Multiplexing fokusert ultralyd stimulering med fluorescens mikroskopi

Summary

Lav intensitet pulserende ultralyd stimulering (LIPUS) er en modalitet for ikke-invasiv mekanisk stimulering av endogene eller utviklet celler med høy romlig og tidsmessige oppløsning. Denne artikkelen beskriver hvordan å implementere LIPUS til en epi-fluorescens mikroskop og minimere akustisk impedans mismatch langs stien ultralyd for å hindre uønsket mekaniske gjenstander.

Abstract

Ved å fokusere lav intensitet ultralyd pulser som trenge myke vev, representerer LIPUS en lovende biomedisinsk teknologi eksternt og sikkert manipulere nevrale avfyring, hormonelle sekret og genetisk omprogrammeres celler. Imidlertid er oversettelsen av denne teknologien for medisinske anvendelser er hemmet av mangel Biofysiske mekanismer som målrettet vev følelse og svare på LIPUS. En passende tilnærming til å identifisere disse mekanismene vil være å bruke optisk biosensors sammen med LIPUS til å angi underliggende signalveier. Men kan implementere LIPUS til fluorescens mikroskop introdusere uønsket mekaniske gjenstander av fysiske grensesnitt som gjenspeiler, absorbere og refract akustiske bølger. Denne artikkelen presenterer en fremgangsmåte for å bygge LIPUS til kommersielt tilgjengelig oppreist epi-fluorescens mikroskop samtidig minimere påvirkning av fysiske grensesnitt langs akustisk banen. En enkel prosedyre er beskrevet å operere en ett element ultralyd svinger og få fokus sonen svingeren i objektive fokuspunkt. Bruk av LIPUS er illustrert med et eksempel på LIPUS-indusert kalsium transienter i kultivert menneskelig glioblastom celler målt med kalsium imaging.

Introduction

Mange sykdommer krever noen form for invasiv medisinsk intervensjon. Disse prosedyrene er ofte dyre, risikabelt, krever utvinning perioder og dermed legge en byrde til helsevesen. Ikke-invasive terapeutiske modaliteter har potensial til å gi tryggere og billigere alternativer til konvensjonelle kirurgiske prosedyrer. Men er nåværende ikke-invasiv tilnærminger som farmakoterapi eller Transkraniell magnetisk stimulering ofte begrenset av avveininger mellom vev penetrasjon, spatiotemporal oppløsning og uønskede off-målet effekter. I denne sammenheng en fokusert ultralyd utgjør en lovende ikke-invasiv teknologi med potensial til å manipulere biologiske funksjoner dypt inne vev med høy spatiotemporal nøyaktighet og begrenset off-målet effekter.

Fokusert ultralyd stimulering består av levere akustisk energi på nøyaktige dypt inne levende organismer. Avhengig av akustisk puls parametere, kan denne energien har en rekke medisinske bruksområder. For eksempel, har Food and Drug Administration godkjent bruk av høy intensitet fokusert ultralyd (HiFU) for termisk ablasjon prostatakreft, tremor-forårsaker områder av hjernen, livmor fibroids og smerte-forårsaker nerveender i benmetastaser¹ . HiFu-mediert microbubble kavitasjon brukes også transiently åpne blod – hjerne barrieren for målrettet levering av systemisk-administrert therapeutics². Romlig-peak puls-gjennomsnittlig intensiteten (jeg_sppa) og romlig-peak timelige gjennomsnittet intensitet (jeg_spta) brukes for HiFU programmer er vanligvis over flere kW cm^-2 og produsere pulstrykk på flere titalls MPa. Disse intensitetsverdiene er langt over FDA-godkjent jeg_sppa og jeg_{fikk også spta} grenser for diagnostiske ultralyd 190 W cm^-2 og 720 mW cm^-2, henholdsvis³. I kontrast, har nyere studier vist at ikke-destruktiv pulserende ultralyd stimulering som er i eller i nærheten av en rekke diagnostiske ultralyd intensitet grenser (LIPUS) kan være effektive eksternt og sikkert manipulere nevrale avfyring^{4, 5,6,7,8}, hormonelle sekret^9,10 og bioengineered celler¹¹. Likevel, mobilnettet og molekylære mekanismer som cellene forstand og svare på ultralyd forblir uklart, utelukker klinisk oversettelse av LIPUS. Derfor i de siste årene, studier av kunstige membraner, kultivert celler og dyr stimulert med ultralyd har steget å avsløre Biofysiske og fysiologiske prosesser modulert av LIPUS^{12,13, 14,15}.

Lyd består av en vibrasjon overføres via et fysisk medium. Ultralyd er en lyd med en frekvens over menneskelige hørbare området (dvs. over 20 kHz). I en laboratorium, er ultralyd bølger vanligvis produsert av Piezoelektriske transdusere som inneholder et materiale som vibrerer som svar på en elektrisk felt svingte i en bestemt høyfrekvente båndbredde. To typer transdusere finnes: elementet transdusere og transducer arrays. Enkeltelement Piezoelektriske transdusere har en buet overflate som fungerer som en fokus linse og dermed konsentrater akustiske energien i et definert område kalt fokus sonen. Enkeltelement transdusere er mye billigere og enklere å betjene enn transducer arrays. Denne artikkelen vil fokusere på ett element transdusere.

Størrelsen på fokus sonen for en fokusert enkeltelement svinger avhenger av geometriske egenskapene for akustisk linsen og dens akustisk frekvens. For å oppnå en millimeter størrelse fokal sone med et enkeltelement svinger, er ultralyd frekvenser i MHz-området generelt. Dessverre, akustiske bølger på slike frekvenser er svært raskt svekket når overføres i en spinkel medium som luft. Dermed må MHz ultralyd bølger genereres og overført til prøven i tettere materialer som vann. Dette utgjør den første utfordringen integrere LIPUS modalitet til et mikroskop.

En annen utfordring er å redusere fysisk grensesnitt mellom materialer med ulike akustisk impedances (som er et produkt av stofftetthet og akustisk hastigheten) langs akustisk banen. Disse grensesnittene kan gjenspeile, refract, scatter og absorbere akustiske bølger, gjør det vanskelig å kvantifisere mengden akustisk energi effektivt levert et utvalg. De kan også opprette uønsket mekaniske gjenstander. For eksempel skape refleksjoner produsert vinkelrett akustisk mismatch impedans grensesnitt backpropagating bølger som forstyrrer fremover-spre seg. Langs forstyrrelser banen avbryte bølgene hverandre fast regioner av områder kalt noder og oppsummere på vekslende regioner kalt anti-noder, opprette såkalte stående bølger (figur 1). Det er viktig for experimentalist å kontrollere eller eliminere disse eksperimentelle grensesnitt i vitro som de ikke kanskje eksisterer i vivo.

Fluorescens måling av optisk journalister er en velkjent metode å forhøre gjennomsiktig biologiske prøver i sanntid og med ingen fysisk forstyrrelser. Denne tilnærmingen er dermed ideelt for LIPUS studier som noen fysiske sonder i sonicated området vil introdusere mekaniske gjenstander. Denne protokollen beskriver implementering og drift av LIPUS til kommersielle epi-fluorescens mikroskop.

Protocol

1. voksende celler på akustisk gjennomsiktig Polyester Film Bore en 12 mm hull størrelse på bunnen av en målestokk 35 mm kultur parabol med en loddrett trykk-drill. Flytt bore sakte og bære vernebriller. Fjerne biter av plast festet til bunnen av parabolen med et blad for å lage en glatt overflate på den eksterne siden (figur 2). Påfør et tynt lag av marine-grade epoxy eller lim på at eksterne undersiden av retten. Sett en film av polyester (2,5 µm ty…

Representative Results

Figur 5 er et eksempel på LIPUS eksperiment multiplekset med kalsium imaging. Glioblastom celler (A-172) ble dyrket på EMPM belagt polyester film i standard kultur medium (supplert med 10% serum og 1% antibiotika), og inkubert med kalsium-sensitive fluorescerende reporter Fluo-4 AM. Cellene ble fotografert med en 10 X nedsenking linsen og opplyst med en hvit LED-lyskilde og fluorescens lys ble samlet inn med en standard GFP filter. LIPUS ble brukt av manuel…

Discussion

Hovedfordelen av fokusert ultralyd er dens evne til å levere ikke-invasively mekanisk og/eller termisk energi til biologiske prøver med høy spatio-temporale presisjon. Andre teknikker skal mekanisk stimulere cellene vanligvis ansette invasiv fysiske sonder (f.eks celle-poking) eller krever samspillet av høy energi laserstråler med uvedkommende gjenstander (f.eks optisk pinsett). Magnetisk oppvarming kan varme bestemte romlige steder inne biologiske prøver men tilstedeværelsen av utenlandske magne…

Materials

upright microscope with large working volume	Thorlabs	CERNA
upright microscope with large working volume	Scientifica	SliceScope
optomechanical components	Thorlabs	n/a
needle hydrophone	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone	Precision Acoustics	n/a
fiber optic hydrophone	ONDA Corporation	HFO series
fiber optic hydrophone	Precision Acoustics	n/a
oscilloscope	Keysight Technology	DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator	Keysight Technology	33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier	Electronic Navigation Industries (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier	Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer	Olympus	focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer	Benthowave Instrument	HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer	Precision Acoustics	Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer	Ultrasonic-S-lab	HiFu transducers made to order
high-density Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns	Chemplex	CAT.NO:107