Summary

Поколение клоны клеток рака для визуализации Telomeric повтор содержащие РНК Терра выразил от одного теломер в живых клеток

Published: January 17, 2019
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол для создания клоны клеток рака, содержащий MS2 последовательности тег в одной subtelomere. Этот подход, опираясь на системе MS2-GFP, позволяет визуализации эндогенного стенограммы из telomeric повтор содержащие РНК (Терра) выразил от одного теломер в живых клетках.

Abstract

Теломеры транскрибируется, рождая telomeric повтор содержащих длиной некодирующих РНК (Терра), которой было предложено играть важную роль в биологии теломер, включая формирование гетерохроматин и гомеостаза Длина теломер. Последние результаты показали, что молекулы Терра также взаимодействовать с внутренней хромосомных регионов для регулирования экспрессии генов в мышиных эмбриональных стволовых (ES) клеток. С учетом этих доказательств, РНК флуоресценции в situ гибридизация (РНК-рыбы) анализы показали, что только подмножество Терра стенограммы локализовать на концах хромосомы. Лучшего понимания динамики молекул Терра поможет определить их функции и механизмы действия. Здесь мы описываем метод ярлык и визуализировать сингл теломеры Терра стенограммы в раковых клетках, с использованием системы MS2-GFP. С этой целью мы представляем протокол для создания стабильной клоны, используя линии клеток рака человеческого желудка AGS, содержащий MS2 последовательности, интегрированных в один subtelomere. Транскрипция Терра с меткой MS2 теломер приводит выражение с тегами MS2 Терра молекул, которые визуализируются микроскопии флуоресцирования клеток после совместного выражение MS2 RNA-связывая протеинов, сливается с GFP (MS2-ГФП). Этот подход позволяет исследователям изучить динамику одного теломеры Терра молекул в раковых клетках, и он может быть применен к другим клеточных линий.

Introduction

Длиной некодирующих Терра РНК транскрибируется из региона subtelomeric хромосом и его транскрипции приступает к концам хромосомы, завершение в течение1,telomeric повторить тракта2. По этой причине Терра стенограммы состоят из subtelomeric производные последовательностей в конце их 5′ и прекратить с telomeric повторяется (UUAGGG позвоночных)3. Важные роли были предложены для TERRA, включая формирование гетерохроматин теломеры4,5, ДНК репликации6, поощрение гомологичная рекомбинация среди хромосома заканчивается7,8 , 9, регулирующих теломер структуры10и теломер длина гомеостаза2,11,12,13. Кроме того Терра стенограммы взаимодействуют с многочисленными extratelomeric сайтов для регулирования экспрессии генов широко в мыши эмбриональных стволовых (ES) клетки14. С учетом этих доказательств, флуоресценции в situ гибридизация РНК (РНК-рыбы) анализы показали что только подмножество Терра стенограммы локализовать теломеры1,2,15. Кроме того Терра сообщалось в форме ядерного агрегатов, локализация на X и Y хромосомы в мыши клетки2,16. Эти результаты показывают, что Терра стенограммы пройти сложную динамику в ядре. Понимание динамики молекул Терра поможет определить их функции и механизмы действия.

MS2-GFP системы широко используется для визуализации молекул РНК в живых клетках различных организмов17,18. Эта система использовалась ранее тег и визуализировать сингл теломеры Терра молекул в S. cerevisiae12,19. С помощью этой системы, недавно было показано, что дрожжи Терра стенограммы локализовать в цитоплазме во время пост diauxic сдвиг фазы, предполагая, что Терра могут оказывать extranuclear функций20. Недавно мы использовали MS2-GFP системы для изучения одного теломеры Терра стенограммы в раковых клетках21. С этой целью мы заняты средство редактирования генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 для интеграции MS2 последовательности в одном теломер (теломеры 15q, далее Tel15q) и получены клоны, выражая MS2-тегами эндогенного Tel15q TERRA (Терра-MS2 клоны). Сопредседатель выражение GFP-кварцевое MS2 RNA-связывая белка (MS2-GFP), что признает и связывает MS2 РНК последовательности позволяет визуализации одного теломеры Терра стенограмм в живых клетках21. Цель Протокола, показанные здесь является подробно описать шаги, необходимые для создания клонов Терра-MS2.

Для создания клонов Терра-MS2, мс2 кассету интегрирован в регионе subtelomeric теломер 15q, ниже по течению Терра промоутер региона и транскрипции запуск сайта. Кассета MS2 содержит ген сопротивления неомицин, обрамленная аргона p сайты, и ее интеграции в subtelomere 15q осуществляется с помощью системы ТРИФОСФАТЫ/Cas922. После того, как выбираются трансфекции MS2 Кассетный сингл клоны и subtelomeric интеграции кассеты проверяется методом ПЦР, ДНК последовательности и Южные помарки. Позитивные клоны были заражены Cre выражая аденовирус, чтобы удалить маркер выделения в кассету, оставив только MS2 последовательности и один жидкий кислород p сайта на subtelomere 15q. Выражения с меткой MS2 Терра транскрипты от Tel15q проверяется по RT-ПЦР. И наконец, выражается MS2-GFP синтез белка в Терра-MS2 клоны через ретровирусной инфекции для того, чтобы визуализировать MS2-Терра стенограммы микроскопии флуоресцирования. Терра стенограммы могут быть легко обнаружены РНК-рыба и клеток изображений с использованием telomeric повтор конкретных зондов1,2,15,23. Эти подходы обеспечивают важную информацию о локализации всего населения Терра молекул в одну ячейку резолюции. Поколение клонов, содержащих MS2 последовательности в одном subtelomere позволит исследователей для изучения динамики сингл теломеры Терра стенограмм в живых клетках, которые помогут определить функции и механизмы действия Терра.

Protocol

1. Выбор неомицин устойчивостью клонов Растут AGS клеток в среде Хам F-12_K (Kaighn), с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС), 2 мм L-глютамина, пенициллин (0,5 единиц / мл среды) и стрептомицин (0,2 мкг / мл среды) при 37 ° C и 5% CO2. Transfect клетки на 50-60% слияния с sgRNA/Cas9, выражая вектора и MS2 кассету в 1:10 молярно?…

Representative Results

Рисунок 1 представляет собой обзор экспериментальной стратегии. Основные этапы протокола и ориентировочные сроки для поколения Терра-MS2 клонов в клетках AGS показываются (рис . 1А). В день 1 несколько скважин 6 хорошо плиты явл…

Discussion

В этой статье мы представляем метод для создания человеческих раковых клеток клоны, содержащие MS2 последовательности в рамках subtelomere 15q. Используя эти клоны, мс2 тегами Терра молекул, трансляции из subtelomere 15q распознаются микроскопии флуоресцирования выражением совместного MS2-GFP синтез бе…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны сотрудникам передовой визуализации объекта CIBIO в университете Тренто и Фондом BioOptics свет микроскопия на Макс ф Perutz лабораторий (MFPL) в Вене. Исследований, приведших к эти результаты получил финансирование от Mahlke-Оберманн Stiftung и седьмой рамочной программы Европейского союза для исследований, технологических разработок и демонстрации соглашению Грант не 609431 в ЕС. EC поддерживается Рита Леви Монтальчини стипендий от итальянского министерства образования университета и исследования (MIUR).

Materials

AGS cells Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

References

  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

Play Video

Cite This Article
Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

View Video