Summary

Generatie van kanker cel klonen te visualiseren Telomere Repeat-bevattende RNA TERRA uitgedrukt uit een enkele Telomere in levende cellen

Published: January 17, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van kanker cel klonen met een MS2 sequence tag op een enkele subtelomere. Deze aanpak, afhankelijk van het MS2-GFP-systeem, maakt de visualisatie van de endogene transcripten van Telomere herhalen-bevattende RNA (TERRA) uitgedrukt uit een enkele telomeer in levende cellen.

Abstract

Telomeren zijn getranscribeerd, die aanleiding geven tot Telomere herhalen-bevattende lang noncoding RNAs (TERRA), die zijn voorgesteld om te spelen belangrijke rollen in de telomeer biologie, met inbegrip van de heterochromatin formatie en telomeer lengte homeostase. Recente bevindingen bleek dat TERRA moleculen ook met interne chromosomale regio’s communiceren te regelen van genexpressie in cellen van muis embryonale stamcellen (ES). In overeenstemming met dit bewijs, RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis) analyses hebben aangetoond dat alleen een subset van TERRA lokaliseren afschriften aan chromosoom uiteinden. Een beter begrip van de dynamiek van TERRA moleculen zal helpen bepalen hun functie en de mechanismen van de actie. Hier beschrijven we een methode om te etiketteren en visualiseren van single-telomeer TERRA afschriften in kankercellen met behulp van het MS2-GFP-systeem. Voor dit doel presenteren we een protocol voor het genereren van stabiele klonen, opdrachtregel de AGS menselijke maag kanker cel, met MS2 sequenties op een één subtelomere geïntegreerd. Transcriptie van TERRA van het MS2-gelabeld telomeer resulteert in de expressie van TERRA MS2-gelabelde moleculen die worden gevisualiseerd door live-cel fluorescentie microscopie op co expressie van een MS2 RNA-bindende eiwit gesmolten tot GFP (MS2-GFP). Deze aanpak kan onderzoekers bestuderen de dynamiek van single-telomeer TERRA moleculen in kankercellen, en het kan worden toegepast op andere cellijnen.

Introduction

De lange noncoding RNA TERRA is transcriptie van de subtélomérique regio van chromosomen en de transcriptie opbrengst naar de uiteinden van chromosomen, afgifte binnen de Telomere herhalen tract1,2. Om deze reden, TERRA Transcripten bestaan uit subtelomeric afkomstige sequenties aan hun 5′-eind en beëindigen met Telomere herhalingen (UUAGGG in Vertebraten)3. Belangrijke rollen zijn voorgesteld voor TERRA, met inbegrip van de heterochromatin formatie bij telomeren4,5, DNA replicatie6, bevordering van homologe recombinatie tussen chromosoom eindigt7,8 , 9, telomeer structuur10en telomeer lengte homeostase2,11,12,13te reguleren. Verder, TERRA afschriften communiceren met talrijke extratelomeric sites te reguleren van wijdverbreide genexpressie van muis embryonale stamcellen (ES) cellen14. In overeenstemming met dit bewijs, RNA fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-vis) analyses hebben aangetoond dat alleen een subset van TERRA afschriften lokaliseren op telomeren1,2,15. Daarnaast is TERRA gemeld aan nucleaire aggregaten formulier lokaliseren op de X en Y chromosomen in2,16van de cellen van de muis. Deze bevindingen wijzen erop dat TERRA afschriften complexe dynamiek binnen de kern ondergaan. Inzicht in de dynamiek van TERRA moleculen zal helpen definiëren hun functie en de mechanismen van de actie.

Het MS2-GFP-systeem is wijd verbeid gebruikt om te visualiseren de molecules van RNA in levende cellen van verschillende organismen17,18. Dit systeem is eerder gebruikt voor tag en visualiseren van single-telomeer TERRA moleculen in S. cerevisiae12,19. Met behulp van dit systeem, werd onlangs aangetoond dat gist TERRA afschriften binnen het cytoplasma tijdens de post-diauxie shift fase lokaliseren, suggereren dat TERRA extranuclear functies20kan uitoefenen. Onlangs hebben we het MS2-GFP-systeem gebruikt om te studeren van single-telomeer TERRA afschriften van kanker cellen21. Voor dit doel, wij het uitgeven hulpmiddel van CRISPR/Cas9 genoom te integreren MS2 sequenties op een enkele telomeer (telomeer 15q, hierna Tel15q) in dienst en verkregen klonen uiten MS2-gelabeld endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 klonen). Co uitdrukking van een GFP-gesmolten MS2 RNA-bindende eiwit (MS2-GFP) dat herkent en bindt MS2 RNA opeenvolgingen maakt visualisatie van single-telomeer TERRA afschriften in levende cellen21. Het doel van het protocol geïllustreerd hier is om te beschrijven in detail de stappen die nodig zijn voor de generatie van TERRA-MS2 klonen.

Voor het genereren van TERRA-MS2 klonen, een MS2 cassette is geïntegreerd in de regio subtélomérique telomeer 15q, stroomafwaarts van de TERRA promotor regio en transcriptie begin site. De MS2 cassette bevat een neomycine resistentie gen geflankeerd door lox-p sites, en zijn integratie op subtelomere 15q wordt uitgevoerd met behulp van het systeem CRISPR/Cas922. Nadat de transfectie van het MS2 cassette, enkele klonen zijn geselecteerd en subtélomérique integratie van de cassette wordt gecontroleerd door PCR, DNA sequencing en Southern blot. Positieve klonen zijn besmet met een adenovirus Cre-uiten ter opheffing van de markering van selectie in de cassette, waardoor alleen MS2 sequenties en een enkele lox-p-site op de subtelomere-15q. Expressie van TERRA MS2-gelabeld transcripties van Tel15q wordt gecontroleerd door RT-qPCR. Tot slot het MS2-GFP fusieproteïne wordt uitgedrukt in TERRA-MS2 klonen via retrovirale infectie om te visualiseren MS2-TERRA afschriften door fluorescentie microscopie. TERRA afschriften kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door RNA-vis en live-cel geschikt zijn met behulp van Telomere herhalen-specifieke sondes1,2,15,23. Deze benaderingen leveren belangrijke informatie over de lokalisatie van de totale bevolking van TERRA moleculen bij eencellige resolutie. De generatie van klonen met MS2 sequenties op een enkel subtelomere kunnen onderzoekers bestuderen de dynamiek van single-telomeer TERRA afschriften in levende cellen, die zal helpen bij het definiëren van de functie en de mechanismen van de actie van TERRA.

Protocol

1. Selectie van resistente neomycine klonen AGS in Ham van F-12_K (Kaighn) medium aangevuld met 10% foetale boviene Serum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (0.5 eenheden per mL voedingsbodem) en streptomycine (0,2 µg per mL voedingsbodem) bij 37 ° C en 5% CO2cellen groeien. Transfect van de cellen aan een 50-60% samenvloeiing met de sgRNA/Cas9 uiten van vector en het MS2-cassette op een 1:10 molaire verhouding21.Opmerking: In een parallelle experiment, laten verifiër…

Representative Results

Figuur 1 geeft een overzicht van de experimentele strategie. De belangrijkste stappen van het protocol en een indicatief tijdschema voor de generatie van TERRA-MS2 klonen in AGS cellen worden weergegeven(figuur 1). Op dag 1, zijn meerdere putjes van een 6 goed plaat transfected met de MS2 cassette en sgRNA/Cas9 uiten van vectoren (afgebeeld in figuur 1B…

Discussion

In dit artikel presenteren we een methode voor het genereren van menselijke kanker cel klonen met MS2 sequenties geïntegreerd binnen subtelomere 15q. Met behulp van deze klonen, worden de transcriptie van de subtelomere-15q MS2-gelabeld TERRA-moleculen gedetecteerd door fluorescentie microscopie door co uitdrukking van een fusieproteïne MS2-GFP. Deze aanpak kan onderzoekers bestuderen de dynamiek van TERRA uitgedrukt uit een eenpersoons telomeer in levende cellen21. In dit protocol, worden TERRA…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn dankbaar voor het personeel van de geavanceerde imaging faciliteit van CIBIO bij de Universiteit van Trento en de BioOptics licht microscopie faciliteit op de Max F. Perutz laboratoria (MFPL) in Wenen. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van de Mahlke-Obermann-Stiftung en de zevendekaderprogramma voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie van de Europese Unie onder de Subsidieovereenkomst geen 609431 bij EG. EG wordt ondersteund door een Rita Levi Montalcini fellowship van het Italiaanse ministerie van onderwijs, Universiteit en onderzoek (MIUR).

Materials

AGS cells Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

References

  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).

Play Video

Cite This Article
Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

View Video