מחוון Fluo-4. עקבות אדומים מייצגים גבולות תא המזוהה באופן אוטומטי על-ידי תוכנת מחשב ו מתויג בתור אזורים מעניינים (ROI). (B) מסלול הזמן השינוי היחסי קרינה פלואורסצנטית (Ft-F0/F0, או ΔF/F0) עבור כל רועי במהלך ניסוי LIPUS. תמונות היו רכשה במהירות של 1 מסגרות לשנייה על ידי מצלמה CCD רגיל, LIPUS היה מוחל על 10 s בין מסגרות 20 ו- 30. LIPUS waveform מורכב 100 פולסים µsec המכיל 400 מחזורים במהירות 4 מגה-הרץ, חוזר על עצמו כל 10 ms מגרש (C) ס' 10 מציג את מהלך הזמן רשע ΔF/F0 מחושבת עבור כל ROIs (קווי שגיאה לא מוצג). מגרש (D) מציג את האחוזון של רועי מפגין ΔF/F0 מעל סף ההפעלה על-ידי המשתמש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יתרון הראשי של אולטרסאונד ממוקד היא היכולת שלה לא-פולשנית להעביר אנרגיה מכנית ו/או תרמית דגימות ביולוגיות עם דיוק גבוהה-עתיים. טכניקות אחרות שנועדו מכנית לעורר תאים בדרך כלל מעסיקים רגשים הפיזית פולשני (למשל, תא-מציץ) או דורשת את האינטראקציה של קרני לייזר באנרגיה גבוהה עם חפצים זרים (למשל, מלקחיים אופטיים). חימום מגנטי יכול לחמם מיקומים מרחביים ספציפיים בתוך דגימות ביולוגיות, אך דורשת הנוכחות של חלקיקים מגנטיים זרים. מצד שני, חימום לא פולשנית מדויקת של מדגם קטן (למשל, תרביות תאים) בתקשורת מימית אפשרית באמצעות אינפרא-אדום או מיקרוגל עירור17,18,19.
מאז מערכות מסחריות מסוגל לבצע אולטרסאונד עירור בשיתוף עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ אינם זמינים, biophysicists רבים יצרו מערכות מותאמות אישית לצרכיו שלהם יישומים ספציפיים8,12 ,13,20. היישום של מערכות אלו, עם זאת, ניתן קשה שאינם מומחים. המאמר תיאר את הפעולה הבסיסית לנהוג קרן אולטרסאונד ממוקד לעבר המטוס מוקד מטרה מיקרוסקופ אפינפרין זקוף-ידי קרינה פלואורסצנטית תוך הגבלת אקוסטית חפצי השתקפויות, גלים עומדים, המיוצרים על אי התאמה אקוסטית עכבה ממשקים. מהיצירות אקוסטי לא נלקחים בדרך כלל במפורש בחשבון בספרות שפורסמו.
אם משתמש של קרן אקוסטית בניצב לנתיב האופטי, הרצון קרן בסופו של דבר נתקל הממשק נוזל נוזל מוצק נוצר על ידי העדשה הקדמית מטרה שקוע או, אם אובייקטיבית האוויר נמצא בשימוש, ממשק המים-האוויר מעל המדגם. ממשקים אלה ישקפו את הגלים אקוסטית לחזור המדגם, בהפקת גלים עומדים (ראה איור 1). כדי להקטין או למנוע השתקפויות אלה, מומלץ למקם המתמר עם זווית אלכסונית ביחס הנתיב אופטי.
השימוש של תרבות פוליאסטר-התחתון מנות לא רק לצמצם השתקפויות אקוסטית המיוצר על ידי החלק התחתון מנות תרבות פלסטיק עבה, בנוסף, הם מאפשרים את experimentalist לעורר את הדגימה מ מתחת עם מיקרוסקופ זקוף. זה תצורה עדיפה לעומת במיקרוסקופ הפוך למיקום של מתמר שקוע בעלת אוריינטציה אלכסונית ביחס הנתיב אופטי.
פרוטוקול זה תוכנן לשימוש עם אולטרסאונד ממוקד מתמרים, אך experimentalist עשויים גם להשתמש מתמרים שאינו ממוקד אולטרסאונד (מישוריים) גם כן. שימו לב כי, מאז LIPUS מיועד גירוי מדויק של האזורים הרצויים בתוך רקמת, אולטרסאונד ממוקד מתמרים עדיפים בדרך כלל עבור יישומים גם במבחנה וגם ויוו . קורות אקוסטית המיוצר על ידי מתמרים מישורי רחב יותר, וכך קשה יותר לצמצם השתקפויות וחפצי מכניות אחרות גם הם.
באזור מוקד של מתמר אולטרסאונד רכיב יחיד ממוקד תלויה בפרמטרים רבים כגון הקוטר רכיב, תדירות אקוסטית, את מהירות הקול של החומר כציוד. עבור מתמר MHz סטנדרטי, האזור מוקד בדרך כלל מוגבל באזור millimetric או תת millimetric. פשרה קיים בין הגודל של האזור מוקד ואת היכולת של הקורה אקוסטית לחדור לתוך רקמות ללא אובדן מדי עקב הנחתה: תדירות גבוה יותר, קטן יותר לאזור מוקד אבל כך החדירה.
לעורר ביעילות תאים דמיינו תחת מיקרוסקופ, באזור מוקד אקוסטית של המתמר חייב לחפוף המטוס מוקד אופטי של המטרה. לכוונה זו, יש צורך דווקא ליישר קרן אקוסטיים באמצעות הידרופון זמינים מסחרית. ישנם שני סוגים עיקריים של ההידרופונים: מחטים הידרופון ומערכות סיבים אופטיים. שני הסוגים יכולים לשמש. במהלך היישור, חשוב לוודא כי עוצמת אקוסטית הוא בגבולות לחץ ההידרופון ואת התדירות של המתמר נמצא בטווח תדר של הרגישות של ההידרופון.
השתמש הכיול המסופקים על ידי היצרן (אם זמין) כדי להמיר את הפלט משרעת המתח של ההידרופון בפועל לחץ אקוסטי (בדרך כלל עם מספר V הרשות-1 או יחידות דומות מכוילים ההידרופונים). ההידרופונים יש גם בדרך כלל כיוון מועדף (כיוון) לגבי הקורה אקוסטית, ולכן זה מהווה יעד מועדף למיקום ההידרופון באותו כיוון של הציר אקוסטית. אם לא אפשרי, ההידרופונים ייתכן תרשים של הנחתה לעומת כיוונית זווית, ומאפשרים כיוונית שלאחר תיקון אחרי המדידות נלקחו.
יישור קרן יכול להיות משימה מתסכלת, במיוחד כאשר ההפעלה מתמר עם מוקד אזור צר. האות הידרופון אמור להופיע עם עיכוב לגבי הדופק נהיגה המתמר. עיכוב זה מקביל הזמן נלקח על ידי באולטרסאונד לנסוע ממשטח של המתמר החללית הידרופון (במים, גלי קול הנסיעה במהירות של 1,500 מ' s-1) (ראה איור 4). הערה כי העיכוב של RF אותות נסיעה דרך כבלים חשמליים הוא קטן, רק על 3 ns ז-1, אשר, במקרה הנוכחי, ניתן להתעלם ממנה. דרך לבדוק אם הקרן מיושרים כראוי היא לחשב את המרחק בין מתמר הידרופון באמצעות עיכוב למדוד את אוסצילוסקופ, את מהירות הקול הידועים במים. למשל, צפוי עיכוב של 17 µs מתמר עם אורך מוקד של 25 מ מ.
אם השימוש הידרופון מסחרי אינו אפשרי (למשל, יוצא דופן מתמר תדירות עם לא תואמים ההידרופונים או שטח מוגבל להנחה ההידרופון), קרן אקוסטית ניתן ליישר את שיטת הדופק-אקו20. פעולה זו מתבצעת בדרך כלל על-ידי הראשון הצבת חפץ המשקף קטן בגודל דומה או קטן יותר הקוטר קרן של המתמר אל המוקד בתוך מיקרוסקופ שדה הראייה. המתמר משמש לאחר מכן הן פולט אקוסטית (לשלוח פולסים אולטרסאונד) ומקלט (כדי לזהות את ההד מהאובייקט המשקף). שים לב בתצורה זו, מגבר ייעודי הוא הכרחי להיקלט הד קטן למדי יוצא המתמר.
על פעולה חלקה של מכשירים RF, חשוב כי כל הכבלים, חיבורים מכשירים יש התאמת עכבה חשמלית, אחרת רצויה השתקפויות חשמל להתרחש, לשנות את צורת גל חשמלי. . זה בדרך כלל המקרה עם רוב הכידון ניל-Concelman (BNC) כבלים וציוד RF שיש 50 Ω עכבה... משקפי תנודות מסוימות, עם זאת, יש עכבת גבוהה של 1 MΩ, ובכך תשקף שאות RF מוזן דרך 50 Ω כבל BNC. במקרה זה, פשוט 50 Ω דרך-מחסל צריך להיות מוכנס בין הקצה של כבל BNC קלט של אוסצילוסקופ לסיים כראוי את האות ללא הפסד.
בשיטה זו הוא מוגבל טכנית על ידי המכשור משמש להעברת פולסים אולטרסאונד לביצוע דימות קרינה פלואורסצנטית. לדוגמה, מיקרוסקופ רגיל פוטון בודד פלורסצנטיות תאפשר רק הדמיה של דגימות דו-ממדית. עם זאת, הוא יכול לבצע הדמיה LIPUS מורכבים יותר של דוגמאות תלת מימדי כמו פרוסות המוח או איברים קטנים באמצעות עירור פוטון מרובה.
אתגר נוסף עם ניסויים LIPUS היא להבחין מכני לעומת מהשפעות תרמיות המוקנית על ידי קורות אקוסטית. ניתן להבחין תזוזה מכני המלוכסן לנתיב האופטי אם זה מזיחה את התמונה בהציר המטוס (x, y) או defocuses המדגם על ציר z. Displacements אלה תלויות רזולוציה אופטית משולבת של מיקרוסקופ המצלמה ואת המטרה. בנוסף, כמו תנועות אלה יתרחש רק במהלך sonication, אחד היה צריך להשתמש קצב מסגרות גבוה מספיק כדי לסנכרן את החפיפה הזמנית בין המצלמה משך החשיפה ודופק.
לחקור אולטרסאונד-induced מהשפעות תרמיות, השימוש קונבנציונאלי הגששים הפיזי כדי למדוד טמפרטורה לא מומלץ בגלל ויברציות בלתי נמנע של המכשיר. אולם, בטכניקה המתוארת כאן היא מתאימה למדידת שינויי טמפרטורה באמצעות מקודד גנטית thermosensitive קרינה פלואורסצנטית כתבים או thermosensitive צבעי21,22. בעתיד, כמו עוד עיתונאים פלורסנט מסתיימים יהפכו לזמינים, טכניקה זו יאפשר לימוד סאונד אפקטים על פרמטרים biophysical רבים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד"ר מיכאל שפירו, ניקיטה רזניק על דיונים פוריים. עבודה זו נתמכה על ידי ראשונית של ווסטרן אוניברסיטת למדעי הבריאות ולהעניק NIH R21NS101384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA | |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope | |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a | |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier | |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series | |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) | |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) | |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA | |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | ||
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers | |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series | |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers | |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order | |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 | |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
References
- Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
- Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , World Neurosurgery. (2018).
- Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
- Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
- Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
- Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
- Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
- Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
- Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
- Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
- Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
- O'Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
- Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
- Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).
