Summary

Multiplexing fokusert ultralyd stimulering med fluorescens mikroskopi

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Lav intensitet pulserende ultralyd stimulering (LIPUS) er en modalitet for ikke-invasiv mekanisk stimulering av endogene eller utviklet celler med høy romlig og tidsmessige oppløsning. Denne artikkelen beskriver hvordan å implementere LIPUS til en epi-fluorescens mikroskop og minimere akustisk impedans mismatch langs stien ultralyd for å hindre uønsket mekaniske gjenstander.

Abstract

Ved å fokusere lav intensitet ultralyd pulser som trenge myke vev, representerer LIPUS en lovende biomedisinsk teknologi eksternt og sikkert manipulere nevrale avfyring, hormonelle sekret og genetisk omprogrammeres celler. Imidlertid er oversettelsen av denne teknologien for medisinske anvendelser er hemmet av mangel Biofysiske mekanismer som målrettet vev følelse og svare på LIPUS. En passende tilnærming til å identifisere disse mekanismene vil være å bruke optisk biosensors sammen med LIPUS til å angi underliggende signalveier. Men kan implementere LIPUS til fluorescens mikroskop introdusere uønsket mekaniske gjenstander av fysiske grensesnitt som gjenspeiler, absorbere og refract akustiske bølger. Denne artikkelen presenterer en fremgangsmåte for å bygge LIPUS til kommersielt tilgjengelig oppreist epi-fluorescens mikroskop samtidig minimere påvirkning av fysiske grensesnitt langs akustisk banen. En enkel prosedyre er beskrevet å operere en ett element ultralyd svinger og få fokus sonen svingeren i objektive fokuspunkt. Bruk av LIPUS er illustrert med et eksempel på LIPUS-indusert kalsium transienter i kultivert menneskelig glioblastom celler målt med kalsium imaging.

Introduction

Mange sykdommer krever noen form for invasiv medisinsk intervensjon. Disse prosedyrene er ofte dyre, risikabelt, krever utvinning perioder og dermed legge en byrde til helsevesen. Ikke-invasive terapeutiske modaliteter har potensial til å gi tryggere og billigere alternativer til konvensjonelle kirurgiske prosedyrer. Men er nåværende ikke-invasiv tilnærminger som farmakoterapi eller Transkraniell magnetisk stimulering ofte begrenset av avveininger mellom vev penetrasjon, spatiotemporal oppløsning og uønskede off-målet effekter. I denne sammenheng en fokusert ultralyd utgjør en lovende ikke-invasiv teknologi med potensial til å manipulere biologiske funksjoner dypt inne vev med høy spatiotemporal nøyaktighet og begrenset off-målet effekter.

Fokusert ultralyd stimulering består av levere akustisk energi på nøyaktige dypt inne levende organismer. Avhengig av akustisk puls parametere, kan denne energien har en rekke medisinske bruksområder. For eksempel, har Food and Drug Administration godkjent bruk av høy intensitet fokusert ultralyd (HiFU) for termisk ablasjon prostatakreft, tremor-forårsaker områder av hjernen, livmor fibroids og smerte-forårsaker nerveender i benmetastaser1 . HiFu-mediert microbubble kavitasjon brukes også transiently åpne blod – hjerne barrieren for målrettet levering av systemisk-administrert therapeutics2. Romlig-peak puls-gjennomsnittlig intensiteten (jegsppa) og romlig-peak timelige gjennomsnittet intensitet (jegspta) brukes for HiFU programmer er vanligvis over flere kW cm-2 og produsere pulstrykk på flere titalls MPa. Disse intensitetsverdiene er langt over FDA-godkjent jegsppa og jegfikk også spta grenser for diagnostiske ultralyd 190 W cm-2 og 720 mW cm-2, henholdsvis3. I kontrast, har nyere studier vist at ikke-destruktiv pulserende ultralyd stimulering som er i eller i nærheten av en rekke diagnostiske ultralyd intensitet grenser (LIPUS) kan være effektive eksternt og sikkert manipulere nevrale avfyring4, 5,6,7,8, hormonelle sekret9,10 og bioengineered celler11. Likevel, mobilnettet og molekylære mekanismer som cellene forstand og svare på ultralyd forblir uklart, utelukker klinisk oversettelse av LIPUS. Derfor i de siste årene, studier av kunstige membraner, kultivert celler og dyr stimulert med ultralyd har steget å avsløre Biofysiske og fysiologiske prosesser modulert av LIPUS12,13, 14,15.

Lyd består av en vibrasjon overføres via et fysisk medium. Ultralyd er en lyd med en frekvens over menneskelige hørbare området (dvs. over 20 kHz). I en laboratorium, er ultralyd bølger vanligvis produsert av Piezoelektriske transdusere som inneholder et materiale som vibrerer som svar på en elektrisk felt svingte i en bestemt høyfrekvente båndbredde. To typer transdusere finnes: elementet transdusere og transducer arrays. Enkeltelement Piezoelektriske transdusere har en buet overflate som fungerer som en fokus linse og dermed konsentrater akustiske energien i et definert område kalt fokus sonen. Enkeltelement transdusere er mye billigere og enklere å betjene enn transducer arrays. Denne artikkelen vil fokusere på ett element transdusere.

Størrelsen på fokus sonen for en fokusert enkeltelement svinger avhenger av geometriske egenskapene for akustisk linsen og dens akustisk frekvens. For å oppnå en millimeter størrelse fokal sone med et enkeltelement svinger, er ultralyd frekvenser i MHz-området generelt. Dessverre, akustiske bølger på slike frekvenser er svært raskt svekket når overføres i en spinkel medium som luft. Dermed må MHz ultralyd bølger genereres og overført til prøven i tettere materialer som vann. Dette utgjør den første utfordringen integrere LIPUS modalitet til et mikroskop.

En annen utfordring er å redusere fysisk grensesnitt mellom materialer med ulike akustisk impedances (som er et produkt av stofftetthet og akustisk hastigheten) langs akustisk banen. Disse grensesnittene kan gjenspeile, refract, scatter og absorbere akustiske bølger, gjør det vanskelig å kvantifisere mengden akustisk energi effektivt levert et utvalg. De kan også opprette uønsket mekaniske gjenstander. For eksempel skape refleksjoner produsert vinkelrett akustisk mismatch impedans grensesnitt backpropagating bølger som forstyrrer fremover-spre seg. Langs forstyrrelser banen avbryte bølgene hverandre fast regioner av områder kalt noder og oppsummere på vekslende regioner kalt anti-noder, opprette såkalte stående bølger (figur 1). Det er viktig for experimentalist å kontrollere eller eliminere disse eksperimentelle grensesnitt i vitro som de ikke kanskje eksisterer i vivo.

Fluorescens måling av optisk journalister er en velkjent metode å forhøre gjennomsiktig biologiske prøver i sanntid og med ingen fysisk forstyrrelser. Denne tilnærmingen er dermed ideelt for LIPUS studier som noen fysiske sonder i sonicated området vil introdusere mekaniske gjenstander. Denne protokollen beskriver implementering og drift av LIPUS til kommersielle epi-fluorescens mikroskop.

Protocol

1. voksende celler på akustisk gjennomsiktig Polyester Film Bore en 12 mm hull størrelse på bunnen av en målestokk 35 mm kultur parabol med en loddrett trykk-drill. Flytt bore sakte og bære vernebriller. Fjerne biter av plast festet til bunnen av parabolen med et blad for å lage en glatt overflate på den eksterne siden (figur 2). Påfør et tynt lag av marine-grade epoxy eller lim på at eksterne undersiden av retten. Sett en film av polyester (2,5 µm ty…

Representative Results

Figur 5 er et eksempel på LIPUS eksperiment multiplekset med kalsium imaging. Glioblastom celler (A-172) ble dyrket på EMPM belagt polyester film i standard kultur medium (supplert med 10% serum og 1% antibiotika), og inkubert med kalsium-sensitive fluorescerende reporter Fluo-4 AM. Cellene ble fotografert med en 10 X nedsenking linsen og opplyst med en hvit LED-lyskilde og fluorescens lys ble samlet inn med en standard GFP filter. LIPUS ble brukt av manuel…

Discussion

Hovedfordelen av fokusert ultralyd er dens evne til å levere ikke-invasively mekanisk og/eller termisk energi til biologiske prøver med høy spatio-temporale presisjon. Andre teknikker skal mekanisk stimulere cellene vanligvis ansette invasiv fysiske sonder (f.eks celle-poking) eller krever samspillet av høy energi laserstråler med uvedkommende gjenstander (f.eks optisk pinsett). Magnetisk oppvarming kan varme bestemte romlige steder inne biologiske prøver men tilstedeværelsen av utenlandske magne…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Mikhail Shapiro og Nikita Reznik for fruktbart diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler fra Western University of Health Sciences og NIH gi R21NS101384.

Materials

upright microscope with large working volume Thorlabs CERNA
upright microscope with large working volume Scientifica SliceScope
optomechanical components Thorlabs n/a
needle hydrophone ONDA Corporation HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone Precision Acoustics n/a
fiber optic hydrophone ONDA Corporation HFO series
fiber optic hydrophone Precision Acoustics n/a
oscilloscope Keysight Technology DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator Keysight Technology 33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier Electronic Navigation Industries (ENI) 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer Olympus focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer Benthowave Instrument HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer Precision Acoustics Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer Ultrasonic-S-lab HiFu transducers made to order
high-density Matrigel Corning VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns Chemplex CAT.NO:107

References

  1. Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
  2. Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. . Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).
  3. Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
  4. Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
  5. Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
  6. Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
  7. Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
  8. Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
  9. Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
  10. Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
  11. Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
  12. Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
  13. Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
  14. Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
  15. Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
  16. O’Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
  17. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
  18. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
  19. Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
  20. Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
  21. Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
  22. Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).

Play Video

Cite This Article
Lacroix, J. J., Ozkan, A. D. Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58781, doi:10.3791/58781 (2019).

View Video