Hier presenteren we een protocol voor het genereren van kanker cel klonen met een MS2 sequence tag op een enkele subtelomere. Deze aanpak, afhankelijk van het MS2-GFP-systeem, maakt de visualisatie van de endogene transcripten van Telomere herhalen-bevattende RNA (TERRA) uitgedrukt uit een enkele telomeer in levende cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Telomeren zijn getranscribeerd, die aanleiding geven tot Telomere herhalen-bevattende lang noncoding RNAs (TERRA), die zijn voorgesteld om te spelen belangrijke rollen in de telomeer biologie, met inbegrip van de heterochromatin formatie en telomeer lengte homeostase. Recente bevindingen bleek dat TERRA moleculen ook met interne chromosomale regio's communiceren te regelen van genexpressie in cellen van muis embryonale stamcellen (ES). In overeenstemming met dit bewijs, RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis) analyses hebben aangetoond dat alleen een subset van TERRA lokaliseren afschriften aan chromosoom uiteinden. Een beter begrip van de dynamiek van TERRA moleculen zal helpen bepalen hun functie en de mechanismen van de actie. Hier beschrijven we een methode om te etiketteren en visualiseren van single-telomeer TERRA afschriften in kankercellen met behulp van het MS2-GFP-systeem. Voor dit doel presenteren we een protocol voor het genereren van stabiele klonen, opdrachtregel de AGS menselijke maag kanker cel, met MS2 sequenties op een één subtelomere geïntegreerd. Transcriptie van TERRA van het MS2-gelabeld telomeer resulteert in de expressie van TERRA MS2-gelabelde moleculen die worden gevisualiseerd door live-cel fluorescentie microscopie op co expressie van een MS2 RNA-bindende eiwit gesmolten tot GFP (MS2-GFP). Deze aanpak kan onderzoekers bestuderen de dynamiek van single-telomeer TERRA moleculen in kankercellen, en het kan worden toegepast op andere cellijnen.
Inleiding
De lange noncoding RNA TERRA is transcriptie van de subtélomérique regio van chromosomen en de transcriptie opbrengst naar de uiteinden van chromosomen, afgifte binnen de Telomere herhalen tract1,2. Om deze reden, TERRA Transcripten bestaan uit subtelomeric afkomstige sequenties aan hun 5'-eind en beëindigen met Telomere herhalingen (UUAGGG in Vertebraten)3. Belangrijke rollen zijn voorgesteld voor TERRA, met inbegrip van de heterochromatin formatie bij telomeren4,5, DNA replicatie6, bevordering van homol....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Selectie van resistente neomycine klonen
- AGS in Ham van F-12_K (Kaighn) medium aangevuld met 10% foetale boviene Serum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem) en streptomycine (0,2 µg per mL voedingsbodem) bij 37 ° C en 5% CO2cellen groeien. Transfect van de cellen aan een 50-60% samenvloeiing met de sgRNA/Cas9 uiten van vector en het MS2-cassette op een 1:10 molaire verhouding21.
Opmerking: In een parallelle experiment, laten verifiëren van transfectie efficiëntie door een vector van GFP-uitdrukken (dat wil zeggen, Cas9-GFP vector) transfecting. Ten minste 60-70% transfectie ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 geeft een overzicht van de experimentele strategie. De belangrijkste stappen van het protocol en een indicatief tijdschema voor de generatie van TERRA-MS2 klonen in AGS cellen worden weergegeven(figuur 1). Op dag 1, zijn meerdere putjes van een 6 goed plaat transfected met de MS2 cassette en sgRNA/Cas9 uiten van vectoren (afgebeeld in figuur 1B.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel presenteren we een methode voor het genereren van menselijke kanker cel klonen met MS2 sequenties geïntegreerd binnen subtelomere 15q. Met behulp van deze klonen, worden de transcriptie van de subtelomere-15q MS2-gelabeld TERRA-moleculen gedetecteerd door fluorescentie microscopie door co uitdrukking van een fusieproteïne MS2-GFP. Deze aanpak kan onderzoekers bestuderen de dynamiek van TERRA uitgedrukt uit een eenpersoons telomeer in levende cellen21. In dit protocol, worden TERRA-M.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen
Dankbetuigingen
We zijn dankbaar voor het personeel van de geavanceerde imaging faciliteit van CIBIO bij de Universiteit van Trento en de BioOptics licht microscopie faciliteit op de Max F. Perutz laboratoria (MFPL) in Wenen. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van de Mahlke-Obermann-Stiftung en de zevendekaderprogramma voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie van de Europese Unie onder de Subsidieovereenkomst geen 609431 bij EG. EG wordt ondersteund door een Rita Levi Montalcini fellowship van het Italiaanse ministerie van onderwijs, Universiteit en onderzoek (MIUR).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AGS cellen | - | - | Gift van Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Kweekmedium voor AGS-cellen |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component van kweekmedium |
| Penicilline Streptomycine Oplossing | CORNING | 30-002-CI | Component van kweekmedium |
| Fetaal bovien serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component van kweekmedium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | kweekmedium voor phoenix-cel |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | gebruikt bij de phoenix-celtransfectie |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing) en retrovirus precipitatie |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | gebruikt bij de phoenix-celtransfectie (HBS-oplossing) |
| TRYPSIN EDTA OPLOSSING 1X | CORNING | 59430C | gebruikt bij celsplitsing |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component van celvriesmiddel (80% FBB en 20% DMSO) |
| G-418 Disulfaat | Formedium | G4185 | selectiemiddel voor |
| Gelatine oplossing Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | coating van 96-well DNA-plaat en vriesplaat |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component van Cel lysis buffer voor genomische DNA extractie |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradatie tijdens DNA extractie |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel voorbereiding |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Kleurmiddel gebruikt voor het detecteren van DNA en RNA monsters in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitatie |
| Natriumacetaat | Sigma Aldrich | 71196 | Gebruikt voor DNA precipitatie op een 3M concentratie pH5.2 |
| Wizard SV Gel en PCR clean-Up systeem | Promega | A9282 | Extractie van PCR fragmenten uit agarose gel tijdens PCR screening van neomycin positieve klonen |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organisch oplosmiddel gebruikt voor RNA extractie |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradatie van genomisch DNA uit RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | gebruikt in RT en PCR reacties |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | gebruikt in RT reacties |
| diethyl pyrocarbonaat | Sigma Aldrich | D5758 | gebruikt om RNAses in water te inactiveren (1:1000 verdunning) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | voorbereiding van RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | voorbereiding van denaturerende RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscriptiereactie |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reactie |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reactie |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | gebruikt om TERRA-MS2 klonen te infecteren om het neomycn-gen te verwijderen |
| Natrium Butyraat | Sigma Aldrich | B5887 | gebruikt om de retrovirusdeeltjesproductie in phoenix-cellen te bevorderen |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitatie van retrovirusdeeltjes |
| 35µ-Schaal Glasbodem | Ibidi | 81158 | gebruikt bij live cel beeldvorming analyses van TERRA-MS2 klonen |
Referenties
- Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
- Schoeftner, S., Blasco, M. A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
