Summary

ריבוב ממוקד אולטרסאונד גירוי עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

בעוצמה נמוכה פעמו אולטרסאונד גירוי (LIPUS) הוא מודאליות עבור גירוי מכני לא פולשנית של תאים אנדוגני או מהונדסים עם רזולוציה גבוהה של יכולות. מאמר זה מתאר כיצד ליישם את LIPUS כדי במיקרוסקופ epi-זריחה וכיצד למזער את אי התאמה של עכבה אקוסטיים לאורך השביל אולטרסאונד כדי למנוע חפצי מכני לא רצויים.

Abstract

על ידי התמקדות פולסים אולטרה סאונד בעוצמה נמוכה לחדור רקמות רכות, LIPUS מייצג טכנולוגיה ביו מבטיח מרחוק ובבטחה לתפעל ירי עצבית, הפרשת ההורמונים ותאים מחדש מבחינה גנטית. עם זאת, התרגום של טכנולוגיה זו עבור יישומים רפואיים היא כיום הקשו על ידי חוסר של מנגנונים הביו-פיסיקלי שבו ממוקד רקמות הגיוני ולהגיב LIPUS. בגישה מתאימה כדי לזהות מנגנונים אלה יהיה לשימוש אופטי ביולוגיים בשילוב עם LIPUS כדי לקבוע שבבסיס איתות המסלולים. עם זאת, יישום LIPUS כדי מיקרוסקופ פלורסצנטיות יכול להכיר רצויה חפצי מכני בשל נוכחותם של ממשקים פיזיים לשקף, לספוג, מסיטים גלים אקוסטיים. מאמר זה מציג הליך שלב אחר שלב כדי לשלב את LIPUS כדי זמין מסחרית זקוף epi-זריחה מיקרוסקופים תוך מזעור ההשפעה של ממשקים פיזיים לאורך השביל אקוסטית. הליך פשוט מתואר לפעול מתמר אולטרסאונד רכיב אחד וכדי להכניס את אזור מוקד של המתמר מוקד אובייקטיבית. השימוש LIPUS מודגם עם דוגמה של סידן LIPUS-induced שנחשולי בתאים בתרבית גליובלסטומה האדם נמדד באמצעות הדמיית סידן.

Introduction

מחלות רבות דורשות צורה כלשהי של התערבות רפואית פולשנית. הליכים אלה לעיתים יקר, מסוכן, דורשים ותקופות התאוששות, ובכך להוסיף נטל מערכות הבריאות. פולשני שיטות טיפוליות יש פוטנציאל לספק חלופות בטוחות יותר וזול יותר ניתוחים קונבנציונלי. אולם, לגישות פולשני כגון גירוי מגנטי pharmacotherapy או טראנס מוגבלים לעיתים קרובות על ידי הפשרות בין חדירה לרקמות, ייתכן רזולוציה ואפקטים את המטרה לא רצויים. בהקשר זה, אולטרסאונד ממוקד מהווה טכנולוגיה לא פולשנית מבטיחה עם פוטנציאל לתמרן תפקודים ביולוגיים עמוק בתוך רקמות עם רמת דיוק גבוהה ייתכן ואפקטים את המטרה מוגבל.

אולטרסאונד ממוקד גירוי מורכב אספקת אנרגיה אקוסטית-מיקומים מדויקים עמוק בתוך אורגניזמים חיים. בהתאם הדופק אקוסטית פרמטרים, אנרגיה זו יכול להיות מגוון רחב של שימושים רפואיים. למשל, מינהל המזון והתרופות שאושרה השימוש אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה (HiFU) על אבלציה תרמי של גידולים בערמונית, אזורים במוח הגורמים רעד, מיומות, גרימת כאב חיבורי עצבים גרורות בעצמות1 . Microbubble המוביל בתיווך HiFu קוויטציה משמש גם לפתיחת מחסום הדם – מוח למסירה יישוב של הרפוי מערכתית בניהול2transiently. עוצמת הדופק הממוצע המרחבי-לשיא (אניsppa) ועוצמת טמפורלית הממוצע המרחבי-לשיא (אניspta) המשמש HiFU יישומים הם בדרך כלל מעל kW כמה ס מ-2 ולייצר לחץ דופק של כמה עשרות של MPa. אלו ערכי העוצמה גם הרבה מעל ה-FDA אישר ליsppa ואניspta מגבלות עבור אבחון אולטרסאונד, W 190 ס מ-2 ו- 720 mW ס מ-2,3בהתאמה. לעומת זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי גירוי אולטרסאונד פעמו הרסניות הנמצאים בתוך או ליד הטווח של אבחון אולטרסאונד בעוצמה גבולות (LIPUS) יכול להיות יעיל מרחוק ובבטחה לתפעל עצבית ירי4, 5,6,7,8,9,הפרשת ההורמונים10 והנדס תאים11. ובכל זאת, מנגנוני תאית ומולקולרית שבו תאים לחוש ולהגיב אולטרסאונד עדיין אינן ברורות, מסלק קליניים תרגום של LIPUS. לכן, בשנים האחרונות, מחקרים של ממברנות מלאכותיות, תאים בתרבית וחיות מגורה עם אולטרסאונד קיבלו תנופה כדי לחשוף biophysical, תהליכים פיזיולוגיים מווסת על ידי LIPUS12,13, 14,15.

צליל מורכב רטט הפצת דרך תווך הפיזי. אולטרסאונד היא צליל עם תדירות בגובה שמיע אנושי (קרי, מעל 20 קילוהרץ). באווירה מעבדה, גלי אולטרסאונד מופקים בדרך כלל על ידי מתמרים פיזואלקטריים המכילים חומר רוטט בתגובה שדה חשמלי נדנוד פס בתדירות גבוהה ספציפיים. קיימים שני סוגי מתמרים: יחיד רכיב מתמרים ומערכים מתמר. מתמרים פיזואלקטריים רכיב יחיד בעלי משטח מעוגל אשר משמש עדשה התמקדות, ומכאן מתרכזת אנרגיה אקוסטית לתוך אזור מוגדר נקרא אזור מוקד. אלמנט יחיד מתמרים הם יותר זול וקל לתפעול מאשר מתמר מערכים. מאמר זה יתמקד מתמרים רכיב יחיד.

הגודל של האזור מוקד של מתמר ממוקד רכיב יחיד תלוי על מאפיינים גיאומטריים של העדשה אקוסטית תדירותו אקוסטית. כדי להשיג מילימטר-גודל אזור מיקוד עם מתמר רכיב יחיד, אולטרסאונד תדרים בטווח MHz נדרשים בדרך כלל. למרבה הצער, גלים אקוסטיים בתדר כזה הם מהר מאוד הקלוש כאשר הופץ במדיום רפים כגון אוויר. לפיכך, גלי אולטרסאונד MHz צריך להיות שנוצר להפיץ את הדגימה מהותי צפופה כמו מים. זה מהווה את האתגר הראשון בשילוב LIPUS לערוץ מיקרוסקופ.

האתגר השני הוא למזער ממשקים פיזיים בין חומרים עם שונה אקוסטית impedances (שהיא תוצר של צפיפות גשמי, המהירות אקוסטית) לאורך השביל אקוסטית. ממשקים אלה יכול לשקף, מסיטים, פיזור ולקלוט גלים אקוסטיים, ולכן קשה לכמת את כמות האנרגיה אקוסטית ביעילות למסור דגימה. הם גם עלולים ליצור חפצי מכני לא רצויים. למשל, השתקפויות אי-התאמה בניצב אקוסטית המיוצר עכבה ממשקים ליצור גלים backpropagating להפריע אלה הפצת קדימה. לאורך השביל הפרעות, הגלים לבטל אחד את השני בכל האזורים קבוע של רווחים בשם צמתים סכום למעלה-לסירוגין אזורים בשם אנטי-צמתים, יצירת גלים עומדים כביכול (איור 1). חשוב experimentalist היכולת לשלוט או לחסל אלה ניסיוני ממשקי חוץ גופית בתוך כפי שהם אינם יכולים להתקיים בתוך vivo.

פלורסצנטיות מדידה של כתבים אופטי הוא שיטה ידועה לחקור דגימות ביולוגיות שקוף בזמן אמת, עם הפרעות גופניות. גישה זו ולכן אידיאלי ללימודי LIPUS כמו כל רגשים הפיזית הנוכחים בשטח sonicated תציג חפצי מכני. פרוטוקול זה מתאר את יישום ותפעול של LIPUS כדי מיקרוסקופ אפינפרין מסחרי-זריחה.

Protocol

1. גידול תאים על הסרט פוליאסטר שקוף המתקפלות תרגיל בגודל 12 מ”מ חור בתחתית לצלחת תרבות רגיל 35 מ מ באמצעות העיתונות-תרגיל אנכי. את התרגיל לאט לאט, לענוד הגנה העין. הסר את חתיכות הפלסטיק המצורף בתחתית המנה באמצעות סכין כדי ליצור משטח חלק בצד החיצוני (איור 2). למרוח שכבה …

Representative Results

איור 5 הוא דוגמה של ניסוי LIPUS מרובב עם סידן הדמיה. Glioblastoma תאים (A-172) היו גדל על EMPM מצופה פוליאסטר סרט בינוני תרבות רגיל (בתוספת 10% סרום ו 1% אנטיביוטיקה), מודגרות עם הכתב פלורסנט סידן רגיש Fluo-4 בבוקר. התאים היו עם תמונה באמצעות עדשה טבילה X 10 ומאוירות מקור אור LED ל?…

Discussion

יתרון הראשי של אולטרסאונד ממוקד היא היכולת שלה לא-פולשנית להעביר אנרגיה מכנית ו/או תרמית דגימות ביולוגיות עם דיוק גבוהה-עתיים. טכניקות אחרות שנועדו מכנית לעורר תאים בדרך כלל מעסיקים רגשים הפיזית פולשני (למשל, תא-מציץ) או דורשת את האינטראקציה של קרני לייזר באנרגיה גבוהה עם חפצים זרים (<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ד”ר מיכאל שפירו, ניקיטה רזניק על דיונים פוריים. עבודה זו נתמכה על ידי ראשונית של ווסטרן אוניברסיטת למדעי הבריאות ולהעניק NIH R21NS101384.

Materials

upright microscope with large working volume Thorlabs CERNA
upright microscope with large working volume Scientifica SliceScope
optomechanical components Thorlabs n/a
needle hydrophone ONDA Corporation HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone Precision Acoustics n/a
fiber optic hydrophone ONDA Corporation HFO series
fiber optic hydrophone Precision Acoustics n/a
oscilloscope Keysight Technology DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator Keysight Technology 33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier Electronic Navigation Industries (ENI) 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer Olympus focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer Benthowave Instrument HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer Precision Acoustics Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer Ultrasonic-S-lab HiFu transducers made to order
high-density Matrigel Corning VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns Chemplex CAT.NO:107

References

  1. Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
  2. Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. . Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).
  3. Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
  4. Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
  5. Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
  6. Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
  7. Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
  8. Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
  9. Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
  10. Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
  11. Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
  12. Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
  13. Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
  14. Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
  15. Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
  16. O’Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
  17. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
  18. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
  19. Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
  20. Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
  21. Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
  22. Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).

Play Video

Cite This Article
Lacroix, J. J., Ozkan, A. D. Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58781, doi:10.3791/58781 (2019).

View Video