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Genetics

从活细胞中的单端粒表达的癌症细胞克隆的生成, 以可视化含有端粒重复的 rna terra

doi: 10.3791/58790 Published: January 17, 2019

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以生成包含 ms2 序列标记在单个亚端粒的癌细胞克隆。这种方法, 依靠 ms2-gfp 系统, 实现了端粒重复 rna (terra) 的内源性转录记录的可视化表达从一个端粒表达在活细胞中。

Abstract

端粒被转录, 导致端粒重复编码 rna (terra), 这已被建议在端粒生物学中发挥重要作用, 包括异染色质的形成和端粒长度的稳态。最近的发现表明, terra 分子也与内部染色体区域相互作用, 以调节小鼠胚胎干细胞 (es) 细胞的基因表达。根据这一证据, rna 荧光原位杂交 (rnaa-fish) 分析表明, 只有一部分 terra 转录记录定位在染色体末端。更好地了解 terra 分子的动力学将有助于确定其功能和作用机制。在这里, 我们描述了一种方法, 标签和可视化单端粒 terra 转录在癌细胞使用 ms2-gfp 系统。为此, 我们提出了一个协议, 以产生稳定的克隆, 使用 ags 人类胃癌细胞系, 包含 ms2 序列集成在一个单一的亚端粒。从 ms2 标记的端粒中转录 terra 的结果是 ms2 标记的 terra 分子的表达, 这些分子在 ms2 rna 结合蛋白融合蛋白与 gfp (ms2-gfp) 共表达后, 通过活细胞荧光显微镜进行了可视化。这种方法使研究人员能够研究癌细胞中单端粒 terra 分子的动力学, 并可应用于其他细胞系。

Introduction

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长非编码 rna terra 从染色体的亚端粒区域转录, 其转录向染色体末端进行, 在端粒重复道1,2内终止。因此, terra 记录由 5 ' 端的亚端粒衍生序列组成, 并以端粒重复终止 (脊椎动物中的 uuaggg)3。提出了 terra 的重要作用, 包括端粒4、5、dna 复制 6的异染色质形成, 促进染色体末端 7,8 同源重组,9、调节端粒结构10和端粒长度稳态2,11,12,13。此外, terra 转录与许多体外位点相互作用, 以调节小鼠胚胎干细胞 (es) 中广泛的基因表达。根据这些证据, rna荧光原位杂交 (rna-fish) 分析表明, 只有一部分 terra 转录记录定位端粒1,2,15。此外, 据报道, terra 在小鼠细胞2,16的 x 和 y 染色体处形成核聚集物。这些发现表明, terra 记录在细胞核内经历了复杂的动态。了解 terra 分子的动力学将有助于确定其功能和作用机制。

ms2-gfp 系统已被广泛用于可视化来自不同生物体的活细胞中的 rna 分子 17,18.该系统以前曾被用来标记和可视化单端粒 terra 分子在酿酒师12,19。利用该系统, 最近显示酵母 terra 转录转录位在细胞质内的后二氧化转变阶段, 这表明 terra 可能会发挥核外功能20。我们最近使用 ms2-gfp 系统研究癌细胞21中的单端粒 terra 转录.为此, 我们使用 crispr/cas9 基因组编辑工具将 ms2 序列集成在单个端粒 (端粒 15q, 以下为 telq 15q) 上, 并获得了表示 ms2 标记内生 t15q terra (terra-ms2 克隆) 的克隆。gfp 熔融 ms2 rna 结合蛋白 (ms2-gfp) 的共表达, 可识别并结合 ms2 rna 序列, 从而实现活细胞21中单端粒 terra 转录的可视化.本文所述协议的目的是详细描述生成 terra-ms2 克隆所需的步骤。

为了生成 terra-ms2 克隆, ms2 盒被集成在端粒15q 的亚端粒区域内, 位于 terra 启动子区域和转录起始位点的下游。ms2 盒式磁带含有由 lox-p 位点两侧的新霉素耐药基因, 其在近端粒15q 上的整合是使用 crispr/cas9 系统22进行的。经转染 ms2 盒后, 选择单克隆, 用 pcr、dna 测序和南方印迹验证盒的亚端粒积分。阳性克隆感染了表达 crec 的腺病毒, 以便删除盒式磁带中的选择标记, 只在近端粒15q 留下一个 ms2 序列和一个 lox-p 位点。通过 rt-qpcr 验证了 tel15q 中 ms2 标记的 terra 转录的表达。最后, ms2-gfp 融合蛋白通过逆转录病毒感染在 terra-ms2 克隆中表达, 以便用荧光显微镜显示 ms2-terra 转录。使用端粒重复特异性探针 121523可通过 rna-fish 和活细胞成像快速检测 terra 记录。这些方法提供了关于 terra 分子在单个细胞分辨率下的总种群定位的重要信息。在单个亚端粒生成含有 ms2 序列的克隆, 将使研究人员能够研究活细胞中单端粒 terra 转录的动力学, 这将有助于确定 terra 的功能和作用机制。

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Protocol

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(一)新霉素耐药克隆的选择

  1. 在哈姆赫-12k (kaighn) 培养基中生长 ags 细胞, 辅以10% 的胎儿牛血清 (fbs)、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (培养基每毫升0.5 单位) 和链霉素 (每毫升介质 0.2μg) 和 5% co2.将细胞与 sgrnams9 表达载体和 ms2 盒式磁带以50-60 的融合方式转染, 以1:10 摩尔比21
    注: 在并行实验中, 通过转染 transfection 表达向量 (cas9-gfp 矢量) 来验证转染效率。应达到至少60-70% 的转染效率。
  2. 第二天, 以含有新霉素的培养基 (选择性培养基) 取代培养培养基。
    注: 在转染后的第二天, 将细胞拆分并在选择性培养基中播种, 将加快选择过程。所有未转染的细胞将立即死亡。如果转染在6个井板中进行, 在这种情况下, 60% 汇流处的每口井都含有大约 0.7 x10 6 个细胞, 第二天就可以将细胞从一口井分成10厘米的含有选择性介质的盘子。
  3. 将细胞保持在选择性培养基中 7-10, 每一两天改变介质, 直到单个克隆可见。
  4. 细胞克隆的拾取
    1. 准备一个96孔板, 每口井中含有 10μl 0.25% 的胰蛋白酶。
      注: 准备两个96孔板, 以防超过96个克隆, 预计将被挑选。
    2. 使用显微镜, 用标记在盘子底部做一个点, 标记每个在 1 0 厘米长的盘子中可见的克隆位置。每个点将对应于要选取的群体。
    3. 用足够的磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 取代培养培养基, 在克隆体上形成一层薄薄的液体膜, 而不是让细胞在克隆采摘过程中干燥。
    4. 使用10μl 移液器选择单个菌落。将含有5μl 胰蛋白酶的尖端连接到菌落, 并慢慢释放将保留在菌落上的胰蛋白酶。允许胰蛋白酶分离细胞 1分钟, 然后用尖端刮伤菌落并将其吸进尖端。
      注: 在此过程中, 翻转菜的一侧, 以减少 pbs 的体积周围被挑选将有助于采摘过程中, 避免稀释周围的菌落周围的胰蛋白酶。使用克隆环也可以帮助拾取单个克隆。
    5. 将菌落中的细胞放入含有 10μl 0.25% 胰蛋白酶的96井板的井中。
    6. 在室温下孵化 5分钟, 然后用150μl 的选择性培养基 (ham 的 f-12k (kaighn) 培养基补充10% 的 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (培养基0.5 单位)、链霉素 (每毫升介质0.2 微克), 并含有新霉素, 并含有新霉素, 在浓度为0.7μgml。
      注: 在孵化期间, 可以选择其他克隆。建议选择尽可能多的克隆。选择的克隆越多, 识别阳性克隆的可能性就越大。
    7. 一旦所有克隆被采摘并转移到96井板中, 允许细胞在选择性培养基火腿的 f-12k (kaighn) 介质中生长几天, 辅以10% 的 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (每 mM 0.5 单位, 培养基)、链霉素 (0.2 微克/毫升在37°c 和 5% co2 浓度为0.7μgml 时含有新霉素, 直至达到90% 的汇合点。
  5. 克隆的拆分
    1. 每口井加入100μl 明胶, 制备三个96孔板涂上明胶, 在室温下孵育 30分钟, 然后用 pbs 清洗两次。这些板将用于 dna 提取 (dna 板) 和克隆冷冻 (冷冻板)。
      注: 明胶将促进细胞和 dna 与油井的附着。特别是, 明胶涂层将允许 dna 粘在井底的 dna 提取和洗涤过程 (讨论如下)。在拆分过程中, 建议使用多通道移液器。
    2. 一旦克隆达到90% 的融合, 从96孔板的每一口抽吸培养基, 用 pbs 清洗, 每口井加入 30μl 0.25% 的胰蛋白酶, 并在37°c 孵育5分钟。
      注: 克隆将以不同的速度增长, 这也将取决于每个克隆选择的细胞数量。因此, 这一步将在不同克隆达到90% 融合的几天内执行。
    3. 每口井加入70μl 的选择性培养基, 通过在井内上下移液来破坏细胞团块, 然后将100μl 的30μl 转移到涂布的 dna 板上, 上面装满120μl 的选择性培养基, 将30μl 转移到每口井的糊化冷冻板上h 50μl 介质 (无选择)。
    4. 将 dna 板放入孵化器中, 使细胞在37°c 和 5% co2 下生长, 直到 90%的融合。
    5. 在冻结板的每口井中加入80μl 的冰凉新鲜冷冻介质 (80% fbs 和20% 二甲基亚硫酸 (dmso)), 在板材顶部加入副底 (喷上70% 乙醇), 以便将每个井封好, 将盖子盖在上面, 并用铝箔包裹板材。 将冻结板放置在-80°c。
    6. 在原96井板上加入90μl 选择性培养基, 其中含有已被分裂的克隆体, 并将其保存在培养中, 直至 pcr 筛选结果。这个板块将被用作备用板。

2. 新霉素耐药克隆的筛选

  1. 从96口井 dna 板中提取 dna
    1. 一旦在 dna 板中培养的克隆体达到90% 的融合度, 用 pbs 清洗 2次, 然后用50μl 裂解缓冲液裂解2次 (10 mm tris ph 7.5, 10 mm edta, 10 mm 氯化萘, 0.5% sds 和 1 mgml 蛋白酶 k) 裂解。用护栏覆盖板, 密封每口井, 盖上盖子, 用沙兰包裹盖上盖子, 并在37°c 放置一夜。
    2. 在每口井中加入100μl 冷乙醇 (et-oh)/氯化钠溶液 (100% 乙醇中的 0.75 m 氯化碳), 并在室温下沉淀6小时或过夜。
      注: 协议可以在此处暂停。
    3. 通过倒置板, 去除 et-oh/ncl 溶液, 用每口700% 乙醇200μl 清洗3次。
    4. 在蒸馏水中加入 25μl rnse a 溶液, 在37°c 孵育1小时。
  2. 使用3μl 的基因组 dna 进行 pcr 扩增。利用新霉素耐药基因和近端粒15q 内的引物退火对选定的克隆进行 pcr 筛选。pcr 扩增是使用标准聚合酶和 pcr 协议21进行的。
    注: ms2 引物 (ms2-近15q 引物和 ms2 引物 as) 和 ctr 引物 (ctr 素数 s 和 ctr 引物 as) 的 pcr 条件如下: 98°c 为变性步骤 20秒, 然后在 98°c 10秒时进行34个循环, 58°C 20秒, 72°c 15 s, 在25μl 反应混合物中使用聚合酶酶 (见材料表)。引物序列如表 1所示。
  3. 在琼脂糖凝胶上运行 pcr 反应, 并使用标准凝胶提取程序提取从阳性克隆中获得的 pcr 带 (见凝胶提取试剂材料表)。
  4. 对凝胶提取的 pcr 产物进行 dna 测序分析, 以确认 ms2 序列21的存在。
    注: 测序分析可以使用用于 pcr 筛选的引物进行。
  5. pcr 阳性克隆的南方印迹筛选
    1. 在 pcr 和测序筛选中, 从原来的96孔板 (备用板) 增长到 ham f-12k (kaighn ' s) 培养基中的6个井板, 辅以10% 的 fbs、2 mm l-谷氨酰胺、青霉素 (培养基为0.5 单位)、链霉素 (0.2 微克/小时)培养基中的 ml), 并在 37°c 5% co 2 的浓度为0.7μgml 时含有新霉素.
      注: 或者, 如果其中一些克隆丢失, 则从其中一个冻结板上解冻 (见议定书 2.6)。
    2. 一旦克隆在6井板中的90% 汇流处, 用 pbs 清洗细胞, 并添加250微米的裂解缓冲液, 每口井含有0.5 微克蛋白酶 k。
    3. 使用细胞刮刀刮除细胞, 并将裂解液转移到 1.5 ml 管中。
    4. 在37°c 下孵化16小时。
    5. 加入1毫升的100% 乙醇, 用力摇晃, 并让 dna 在-20°c 下沉淀至少2小时或夜间。
      注: 协议可以在此处暂停。
    6. 在4°c 下以 13 400 x g 的速度旋转 10分钟, 丢弃上清液, 用70% 乙醇清洗颗粒。让颗粒在室温下干燥。或者, 使用真空集中器。
    7. 将 dna 颗粒在含有 rnse a 的50μl 蒸馏水中再循环, 在37°c 下孵育1小时。
    8. 在100μl 反应体积内使用 ncoi 和 bamhi 限制性酶 (两个独立消化酶), 在37°c 的情况下通过在37°c 的消化反应中进行5-10 微克的基因组 dna。
    9. 在琼脂糖凝胶 (0.8% 琼脂糖) 上运行4μl 的消化, 以进行完全消化确认。
    10. 在限制性消化反应中加入半体积的醋酸钠3m 溶液 ph 5.2 和2体积100% 乙醇, 并在-20°C 孵育至少2小时或一夜以沉淀 dna。
      注: 协议可以在此处暂停。
    11. 在4°c 条件下以 13 400 x 克离心 20分钟, 丢弃上清液, 并用70% 乙醇清洗颗粒。让颗粒在室温下风干。或者, 使用真空集中器。
    12. 在20μl 的蒸馏水中重新获得颗粒, 并将消化后的 dna 加载到0.8% 的琼脂糖凝胶上。
      注: 为了更好地解决消化 dna 的分辨率, 请制备长度至少为15厘米的凝胶, 并在低电压 (̴30伏) 下连夜运行。建立的电泳应进行优化。
    13. 第二天, 用 dna 标记剂 (如 1μl/10 ml 最终浓度下的溴化乙酯) 染色凝胶 30分钟, 并在室温下用靠近凝胶的标尺拍摄照片。
    14. 设置 dna 转移到尼龙膜, 并使用标准程序21与 ms2 序列特异性探针进行膜杂交。
    15. 从两个冷冻板中的一个中解冻 pcr、dna 测序和南方印迹呈阳性的克隆体 (见下一步)。
  6. 克隆体的解冻
    1. 准备一个含有5毫升预热火腿 f-12k (kaighn) 介质的 15 ml 管, 辅以10% 的 fbs、2 mL l-谷氨酰胺、青霉素 (每毫升0.5个单位) 和链霉素 (每毫升介质 0.2μg), 使每个克隆人都能解冻。
    2. 从-80°取出其中一个冷冻板, 并在含有正克隆的井中加入100μl 的预热 f12k 完整介质。
      注: 此过程应快速执行, 96 井板应放置在干冰上, 每次克隆解冻后, 以允许其他克隆保持冻结。如果需要从同一个96孔板上解冻多个克隆, 这一点尤其重要。
    3. 将细胞转移到含有5毫升介质的15毫升管, 并在室温下以 800 x g 的速度将离心机转移5分钟。
    4. 吸吸培养基, 在预热前的 f12k 介质500μl 中重新悬浮细胞, 并将每个克隆转移到12孔板的一口井中。
  7. 从亚端粒15q 整合的 ms2 盒中消除新霉素耐药基因。
    1. 允许克隆从一个12井盘成长为一个10厘米的盘子在完整的 f12k 介质。
      注: 除非另有说明, 否则不应将新霉素列入培养基。
    2. 将表达 cres 的腺病毒添加到10厘米的培养物中, 在70% 的融合中, 在10毫升的完整 f12k 培养基中培养。
      注: 使用 cr-gfp 表示腺病毒将允许评估感染的效率, 这应该接近100%。复制缺陷腺病毒将在培养中的几个通道后丢失。
    3. 感染48小时后, 将细胞分成3个10厘米的盘子。两个菜将用于验证新霉素基因去除的负选择, 生长细胞中的新霉素含有培养基 (第一盘), 并由南方印迹 (第二盘)。
    4. 培养含有克隆的第三道菜, 用于细胞冷冻和 rna 提取。

3. rt-qpcr 验证 terra-ms2 成绩单的表达

  1. 在确认新霉素基因去除后, 使用有机溶剂 (苯酚和鸟嘌呤异硫氰酸溶液)terra-ms2 克隆中提取总 rna 21。
    1. 在100μl 的碳酸二乙酯 (depc) 水中, 将从10厘米的盘中提取的 rna 重新利用。
    2. 在变性 (含有1% 甲醛) 1x 3-(n-morpholino) 丙磺酸 (mops) 凝胶上运行 3μl rna, 以验证 rna 的浓度和完整性。也使用分光光度计分析 rna 浓度。
    3. 用10μl 最终反应体积中的 1个 dnse i 酶单位, 用 dnasse i 治疗 3μg rna。
    4. 在37°c 下将反应培养1小时。
  2. 逆转录酶和 qpcr 分析
    1. 在无核酸酶微离心管中加入以下成分: 1μm terra 特异性引物的2μl、1μl 的 dntp 混合 (每个 10 mm)、6μl 的 dNTPs i 处理 rna (对应̴300ng rna)。使用4μl 的 depc 水将体积调整为13μl。
      注: 对于要分析的每个 rna, 应准备一个包含相同试剂但具有参考的特定引物的第二管, 而不是 terra 特定引物。
    2. 将混合物加热至 65°c 5分钟, 在冰中孵育至少1分钟。
    3. 通过短暂离心收集管的含量, 并添加4μl 的 5x rt 酶缓冲液、1μl 0.1 m 二硫醇 (dtt)、1μl (4 单位) 的 rnse 抑制剂和1μl 的逆转录酶 (见《材料表》)。
    4. 将样品在42°c 下培养 60分钟, 然后使用2μl 的 rt 反应进行 qpcr 分析。
  3. 在20μl 的最终体积内制备 qpcr 反应混合物, 包括10μl 的 2x qpcr 主混合物、2μl 的 cdna 模板、1μl 的正向底漆 (10μm)、1μl 的反向底漆 (10μm) 和6μl 的水。
  4. 使用标准协议21在热环素中进行 qpcr 反应。

4. 生产表达逆转录酶病毒的 ms2-gfp

  1. 要产生 ms2-gfp 表达逆转录酶病毒, 用 ms2-gfp 融合蛋白 (pbbe-ms2-gfp pBabe-) 和使用摩尔比4:1 的env基因表达载体 (如 pcmv-vvvvg) 转染80% 的融合凤凰包装细胞。两个向量。
  2. 第二天, 将培养基 (dmem 补充 10% fbs、2mm l-谷氨酰胺和 penn-strep) 替换为含有10mm 丁酸钠的新鲜培养基。
  3. 在37°c 下培养 8小时, 5% 二氧化碳,然后用新鲜的培养基取代培养基, 从其中收集病毒。
  4. 48小时后, 从凤凰细胞中取出含有逆转录病毒的培养基。这种介质可直接用于感染 terra-ms2 克隆, 在这种情况下, 通过0.45μm 过滤器过滤培养基, 添加聚乙烯 (30μgl 最终浓度) 并将其添加到细胞中 (在这种情况下, 协议将在步骤5中继续进行)。或者, 可以在50毫升猎鹰管中沉淀逆转录酶病毒, 加入 50% peg-8000/900 mm ncl 溶液, 并在4°c 的旋转轮上孵育.
  5. 第二天, 通过离心在 2, 000 x 克的情况下离心, 30分钟内的颗粒逆转录病毒颗粒, 去除上清液, 并在没有血清的 f12k 培养基中重新悬浮颗粒。
    注: 病毒颗粒可以在原始上清液体积的百分之一重新悬浮。应进行感染测试, 以验证有效感染细胞所需的逆转录酶病毒的最小体积。

5. 活细胞中 terra-ms2 转录的可视化

  1. 玻璃底盘中的板 terra-ms2 克隆和 wt ags 细胞。在感染当天, 在培养基 (30μgml 最终浓度) 和表达逆转录酶病毒的 ms2-gfp 中加入聚乙烯。
  2. 24小时后, 丢弃含病毒培养基, 加入不含酚红色的新鲜培养基。
  3. 使用适当的显微镜设置在倒置显微镜下分析细胞。用 100 x 或60x 目标将细胞与大的数值孔径 (1.4 x) 和敏感相机 (emccd) 进行成像。在成像过程中, 使用环境控制系统将样品保持在37°c 和5% 二氧化碳.

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Representative Results

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图 11表示实验策略的概述。该协议的主要步骤和在 ags 单元中生成 terra-ms2 克隆的指示性时间表如下图所示 ( 1a)。在第1天, 用 ms2 盒式磁带和 sgrna/cas9 表示向量转染6孔的多个井 (如 1b 所示)。在 cas9 nickase 表示 px335 载体中克隆了两个不同的近端粒15q 特异性引导 rna 序列, 生成了两个 sgrna-px335 载体, 与 ms2 盒式磁带共同转染。其中一口井可以用 transfected 表示向量进行转染, 以验证转染效率。第2天, 细胞被胰蛋白酶化, 并从一口井转移到含有选择性培养基的10厘米盘。在第3天, 介质应该改变, 因为大多数未转染的细胞都会死亡。细胞在选择中生长, 直到克隆可见并准备被选择。在此期间, 细胞不应被胰蛋白酶化, 培养培养基应在第一周每1-2天更换一次, 然后在一周后每2-3天更换一次。一旦可以看到单个克隆, 它们就会被采摘并转移到一个96井板中, 在那里它们可以生长到达到80-90% 的汇合点。此时, 克隆被拆分为4个不同的96孔板, 这些板在 1中用颜色代码标记。一旦在 dna 片 (绿色) 中培养的克隆体达到80% 的融合, 就会被裂解并提取基因组 dna 进行 pcr 筛选;备份板 (蓝色) 中的克隆体将保存在培养中, 直到 pcr 筛选结果出来, 而红色的冷冻板则冻结在-80°C。图 12b显示了抗霉素克隆的 pcr 筛选的代表性结果。在这种筛选中, 使用了两套引物: 一对引物 (ms2 引物) 在新霉素基因内退火, 并使用近端粒15q 序列来验证 ms2 盒的存在 (引物定位的代表性图像显示在 2a)。第二引物对 (ctr 引物) 在内部染色体区域退火用于验证是否存在假阴性克隆 (引物序列如 1所示)。用于集成盒式磁带的负克隆对 ms2 引物的放大应为负离子, 对 ctr 引物的扩增呈正相关。基因组 dna 提取中的技术问题导致没有基因组 dna 或其污染, 这将阻止 ms2 和 ctr 引物反应的 pcr 扩增。在这些情况下, 所涉及的克隆可以通过 pcr 从备用板中提取基因组 dna 后重新筛选。利用 ms2 引物可以提取和测序从 ms2 引物放大阳性克隆中获得的带, 以确认 10个 ms2 序列的存在。

在 pcr 筛选中呈阳性的克隆体从96孔备份板 ( 1中的蓝色板) 培养到6个井板, 然后裂解进行基因组 dna 提取和南方印迹分析。图 12d显示了一种有代表性的图像, 即在 pcr 阳性克隆的南方印迹筛选中, 用放射性标记的 ms2 序列特异性探针 (右) 混合的凝胶 (左) 和膜混合。为了确认 ms2 序列在近端粒15q 的整合, 从每个克隆中提取的基因组 dna 应在两种不同的消化反应中使用两种不同的限制性酶 (ncoi 和 bamhi) 进行消化。ncoi 和 bomhi 限制性酶适用于在近端粒15q 上验证 ms2 盒式磁带的集成。其他酶也可以使用。这种凝胶显示了使用 bamhi 限制性酶完全消化基因组 dna 的情况, 如涂片的存在所示。南方印迹的结果表明, 一个克隆对在近端粒15q 处的 ms2 盒式磁带的集成是肯定的, 而几个克隆则显示盒式磁带的多个集成事件, 这表现在多个波段的存在上。阳性克隆应通过对 ncoi 基因组 dna 21 的消化进行第二次南方印迹分析. 2c 显示了含有 ms2 盒磁带的亚端粒15q 的代表性图像以及 bami 和 ncoi 限制性酶位点的位置。

pcr 和南方印迹分析阳性克隆体感染了表达腺病毒的 cre-gfp, 以去除 ms2 盒磁带中存在的新霉素基因。图 13 个a描述了 cre 表达前后 ms2 标记的近端粒15q。 3b 显示了感染了表达腺病毒的 cre-gfp 病毒的 ss2 盒式磁带在15q 亚端粒整合的克隆阳性图像。要完全切除所有细胞中的新霉素基因, 感染效率应达到约100%。如 3c 所示, 为了验证新霉素基因的消除, cre-gfp 感染的细胞在感染48小时后被分成三个板块。在新霉素存在的情况下, 将培养一个盘子。这个盘子里的所有细胞都应该在6-7 内死亡。在第二个板块中, 细胞将被允许在完全的介质中生长, 而不需要选择高达80-90% 的融合。在这一点上, 基因组 dna 提取和分析南方的污点。在完整的培养基中培养第三个板, 用于制备克隆的冷冻库存, 以及 rna 提取和 terra-ms2 转录表达的 rt-qpcr 分析。图 13 个d显示了在 cre-gfp 感染前后对阳性克隆进行南方印迹分析的代表性图像。dna 琼脂糖凝胶 (左图) 证实了基因组 dna 的完全消化使用 ncoi 限制酶。南方印迹分析是使用放射性标记的 ms2 序列特定探针 (右图) 进行的。这一分析证实了新霉素基因的去除。cre-gfp 感染样本中存在涂片, 证实了 ms2 序列的端粒整合。ncoi 限制站点在亚端粒15q 中的位置如 3a所示。

一旦新霉素耐药基因的消除得到证实, 克隆可以测试 terra-ms2 转录体的表达。为此, 从每个克隆中提取总 rna, 并在变性的 mops 凝胶上运行, 以确认其完整性 ( 4a)。核糖体 rRNA 带应该是可见的 4, 700个碱基 (rrna 28s) 和 1, 900个碱基 (rrna 18 s)。逆转录酶反应使用端粒重复特异性引物和参考基因特异性引物 ( 4b,上图) 进行, 而 qpcr 分析的 terra 表达是使用两套引物: 一对引物ms2 序列和亚端粒15q 序列内的对退火;在亚端粒15q 内退火的第二对引物。引物序列如 1所示。 4b 中的图显示了从 ags wt 细胞和两个不同的 terra-ms2 克隆中对 terra 表达的 rt-qpcr 分析。这些分析证实了 terra-m2 文字记录在两个克隆中的表达水平与 wt 细胞中的 terra 转录量15q 所表达的水平相当。这些数据表明, 所选择的两个 terra-ms2 克隆体适用于活细胞成像分析 terra-ms2 记录。

为了在活细胞中显示 terra-ms2 转录, 所选择的克隆体感染了表达 ms2-gfp 融合蛋白的逆转录酶病毒。图 15a显示了生成 ms2-gfp 表达逆转录酶病毒的过程, 如协议步骤4中所述。ags wt 细胞和 terra-ms2 克隆体在玻璃底的盘子中被感染。感染24小时后, 用荧光显微镜对细胞进行分析。信号的特雷-ms2-gfp 病灶的存在证实了信号的特雷-ms2-gfp 病灶的存在, 而不是在 ags wt 细胞中检测到的病灶 ( 5b)。在 ms2-gfp 表达细胞的群体中, 预计细胞间的 ms2-gfp 水平会异质性, 并应选择表达低水平的细胞进行成像分析。或者, ms2-gfp 表达细胞可以通过流式细胞仪的前显微镜分析进行排序, 以收集表达 gfp 水平较低的细胞亚群。我们以前在 ags terra-ms2 克隆21的40% 至60% 的细胞中检测到了 terra-ms2-gfp 病灶.在这些细胞中, 每个细胞被成像1至 4个 terra-ms2-gfp 焦点。terra-ms2-gfp 焦点显示不同的大小和动态可被检测到21。terra-ms2 克隆可用于研究活细胞中单端粒 terra 转录的动力学。作为这种应用的一个例子, 5c显示了来自一个 terra-ms2 克隆的显微镜分析的代表性图像, 该克隆表达了 ms2-gfp 融合蛋白和与 mcherry 融合的端粒结合蛋白 trf2, 以便可视化 ms2 标记的 terra 转录和活细胞中的端粒。使用这种方法, 我们以前观察到, terra-ms2-gfp 病灶与端粒在44% 的细胞中共同定位, 这表明 terra 转录只与 ags细胞 21中的染色体末端短暂共存。

Figure 1
图 11.在 ags 细胞中生成 terra-ms 2 克隆的实验策略和指示性时间表 概述。a)显示了协议中描述的步骤以及选择 terra-ms2 克隆的指示性时间线。细胞转染在6孔板与线性化 ms2 盒和 sgrnas9 表达向量。使用颜色代码来区分协议部分中指示的 dna 板、备份板和冻结板。b) ms2 盒式磁带由800米长的端粒15q 序列组成, 然后是10次重复的 ms2 序列和一个新霉素耐药基因, 由 lox-p 位点侧边, 并在其 3 ' 端端端部重复道终止。sgrnas9 表达载体是通过克隆 px335 载体中的近端粒15q 特异性指导 rna 序列而产生的, 使用 bbsi 限制站点21,22。生成了两个不同的 sgrna-px335 向量, 并使用了两个向量的1:1 混合进行转染。sgrna 的序列如 1所示。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 12.具有代表性的新霉素耐药无性系 pcr 和南方印迹筛选的图像.a)含有 ms2 盒式磁带的亚端粒15q 的代表性图像。指出了用于 pcr 筛选的 ms2 引物 (ms2-近15q 引物和 ms2 引物 as) 的位置。盒式磁带中的 loxp 站点显示为红色。b)使用两套引物 ms2 引物和 ctr 引物 (ctr 原体 s 和 ctr 引物 as) 对耐新霉素克隆进行 pcr 筛选的代表性图像。c) 含有ms2 盒式磁带的亚端粒15q 的代表性图像。显示了 bamhi 和 ncoi 限制点以及用于南方印迹筛选的 ms2 探测器。d)左: 用 bamhi 消化每个克隆的10微克基因组 dna, 并在琼脂糖凝胶上运行。这张图片是在以 3 0 伏的速度连夜运行后获得的。正确: 用 bamhi 限制性酶消化的基因组 dna 被转移到带正电荷的尼龙膜中, 并与放射性标记的 ms2 序列特异性探针杂交。红色框指示正带的预期大小。红色箭头表示一个正克隆。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 13 个.消除新霉素耐药基因并进行验证实验。a) cre表达前后含有 ms2 盒式磁带的亚端粒15q 的代表性图像。显示了用于南方印迹分析和 ncoi 限制性酶位点的 ms2 特异性探针。盒式磁带中的 loxp 站点显示为红色。b)荧光显微镜分析感染了表达腺病毒的 crra-ms2 克隆。显示了在单个焦平面上获得的代表性图像。moi 是感染的多样性, 是用于感染的病毒数量与宿主细胞数量之间的比率。标度条: 30μm c)用于验证新霉素基因消除的实验策略概述。cre-gfp 感染的细胞在感染48小时后被分成三个板块进行负选择, 二) 南方印迹分析和 (iii) 冷冻细胞库存的制备和 rna 提取。d) 神经微博分析了 cre-gfp 腺病毒感染前后的 terra-ms2 克隆。用限制性酶 ncoi 消化10μg 的基因组 dna。琼脂糖凝胶证实, 完全消化是在两个克隆 (左) 实现。消化后的基因组 dna 被转移到带正电荷的尼龙膜, 并使用 ms2 序列特异性探针进行杂交。新霉素基因的完全消除是由没有特定的带证实的。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 14 个.rt-qpcr 分析tel 15 q-terra 和 tel15q-terra-ms2 文字表达。a)显示从 ags wt 细胞和 terra-ms2 克隆中提取的总 rna 的 mops 凝胶的代表性图像。指出了与核糖体 rna 28s 和18s 相对应的带。b)顶部: ms2 标记的亚端粒15q 的示意图, 表达 terra 的成绩单。显示了用于 tel15q-terra (蓝色) 和 tel15q-ms2 terra (红色) 的 terra 逆转录酶和 qpcr 分析的引物。loxp 站点显示为红色。底部: 对 ags wt 细胞和 terra-ms2 克隆中 tel15q-terra 和 tel15q-ms2 terra 转录表达的 rt-qpcr 进行分析。*p < 0.05, 未配对t-测试。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 15.terra-ms 2 克隆的活细胞成像分析 。a)生成 ms2-gfp 表达逆转录酶病毒的过程概述, 如协议步骤4中所述。右图显示了 ms2 标记的亚端粒15q 和 ms2-gfp 融合蛋白识别的 terra 转录的示意图。b) 代表性荧光显微镜图像的 ags wt 和两个 terra-ms2 克隆表示 ms2-gfp。terra-ms2-gfp 焦点由箭头表示。图像是使用配备 emccd 摄像机的旋转圆盘共聚焦显微镜获得的。这些图像是在37°c 保持在37°c 的成像室中使用 100 x 1.46 消光剂目标拍摄的, 具有 5%的 co2。使用488激光作为光源。刻度条: 5μm . c) terra-ms2-gfp 病灶和 trf2-mcherry 标记端粒的活细胞成像分析。显示了 terra-ms2-gfp 焦点与单个端粒之间的协同本地化事件。图像与b一样, 使用488和520激光作为光源。给出了在延时成像实验的单时间点进行的 z 堆栈实验的最大投影。刻度栏: 5μm. 请点击这里查看这个数字的更大版本.

底漆名称 底漆序列 应用
ms2-近 15q-primer-s tgcattaagggccattg ms2 引物前置技术在新霉素耐药无性系 pcr 筛选中的应用
ms2 底漆 as ccatacacacacacacacacacaga ms2 引物反向检测新霉素耐药无性系的 pcr
ctr 底漆 s TGT ACG CCA CAG TGC TGC TGG ctr 引物前置技术在新霉素耐药无性系 pcr 筛选中的应用
ctr 引物 as GCT GGA AGG TGG ACG A ctr 引物反向检测新霉素耐药无性系的 pcr
tel15q-s1 ggagagatcccacagc 用 qpcr 检测 tel15q 和 tel15q-ms2 terra 表达的感官引物
htel15q-as taacacagaggagggggg 用 qpcr 检测 tel15q 和 tel15q-ms2 terra 表达的反义引物
tel15q-ms2-as attttctgatcatgagcattagg qpcr 检测 tel15-g-ms2 terra 表达的反义引物
terra-rt 底漆 cctaacccactactacca 用于 terra 转录的逆转录酶
sgRNA1 ttggagagacctcgcgccc 在 px335 载体中克隆的短导 rna 1 序列, 用于将 cas9 镍酶酶活性定向到近端粒15q
sgrna2 tgcattaagggccattg 在 px335 载体中克隆的短导 rna 2 序列, 用于将 cas9 镍酶酶活性定向到近端粒15q

工作台1: 本研究中使用的引物列表.提供了本协议中使用的引物和 sgrna 序列的列表。序列为 5 ' 到 3 '。

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Discussion

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在本文中, 我们提出了一种方法来生成人类癌症细胞克隆包含 ms2 序列集成在亚端粒15q。利用这些克隆体, 用荧光显微镜通过 ms2-gfp 融合蛋白的共表达检测从近端粒15q 转录的 ms2 标记的 terra 分子。这种方法使研究人员能够研究在活细胞21中的单个端粒表达的 terra 的动力学。在该协议中, 在 ags 细胞系中选择 terra-ms2 克隆, 这代表了一个有趣的模型系统来研究 terra, 因为 terra 表达在人类胃癌样本24 中被放大。但是, 这里描述的协议可以适应其他细胞系中 terra-ms2 克隆的选择。通过使用特定的 ms2 盒式磁带和 crispr 策略, 可以在不同于端粒15q 的亚端粒上促进 ms2 序列的集成。在本文提出的方法中, 采用了 cas9 镍酶和双导 rna, 以提高积分22的特异性.使用这一策略, 预计在 ags 细胞中将发现总共2% 的阳性克隆。其他版本的 cas9 酶可以测试, 试图提高克隆选择25的成功率.此外, 要最大限度地提高克隆选择的效率, 需要考虑协议的以下步骤如下:

i) 为了增加选择 terra-ms2 克隆的机会, 重要的是要实现 ms2 盒式磁带和 crispr 向量的高转染效率。转染不良的细胞系很可能需要几轮转染、克隆选择和筛选, 才能选择阳性克隆。

ii) 重要的是要确定新霉素的确切浓度, 用于选择克隆。事实上, 使用低浓度的药物会导致假阳性克隆, 而高浓度可能会阻止确定阳性克隆。本协议中指出的新霉素浓度在培养培养基添加后6-7 内对 ags 细胞是致命的。

iii) 挑选克隆是关键的一步。事实上, 在这一过程中, 只需要选择单个克隆。因此, 应避免彼此距离太近的菌落, 以防止来自不同克隆的混合细胞, 从而选择可能含有 ms2 序列的混合克隆群, 这些克隆体可能包含整合在多个基因组位点的 ms2 序列。这些事件应在南方印迹筛查期间确定。

iv) 从96井 dna 片 (第2议定书) 中提取的基因组 dna 量估计在5微克左右, 只要用单一的限制性酶消化技术通过 pcr 和南方印迹来筛选每一个克隆体就足够了。然而, 为了确认盒式磁带在预期端粒的整合, 用两种不同的限制性酶消化基因组 dna, 通过南方印迹筛选每个克隆将是非常重要的。为此, 如议定书所述, pcr 筛选中阳性的克隆应在6个井板中培养。从6井板的井中提取的基因组 dna 量将足以满足南方印迹分析所需的至少两个限制消化。

在这里描述的协议中, ms2 序列被集成在亚端粒15q 中, 原因有很多: i) 在这个亚端粒 26, 27 上已经确定了 terra 区域和terra转录起始位点;ii) 利用体外技术4、27282930验证了亚端粒15q 的 terra表达;iii) 对15q 染色体的亚端体区域进行了测序, 它包含一个与端粒重复道相邻的独特区域, 可用于 ms2 盒式磁带21的集成。pcr 和南方印迹方法的开发是为了确认在 terra-ms2 克隆中的亚端粒15q 内的 ms2 序列的单一集成。这将是有趣的, 在染色体传播进行 dna-fish 实验, 以可视化的染色体定位的 ms2 序列在固定中期染色体。然而, 10xms2 序列的长度 (450 bp) 要求使用非常短的探针, 而 dna-fish 实验中通常使用的探针是染色体传播 (细菌人工染色体 (bp)、宇宙或质粒)31。这一技术挑战使我们无法将染色体传播上的 ms2 序列可视化, 而这代表了协议的局限性。该方法的另一个限制是选择 terra-ms2 克隆所需的时间和工作量。此外, 还需要专门的实验室设置和使用病毒的设备、放射性物质和显微镜分析。

这里描述的方法可以实现在不同细胞系的 terra-ms2 克隆的生成, 以定义 terra 在各种生物环境中的动态, 如在端粒功能障碍或细胞衰老期间, 帮助我们了解terra 在这些过程中的功能。这种方法的一个有趣的发展将是生成包含 teto 重复的 terra-ms2 克隆, 这些克隆集成在特定的亚端粒上, 包括 ms2 标记的端粒。与荧光蛋白 (mcherry) 融合的 tetr 蛋白的表达将使这种特殊的端粒在活细胞32 中的可视化。这种方法将有助于调查人类 terra 转录是否定位和行动在 cis 在 terra转录端粒和染色体, 或通过转移到其他染色体。terra 生物学中的这个问题还有待澄清。

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Disclosures

提交人声明没有相互竞争的经济利益

Acknowledgments

我们感谢特伦托大学 ciboi 先进成像设施的工作人员和维也纳 max f. perutz 实验室 (mfpl) 的生物光学光学显微镜设施的工作人员。导致这些成果的研究得到了 Mahlke-Obermann 基金会和欧洲联盟根据609431欧盟赠款协议进行的第七个研究、技术开发和示范框架方案的资助。欧共体得到意大利教育大学和研究部 (miur) 的 rita levi montalcini 研究金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGS cells - - Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

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References

  1. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, (5851), 798-801 (2007).
  2. Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10, (2), 228-236 (2008).
  3. Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. (2017).
  4. Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19, (9), 948-956 (2012).
  5. Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9, (1), 1548 (2018).
  6. Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8, (1), 2114 (2017).
  7. Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
  8. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (10), 1199-1205 (2013).
  9. Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170, (1), 72-85 (2017).
  10. Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. (2018).
  11. Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17, (7), 999-1012 (2016).
  12. Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51, (6), 780-791 (2013).
  13. Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12, (8), e1006268 (2016).
  14. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170, (1), 86-101 (2017).
  15. Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319, (3), 46-55 (2013).
  16. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, (3), 685-698 (2009).
  17. Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
  18. Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
  19. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5, (3), 407-419 (2014).
  20. Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. (2018).
  21. Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. 1-10 (2018).
  22. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, (6), 1380-1389 (2013).
  23. Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
  24. Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125, (Pt 18), 4383-4394 (2012).
  25. Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36, (3), 265-271 (2018).
  26. Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15, (12), 2186-2194 (2009).
  27. Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
  28. Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7, (4), e35714 (2012).
  29. Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347, (6219), 273-277 (2015).
  30. Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23, (12), 2149-2157 (2013).
  31. Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  32. Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145, (3), 447-458 (2011).
从活细胞中的单端粒表达的癌症细胞克隆的生成, 以可视化含有端粒重复的 rna terra
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Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).More

Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

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