Summary
Estimulación de ultrasonido pulsado (LIPUS) de baja intensidad es una modalidad de estimulación mecánica no invasiva de células endógenas o ingeniería con alta resolución espacial y temporal. Este artículo describe cómo implementar LIPUS a un microscopio de epifluorescencia y cómo minimizar el desajuste de impedancia acústica en el camino de ultrasonido para evitar artefactos mecánicos no deseados.
Abstract
Al enfocar pulsos de ultrasonido de baja intensidad que penetran en los tejidos blandos, LIPUS representa una prometedora Tecnología biomédica remotamente y con seguridad manipular leña neuronal, secreción hormonal y las células reprogramadas genéticamente. Sin embargo, la traducción de esta tecnología para aplicaciones médicas actualmente es obstaculizada por la falta de mecanismos biofísicos que objetivo sentido tejidos y responder a LIPUS. Un enfoque adecuado para identificar estos mecanismos sería utilizar biosensores ópticos en combinación con LIPUS para determinar base de vías de señalización. Sin embargo, aplicación del LIPUS a un microscopio de fluorescencia puede introducir artefactos mecánicos indeseados debido a la presencia de interfaces físicas que reflejan, absorben y refractan las ondas acústicas. Este artículo presenta un procedimiento paso a paso para incorporar LIPUS a microscopios de epifluorescencia vertical comercialmente disponibles y reducir al mínimo la influencia de interfaces físicas a lo largo de la trayectoria acústica. Se describe un procedimiento sencillo para operar un solo elemento transductor y para poner la zona focal del transductor en el punto focal objetivo. El uso de LIPUS se ilustra con un ejemplo de transitorios del calcio LIPUS-inducida en células de glioblastoma humano cultivadas medidas usando proyección de imagen del calcio.
Introduction
Muchas enfermedades requieren de algún tipo de intervención médica invasiva. Estos procedimientos son a menudo costosas, riesgosas, requieren periodos de recuperación y así añadir una carga a los sistemas de salud. Modalidades terapéuticas no invasivas tienen el potencial para ofrecer alternativas más seguras y más baratas a los procedimientos quirúrgicos convencionales. Sin embargo, actuales no invasivos como la farmacoterapia o transcraneal de la estimulación magnética a menudo están limitados por las compensaciones entre la penetración del tejido, resolución espaciotemporal y efectos no deseados fuera del objetivo. En este contexto, un ultrasonido focalizado constituye una tecnología no invasiva prometedora con el potencial para manipular funciones biológicas en tejidos con alta precisión espacio-temporal y limitados efectos off-target.
Ultrasonido focalizado estimulación consiste en entregar energía acústica en lugares precisos dentro de los organismos vivos. Dependiendo de los parámetros de pulso acústico, esta energía puede tener una variedad de aplicaciones médicas. Por ejemplo, la Food and Drug Administration ha aprobado el uso de ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HiFU) para la ablación térmica de tumores de próstata, regiones del cerebro que causa temblor, fibromas uterinos y las terminaciones nerviosas causando dolor en metástasis óseas1 . Cavitación HiFu-mediada microburbujas también se utiliza para abrir transitoriamente la barrera blood - brain para la entrega específica de terapéutica administrada sistémicamente2. La intensidad de pulso promedio pico espacial (Isppa) y pico espacial temporal media intensidad (spta) utilizado para HiFU aplicaciones suelen ser por encima de varios kW cm-2 y producen la presión de pulso de varias decenas de MPa. Estos valores de intensidad son muy por encima del aprobado por la FDA-sppa yspta límites de ultrasonido diagnóstico, 190 W cm-2 y 720 mW cm-2, respectivamente3. Por el contrario, estudios recientes han demostrado que el estímulo no destructivo ultrasonido pulsado que están dentro o cerca de la gama de los límites de intensidad de ultrasonido diagnóstico (LIPUS) puede ser eficaz de forma remota y segura manipulación neural disparar4, 5,6,7,8, secreción hormonal9,10 y Bioingeniería células11. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares por el cual las células sensación y responden al ultrasonido no quedan claros, imposibilitando la traducción clínica de LIPUS. Por lo tanto, en los últimos años, estudios de membranas artificiales, cultivos de células y animales estimulados con ultrasonido han ganado impulso para revelar biofísicos y los procesos fisiológicos modulan por LIPUS12,13, 14,15.
Sonido consiste en una vibración propagación por un medio físico. Un ultrasonido es un sonido con una frecuencia por encima del rango audible humano (es decir, por encima de 20 kHz). En un entorno de laboratorio, ondas de ultrasonido se producen generalmente por transductores piezoeléctricos que contienen un material que vibra en respuesta a un campo eléctrico Oscilante en un determinado ancho de banda de alta frecuencia. Existen dos tipos de transductores: único elemento transductores y arreglos de discos de transductor. Transductores piezoeléctricos individuales poseen una superficie curva que actúa como una lente de enfoque y por lo tanto, se concentra la energía acústica en una región definida llamada la zona focal. Único elemento transductores están mucho más barato y más fácil de utilizar que los arreglos de discos de transductor. Este artículo se centrará en transductores de elemento único.
El tamaño de la zona focal de un transductor de elemento enfocado depende de las propiedades geométricas de la lente acústica y su frecuencia acústica. Para lograr una zona focal de tamaño milimétrico con un transductor de elemento, frecuencias de ultrasonido en el rango de MHz se requiere generalmente. Desafortunadamente, las ondas acústicas en tal frecuencia se atenúan muy rápidamente cuando se propaga en un medio frágil como el aire. Así, las ondas del ultrasonido MHz tiene que ser generado y propagado a la muestra en un material más denso como el agua. Esto constituye el primer desafío de integración de la modalidad LIPUS a un microscopio.
Un segundo desafío es minimizar interfaces físicas entre materiales con diferentes impedancias acústicas (que es un producto de la densidad material y la velocidad acústica) a lo largo de la trayectoria acústica. Estas interfaces se pueden reflejar, refractar, dispersión y absorber las ondas acústicas, lo que hace difícil cuantificar la cantidad de energía acústica efectivamente entregado a una muestra. También pueden crear artefactos mecánicos no deseados. Por ejemplo, reflejos produce desajuste perpendicular al acústico impedancia interfaces crean backpropagating ondas que interfieren con los de propagación hacia adelante. A lo largo de la ruta de interferencia, las olas cancelan mutuamente en regiones fijadas de espacios llamados nodos y resumir en alternando regiones llamadas los nodos, creación de supuesto ondas estacionarias (figura 1). Es importante que el experimentador poder controlar o eliminar estas interfaces experimentales in vitro , que pueden no existir en vivo.
Medida de fluorescencia óptica reporteros es un método bien conocido para interrogar las muestras biológicas transparentes en tiempo real y con ninguna alteración física. Este enfoque por lo tanto es ideal para estudios LIPUS como cualquier sondas físicas presentes en el área de sonicación introducir artefactos mecánicos. Este protocolo describe la implementación y operación de LIPUS a un microscopio de epi-fluorescencia comercial.
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Protocol
1. cultivo de células de película de poliester transparente acústicamente
- Un tamaño de orificio de 12 mm en la parte inferior de una placa de cultivo de 35 mm estándar utilizando un taladro de prensa vertical del taladro. El taladro se mueven lentamente y Protéjase los ojos. Retire las piezas de plástico en la parte inferior del plato con una hoja para crear una superficie lisa en el lado externo (figura 2).
- Aplique una capa delgada de resina epóxica grado marino o pegamento en la superficie inferior externa del plato.
- Coloque una capa de poliester (2,5 μm espesor) contra la superficie inferior externa del plato y presione firmemente para asegurarse de que el pegamento de epoxi se separa uniformemente entre la película y la superficie de plástico gruesa. Tire suavemente de la película de manera centrífuga con los dedos para crear una superficie plana (figura 2).
- Cuando se haya secado el pegamento epoxy, brevemente enjuague secado el fondo poliéster plato con etanol al 95% y esterilizar colocando el plato y el interior de su tapa en una fuente de excitación fuerte de 254 nm UV superficial. Ajustar la duración y la intensidad para entregar una dosis UV de aproximadamente 330 mJ cm-2 para la destrucción completa de la mayoría de los microorganismos. Esta energía corresponde aproximadamente con una duración de 5 minutos utilizando un 1.000 μW cm-2 UV la iluminación.
- Alícuota comercialmente disponible matriz extracelular proteína mezclas (EMPM) en tubos pequeños (50-100 μL) y almacenar a-20 ° C o menos en condiciones estériles.
- En un ambiente estéril (por ejemplo, dentro de un gabinete de bioseguridad), diluir un caldo congelado de la EMPM con un medio de cultivo deseado a 1: 100. Trabajar en hielo para evitar EMPM polimerización a temperatura ambiente. Aplicar rápidamente 100 μl de la mezcla de media en la película de poliester. Coloque la tapa en el plato para mantener la esterilidad.
- Incubar los platos de la parte inferior de poliéster revestido EMPM en una célula cultura CO2 la incubadora a 37 ° C durante 6-12 h.
- Después de la incubación, aspirar el exceso medio y semilla directamente la superficie con las células de la densidad deseada. Trabajar bajo condiciones de esterilidad para mantener la esterilidad.
2. LIPUS implementación
- Colocar un tanque de agua por debajo del objetivo de un microscopio vertical con gran volumen de trabajo y sin hardware de iluminación en la ruta de transmisión.
- Usando componentes optomecánicos comercialmente disponibles, coloque un poseedor de muestra abajo el objetivo y un transductor por debajo del sostenedor de la muestra. Muestra posterior búsqueda y ultrasonido alineación, la Monte estos dos titulares sobre etapas de la traducción.
- Coloque las piezas móviles y actuadores de etapas de la traducción fuera del tanque o por encima de la línea de agua para evitar daños por agua. Utilice sólo materiales no corrosivos como el aluminio anodizado o acero inoxidable para componentes optomecánicos sumergidos.
- Llene el tanque con agua desionizado y desgasificado antes de utilizar el transductor de inmersión. La línea del agua debe coincidir con el plano horizontal del portamuestras (figura 3).
Nota: Agua desionizada evita el acoplamiento eléctrico en presencia de campos eléctricos de alta. Desgasificación también evitará dispersión y alteraciones de las ondas acústicas. Drene el agua después de cada experimento con una bomba o una válvula para que la línea de agua cae por debajo de la posición del transductor. También, reemplazar o filtrar el agua con frecuencia y limpiar el tanque de agua según sea necesario para evitar el crecimiento de microorganismos.
3. oblicua excitación acústica
- Utilizando componentes optomecánicos comercialmente disponible, Oriente el transductor en una posición oblicua con respecto a la vía óptica. Esto se asegurará de que ninguna refleja ondas serán dirigidas de la muestra (figura 3 y figura 4).
4. conducir el transductor
Nota: Transductores de ultrasonido para convierten energía eléctrica oscilante mecánica expansión/contracción de un material piezoeléctrico. Esta conversión produce pérdida de energía en forma de energía térmica. Por lo tanto, mientras que los transductores poseen un límite de voltaje de entrada máximo, también poseen un límite de corriente eléctrica para evitar el daño térmico al elemento piezoeléctrico:
la tarea ciclo de la fracción relativa del tiempo de simulación eléctrica, P la potencia eléctrica (en vatios), Vrms voltaje raíz cuadrada media (en voltios) de la fuente de voltaje alternativo y Z eléctrico impedancia (en Ohms).
con Vpp el voltaje de pico a pico de entrada aplicado al transductor.
- Crear una forma de onda sinusoidal con la frecuencia deseada, número de ciclos por pulso, y la frecuencia de repetición utilizando un generador de función comercial del pulso. Sin embargo, el relativamente alto Vpp necesario para conducir eficazmente transductores de ultrasonido estándar a menudo requiere la adición de un amplificador para amplificar la salida (es decir, aumento de la amplitud de Vpp) del generador de funciones.
Nota: por ejemplo, fabricante de un transductor indica el límite de potencia para un transductor dado es de 35 w el. ¿Será un pico a pico sinusoidal voltaje (Ven) de 500 mV en un deber ciclo del 50% y amplificada a través de 50 dB/100 amplificador de W ser dentro del límite de potencia de este transductor?- Para responder a esta pregunta, calcular la tensión después de la amplificación. Para un amplificador de potencia de radiofrecuencia (RF), el factor de amplificación (dB) se define por:
Así, la tensión amplificada tiene una amplitud de salida Vpp (Vpp =hacia fuera) de:
Usando las ecuaciones 1 y 2, utilizando 50 Ω como impedancia eléctrica, la energía correspondiente generada por esta tensión es:
Esta estimulación es, por tanto, dentro del límite de corriente del transductor. - El ejemplo anterior, calcular los parámetros de forma de onda (Vpp, frecuencia, duración del pulso y la frecuencia de repetición de pulso) que corresponden a los límites de corriente y el voltaje suministrados por el fabricante del transductor. Asegúrese de respetar estos límites para evitar dañar el transductor y otros instrumentos conectados.
- Para responder a esta pregunta, calcular la tensión después de la amplificación. Para un amplificador de potencia de radiofrecuencia (RF), el factor de amplificación (dB) se define por:
- Elegir un generador de funciones que opera dentro de un rango de frecuencias compatible con el transductor de ultrasonido. Ajusta la frecuencia del generador de función a la frecuencia máxima nominal del transductor.
- Crear un pulso de voltaje sinusoidal de la duración deseada y la frecuencia de repetición usando el modo ráfaga del generador de funciones. Ajuste el voltaje de pico a pico a un valor deseado. Asegúrese de que la duración del pulso es más corto que el tiempo transcurrido entre dos pulsos consecutivos.
- Comprobar que la forma de onda corresponde a la señal deseada mediante la conexión de la salida del generador de funciones a la entrada de un osciloscopio.
- Conecte la salida del generador de funciones a la entrada de un amplificador de RF (figura 4). Asegúrese de que los parámetros de estimulación son dentro de los límites del fabricante del transductor.
5. viga de alineación
- Elegir un hidrófono que opera con una frecuencia acústica y rango de intensidad compatible con la frecuencia y la intensidad del transductor de ultrasonido.
- Llevar cuidadosamente la punta de una sonda de hidrófono en foco dentro del campo de visión objetivado en la posición correspondiente a la posición de la muestra (figura 4).
- Asegúrese de que la sonda y transductor se sumergen en agua desionizado y desgasificado. Golpee la punta del hidrófono con cualquier objeto físico que no sea agua, ya que esto altera su capa y afectar la medición.
- Realizar una alineación previa bruta del transductor colocando visualmente su eje acústico hacia la sonda de hidrófono. Se asegura que la distancia entre la superficie del transductor y la punta de hidrófono corresponde aproximadamente a la distancia focal del transductor.
- Conecte el hidrófono de la salida a una entrada de señal del osciloscopio. Conectar el disparador de sincronización de la función a otra entrada del osciloscopio. Visualizar dos señales simultáneamente en el osciloscopio.
- Conducir el transductor con pocos ciclos de ultrasonido en un ciclo de trabajo baja y baja amplitud para evitar dañar la sonda. Compruebe las condiciones de operación segura de fabricante de hidrófono para evitar dañar la punta del hidrófono.
- Ajuste la perilla s/división según el tiempo del recorrido de ultrasonido de la superficie del transductor para el hidrófono. Cuidar para un hidrófono de señal en el osciloscopio el disparador de sincronización.
- Accione lentamente el transductor con una etapa XYZ motorizada o manual. Dejar el transductor en la posición que se correlaciona con la señal de máxima hidrófono (figura 4).
Nota: Si no se detecta ninguna señal, es posible que la intensidad de los pulsos acústicos es demasiado baja o que la viga está mal alineada o dispersa por un objeto. Compruebe con regularidad que el hidrófono y el transductor son visualmente Pre-alineada y que no hay burbujas u objeto físico presente en el camino excepto la película de poliester. Si todavía no se detecta ninguna señal, aumentar la tensión de entrada por una pequeña cantidad para aumentar la amplitud de la señal del hidrófono.
6. determinación de la presión de pulso de ultrasonido y la intensidad
- Con el rayo alineado, medir la amplitud de pico a pico del hidrófono en el osciloscopio para varios voltajes conduce el transductor de salida. Asegúrese de no exceder el límite de presión recomendado por el fabricante del hidrófono.
- A convertir estas mediciones de presión y/o valores de intensidad acústica mediante el método de calibración suministrado por el fabricante del hidrófono.
Nota: La intensidad acústica se puede determinar de la presión y viceversa, utilizando la fórmula:
con la presión acústica (en W m-2), P la presión acústica (en Pa), ρ la densidad de la propagación de material (1.000 kg m-3 para el agua) y c la velocidad del sonido en el medio de propagación (agua, c = 1.500 m s-1). - Crear curvas de calibración usando estas medidas.
Nota: Las presión vs tensión e intensidad vs voltaje curvas tienen forma lineal y parabólica, respectivamente. - Determinar el valor de presión o intensidad de un voltaje de conducción deseado mediante la correspondiente curva de calibración.
7. imágenes por fluorescencia de células vivas calcio-sensible/LIPUS
- Reemplazar el medio de cultivo de la célula con un búfer de imagen deseado con 5 μm de un colorante sensible a calcio celular florescente (p. ej., Fluo-4 AM). Incubar la placa de cultivo en un incubador de2 CO a 37 ° C durante 1 hora.
- Lave cuidadosamente las células con el mismo buffer libre de tinte.
- Coloque el plato en el portamuestras. Excitar las células utilizando iluminación luz azul (490 nm) y ajustar la excitación exposición intensidad y cámara para evitar la excesiva saturación de blanqueo o pixel.
- Realizar proyección de imagen de Time-lapse parámetros de adquisición de imagen deseada. Utilice un objetivo de inmersión para una mejor calidad de imagen y con distancia de funcionamiento larga para reducir reflexiones no deseadas (ver figura 4).
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Representative Results
Figura 5 es un ejemplo de experimento LIPUS multiplexado con proyección de imagen de calcio. Células de glioblastoma (A-172) se cultiva en EMPM recubierto de película de poliéster en medio de cultivo estándar (suplementado con 10% suero y 1% antibióticos) y se incubaron con el reportero fluorescente sensible al calcio Fluo-4 AM. Células fueron fotografiadas usando un lente de inmersión X 10 e iluminado con una fuente de luz blanca de LED y luz de la fluorescencia se recopiló utilizando un conjunto estándar de filtro GFP. LIPUS fue aplicado por manualmente introduciendo un transductor de 4 MHz con una forma de onda de pulso de amplitud pico a pico V, 0,1 ms de pulso de duración y frecuencia de repetición de pulso de 10 ms (es decir, ciclo de trabajo % 1) 158. Estos parámetros corresponden a Isppa = 88 W cm-2 (bien por debajo del límite diagnóstico de 190 W cm-2)yspta = 877 mW cm-2 (ligeramente por encima del límite diagnóstico de 720 mW cm-2), respectivamente. Los resultados muestran que esta estimulación produce elevaciones del calcio sólido (figura 5B, 5C, 5D).
Pulso corto duraciones (es decir, con ninguna disipación de calor significativa durante el pulso) y suponiendo que la capacidad de calor de la muestra (es decir, las células cultivadas en película de poliéster y sumergido en una solución acuosa) es similar a la del agua, el cambio de temperatura (∆Tmáximo) producida durante cada pulsación puede ser estimada por16
con una duración de pulso de 0,1 ms y la intensidad de pulso de 88 W cm-2
Máximo ∆T = 0.12 x 0,0001 x 88 ≈ 1 m ° C
con 1% ciclo de trabajo, es probable que la pequeña cantidad de calor depositado en la zona focal durante cada pulso de 0,1 ms eliminado por conducción térmica durante 9,9 ms atravesado entre dos pulsos consecutivos. Por lo tanto, el calcio sólido señales ve en la figura 5B, 5C, 5D son probablemente inducidos por mecanismos no térmicos.
Figura 1: formación de ondas estacionarias en una interfase reflectante. La presencia de una interfaz entre materiales con diferente impedancia acústica refleja una onda de presión entrante (azul) con una longitud de onda λ. Puesto que tanto las ondas viajan en direcciones opuestas, se establece un cambio de fase oscilante. Parte superior: en este momento, el desplazamiento de fase es 180°, produciendo interferencia destructiva de la onda (onda verde). Medio: Después de que las olas han trasladado una distancia correspondiente a λ/4 con respecto a la parte superior, el desplazamiento de fase es nulo y ambas ondas amplifican a través de interferencias constructiva, produciendo una onda de mayor amplitud. Parte inferior: Después de que las olas han trasladado una distancia adicional de λ/2 (por lo tanto, un total de λ / 4 + λ/2 = 3/4 λ de la referencia superior), la fase de cambio se convierte en nulo otra vez, produciendo una onda de gran amplitud, pero con polaridad inversa. Tenga en cuenta que algunas posiciones dentro de la ruta tienen una constante presión nula (círculos de nodo, negro) mientras que otras posiciones constantemente oscilan entre las presiones mínimas y máximas (vientres, círculos verdes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cultivo de células de película de poliester transparente acústicamente. La figura muestra la parte inferior de un plato de 35 mm con un agujero grande 12 mm en su centro. El agujero se cubre posteriormente con una fina película de poliéster. La película se pega firmemente a la parte inferior externa de la placa con resina de grado marino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: aplicación de una configuración de ultrasonido a un microscopio de fluorescencia vertical. Un tanque de agua por encargo se coloca bajo un microscopio de fluorescencia vertical sin hardware Iluminación transmitida. Un portamuestras motorizado situado debajo el objetivo se unen a componentes optomecánicos fijados a la tabla de la vibración fuera del tanque. El transductor es colocado debajo de la muestra y atado a una etapa de traducción en componentes optomecánicos dentro del tanque. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: diagrama esquemático del montaje entero. La configuración incluye un microscopio de fluorescencia vertical de epi-fluorescencia para permitir imágenes de fluorescencia de las células cultivadas. El transductor se muestra con una orientación oblicua con respecto a la vía óptica. Esta configuración evita la posterior reflexión de las ondas acústicas a lo largo de la trayectoria acústica, evitando la formación de ondas estacionarias o estimulación repetitiva de la muestra con múltiples ecos de ultrasonido. Una forma de onda deseada es producida por un generador de función que puede ser activado manualmente o electrónicamente accionado por un interfaz de la computadora (Transistor-Transistor-Logic o Universal Serial Bus). La amplitud y el retardo de la señal medida por la aguja del hidrófono (rojo) pueden ser analizadas utilizando un osciloscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: ejemplo de señales de calcio inducida por LIPUS en glioblastoma humano las células de A-172. (A) imagen de Raw de la fluorescencia de las células A-172 cultivadas en una placa de cultivo de 35 mm de poliéster-fondo y cargado con una celular-permeant versión del indicador de calcio Fluo-4. Los rastros rojos representan límites celulares identificados automáticamente por un programa de computadora y etiquetado como regiones de interés (ROI). (B) curso del tiempo cambio de fluorescencia relativa (Ft-F0/f0o ΔF/F0) para cada ROI durante un experimento LIPUS. Imágenes fueron adquiridas a una velocidad de 1 fotograma por segundo por una cámara CCD y LIPUS se aplicó para 10 s entre 20 y 30 marcos. La forma de onda LIPUS consta de 100 pulsos μs que contiene 400 ciclos a 4 MHz y repetidos cada 10 ms de 10 s. (C) diagrama que muestra el curso temporal de la media ΔF/F0 calculado para todos ROIs (barras de error no se muestra). (D) diagrama que muestra el porcentaje de retorno de la inversión que ΔF/F0 por encima de un umbral de activación definido por el usuario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Una ventaja principal de ultrasonido focalizado es su capacidad para proporcionar de forma no invasiva energía mecánica o térmica a muestras biológicas con la alta precisión espacio-temporal. Otras técnicas pretende estimular mecánicamente las células generalmente emplean sondas física invasiva (por ejemplo, meter celular) o requiere la interacción de rayos láser de alta energía con objetos extraños (por ejemplo, pinzas ópticas). Calefacción magnético puede calentar ubicaciones espaciales específicas dentro de las muestras biológicas pero requiere la presencia de nanopartículas magnéticas extranjeros. Por otra parte, precisa calefacción no invasiva de muestras pequeñas (por ejemplo, cultivos celulares) en medio acuoso es posible usando infrarrojo o microondas excitación17,18,19.
Puesto que no existen sistemas comerciales capaces de realizar la excitación ultrasonido junto con microscopía de fluorescencia, muchos biofísicos han creado sistemas personalizados a la medida de sus aplicaciones específicas8,12 ,13,20. La implementación de estos sistemas, sin embargo, puede difícil para no expertos. Este artículo describe el funcionamiento básico para conducir un haz de ultrasonido focalizado hacia el plano focal de un objetivo de microscopio de epifluorescencia vertical limitando acústicos artefactos reflexiones y las ondas estacionarias que se producen en el acústico de desajuste interfaces de impedancia. Estos artefactos acústicos generalmente explícitamente no se toman en consideración en la literatura publicada.
Si usando un haz acústico perpendicular a la trayectoria óptica, el rayo voluntad finalmente encuentro la interfaz sólido-líquido formada por la lente frontal de un objetivo de inmersión o, si se utiliza un objetivo de aire, el agua-aire interfaz por encima de la muestra. Estas interfaces reflejan las ondas acústicas a la muestra, produciendo ondas estacionarias (ver figura 1). Para mitigar o evitar estas reflexiones, se recomienda colocar el transductor con un ángulo oblicuo con respecto a la vía óptica.
El uso de platos de poliéster-fondo cultura no sólo reducir al mínimo reflexiones acústicas producidas por el fondo de platos de la cultura plástica gruesa, también permiten que el experimentador estimular la muestra bajo un microscopio vertical. Esta es una configuración preferible en comparación con un microscopio invertido a la posición de un transductor sumergido con una orientación oblicua respecto de la trayectoria óptica.
Este protocolo está diseñado para uso con transductores de ultrasonidos focalizados, pero experimentador también puede utilizar transductores de ultrasonido (planar) no enfocado así. Nótese que, puesto que LIPUS está diseñado para la estimulación precisa de zonas deseadas dentro del tejido, transductores de ultrasonido focalizado son preferidos generalmente para aplicaciones tanto in vitro e in vivo . Vigas acústicas producidas por transductores planos son también más amplios, haciendo más difícil reducir reflexiones y otros artefactos mecánicos.
La zona focal de un solo elemento enfocado ultrasonido transductor depende de muchos parámetros como el diámetro del elemento, la frecuencia acústica y la velocidad del sonido del material de propagación. Para un transductor estándar de MHz, el área focal es típicamente confinado en una región milimétrica o sub milimétrica. Existe una relación inversa entre el tamaño de la zona focal y la capacidad de penetrar dentro del tejido sin demasiada pérdida debido a la atenuación del haz acústico: cuanto mayor sea la frecuencia, cuanto menor sea la focal zona pero cuanto más débil la penetración.
Para estimular efectivamente visualizadas al microscopio de células, la zona focal acústica del transductor debe solaparse con el óptico plano focal del objetivo. Para ello, es necesario precisamente alinear el haz acústico con un hidrófono comercialmente disponible. Hay dos tipos principales de hidrófonos: hidrófono agujas y sistemas de fibra óptica. Ambos tipos pueden utilizarse. Durante la alineación, es importante asegurarse de que la intensidad acústica es dentro de los límites de presión del hidrófono y que la frecuencia del transductor es dentro de la gama de frecuencia de sensibilidad del hidrófono.
Utilizar la calibración suministrada por el fabricante (si está disponible) para convertir la salida de la amplitud de voltaje del hidrófono en presión acústica real (hidrófonos generalmente se calibran con un número en unidades similares o V Pa-1 ). Hidrófonos también generalmente tienen una orientación preferencial (direccionalidad) en relación con el haz acústico, por lo tanto, se prefiere colocar el hidrófono en la misma dirección del eje acústico. Si no es posible, hidrófonos pueden tener una tabla de atenuación vs direccional ángulo, que permite direccional posterior corrección después de las mediciones.
Alineación de la viga puede ser una tarea frustrante, especialmente cuando operan un transductor con una estrecha zona focal. Debe aparecer la señal del hidrófono con un retraso con respecto al pulso del transductor de conducción. Este retraso se corresponde con el tiempo tomado por el ultrasonido para viajar desde la superficie del transductor a la sonda del hidrófono (en agua, recorrido de las ondas de sonido a una velocidad de aproximadamente 1.500 m s-1) (ver figura 4). Nota que el retraso de la RF de señales viajan a través de cables eléctricos es pequeño, sólo se trata de 3 ns m-1, que en el presente caso, puede ser ignorada con seguridad. Una forma para probar si la viga está bien alineada es calcular la distancia entre el transductor y el hidrófono usando el retardo medido en el osciloscopio y la conocida velocidad del sonido en el agua. Por ejemplo, se espera una demora de aproximadamente 17 μs para un transductor con una longitud focal de 25 mm.
Si no es posible el uso de hidrófono comercial (p. ej., frecuencia de transductor inusual con la no coincidencia de hidrófonos o poco espacio para colocar el hidrófono), el haz acústico puede estar alineado con el método de pulso-eco20. Generalmente esto se hace colocando primero un pequeño objeto reflectante de tamaño similar o más pequeño que el diámetro del haz del transductor en el foco dentro del campo de visión de microscopio. El transductor se utiliza como emisor acústico (para enviar pulsos de ultrasonido) y receptor (para detectar el eco del objeto reflectante). Tenga en cuenta que en esta configuración, un amplificador dedicado es necesario amplificar la señal de echo algo pequeño que sale el transductor.
Para el buen funcionamiento de los instrumentos de RF, es importante que todos los cables y conexiones para los instrumentos tienen que empareja de la impedancia eléctrica, de lo contrario reflejos eléctricos no deseados le ocurre alterar la forma de onda eléctrica. Éste es generalmente el caso con más cables de bayoneta Neill-Concelman (BNC) y equipo de RF con impedancia de Ω 50. Algunos osciloscopios, sin embargo, tienen una alta impedancia de entrada de 1 MΩ y así se reflejarán que una señal RF alimentada a través de una Ω 50 cable BNC. En este caso, un simple 50 Ω a través de alimento terminador debe insertarse entre el extremo del cable BNC y la entrada del osciloscopio para terminar correctamente la señal sin pérdida.
Este método es técnicamente limitado por la instrumentación utilizada para la entrega de pulsos de ultrasonido y realizar proyección de imagen de fluorescencia. Por ejemplo, un microscopio de fluorescencia del solo-fotón estándar sólo permitiría la proyección de imagen de las muestras de dos dimensiones. Sin embargo, puede realizar proyección de imagen de LIPUS más complejo de muestras tridimensionales como rebanadas de cerebro o pequeños órganos utilizando excitación de fotones múltiples.
Otro desafío con LIPUS experimentos es distinguir mecánica vs efectos térmicos por vigas acústicos. Un desplazamiento mecánico oblicuo a la vía óptica puede detectarse Si desplaza la imagen en el eje del plano (x, y) o defocuses la muestra en el eje z. Estos desplazamientos dependen de la resolución óptica combinada de la cámara de microscopio y objetivo. Además, como estos movimientos sólo ocurriría durante la sonicación, uno tendría que utilizar una velocidad lo suficientemente alta para sincronizar el solapamiento temporal entre duración de la exposición y el pulso de cámara.
Para investigar los efectos térmicos inducidos por el ultrasonido, las sondas física convencional de uso para medir la temperatura no es recomendable debido a las vibraciones inevitables de la sonda. Sin embargo, la técnica descrita aquí es ideal para medir los cambios de temperatura con reporteros de fluorescencia termosensible genéticamente codificados o termosensibles tintes21,22. En el futuro, como más biocompatibles reporteros fluorescentes estén disponibles, esta técnica permitirá el estudio de ultrasonido efectos sobre muchos otros parámetros biofísicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los Drs. Mikhail Shapiro y Nikita Reznik discusiones fructíferas. Este trabajo fue apoyado por fondos de puesta en marcha de la Western University of Health Sciences y NIH grant R21NS101384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA | |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope | |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a | |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier | |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series | |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) | |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) | |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA | |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | ||
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers | |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series | |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers | |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order | |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 | |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
References
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