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Neuroscience

Calretinin के लिए Immunostaining गुदा चूषण बायोप्सी द्वारा Hirschsprung रोग का निदान, S100 प्रोटीन और प्रोटीन जीन उत्पाद ९.५

Published: April 26, 2019 doi: 10.3791/58799
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Pediatric Surgery, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

यह प्रोटोकॉल calretinin, S100 प्रोटीन, और प्रोटीन जीन उत्पाद ९.५ के लिए immunostaining गुदा चूषण बायोप्सी की प्रक्रिया का वर्णन करता है । इस उपंयास है Hirschsprung रोग के लिए सहायक नैदानिक विधि बेहतर संवेदनशीलता और विशिष्टता दर है ।

Abstract

Hirschsprung रोग (एच. डी.) एक जन्मजात आंतों की बीमारी है कि चिकित्सकीय शिशुओं में जाविष्ठा पारित करने के लिए या बच्चों में दीर्घकालिक कब्ज के रूप में असमर्थता के रूप में प्रकट होता है । मलाशय सक्शन बायोप्सी (आरएसबी) गुच्छिका कोशिकाओं और तंत्रिका अतिवृद्धि की अनुपस्थिति को निर्धारित करने के लिए वर्तमान में एचडी के निदान के लिए सबसे सटीक परीक्षण है । पारंपरिक hematoxylin-इओसिन धुंधला संवेदनशीलता और विशिष्टता का अभाव है । एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ अभिरंजक व्यापक रूप से अपनी जटिल प्रक्रिया के कारण नहीं किया जा सकता है । हमारे calretinin के लिए immunostaining के उपंयास प्रोटोकॉल, S100 प्रोटीन, और प्रोटीन जीन उत्पाद ९.५ (पीजीपी 9.5), जो हम RSBs पर आयोजित किया, उच्च संवेदनशीलता और ९६.४९% की विशिष्टता दर दर्शाती है (९५% विश्वास अंतराल, 0.88-0.99) और १००% (९५% विश्वास अंतराल, 097-1.00), क्रमशः । एच. डी. प्रभावित खंडों अक्सर calretinin की अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति के रूप में मौजूद, S100 प्रोटीन, और पीजीपी 9.5, जो सबम्यूकोसल ऊतक में तंत्रिका अतिवृद्धि के मार्कर हैं. यह प्रोटोकॉल इस नई नैदानिक पद्धति की विस्तृत प्रचालन प्रक्रिया का वर्णन करता है ।

Introduction

Hirschsprung रोग (एच. डी.) एक आम जन्मजात आंत आंत्र विकार बाहरी आंत्र पथ के विभिन्न क्षेत्रों में गुच्छिका कोशिकाओं की कमी की विशेषता है1. भ्रूणीय तंत्रिका कोशिकाओं के आक्रमण के पूरा होने पर मानव आंत्रीय तंत्रिका तंत्र बनता है । अगर इस प्रक्रिया में गड़बड़ी होती है और आक्रमण पूरा नहीं हो पाता है तो नवजात की बाहर की आंत एगलिनिक2हो जाती है । इस संभावित घातक स्थिति को हिर्श्उछला रोग कहा जाता है । प्रसार, गतिशीलता, और आंत विकास सफल colonization के तीन मुख्य घटक हैं ।

पारंपरिक hematoxylin और eosin (एच & ई) एक सीमित सबम्यूकोसल बायोप्सी के धुंधला के रूप में एक परिणाम के रूप में संतोषजनक प्राप्त नहीं कर सकता एच & सर्जरी से प्राप्त एक पूर्ण मोटाई ऊतक के धुंधला । इसके अतिरिक्त, एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ (दर्द) गुदा सक्शन ऊतक के धुंधला सैद्धांतिक रूप से अपनी अपर्याप्त संवेदनशीलता, जो ९१% है, और जमे हुए वर्गों3,4के जटिल प्रसंस्करण के कारण चुनौतीपूर्ण है । कई अन्य immunohistochemical मार्कर की गुच्छिका कोशिकाओं और तंत्रिका तंतुओं कि formalin-फिक्स्ड और पैराफिन एम्बेडेड नमूनों में दाग किया जा सकता है धीरे-धीर मुख्यधारा HD निदान बन रहे हैं. Calretinin एक विटामिन डी पर निर्भर कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन है कि myenteric और सबम्यूकोसल के जाल में व्यक्त नहीं है HD-प्रभावित खंड5. S100 प्रोटीन तंत्रिका शिखा से व्युत्पन्न कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जैसे तंत्रिका तंतुओं और glial कोशिकाओं, जो अक्सर HD के सबम्यूकोसल ऊतक में तंत्रिका अतिवृद्धि प्रभावित खंड6. प्रोटीन जीन उत्पाद ९.५ (पीजीपी 9.5) मज़बूती से दाग तंत्रिका तंतुओं और गुच्छिका कोशिकाओं; पीजीपी 9.5 धुंधला, विशेष रूप से पृथक hypoganglionosis के मामलों में, एक calretinin धुंधला करने के लिए एक पूरक के रूप में कार्य करता है । S100 और पीजीपी 9.5 के साथ डबल धुंधला गलत नकारात्मक दर को कम करने और संवेदनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं । एक पूर्वापेक्षा के रूप में, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य इस उपन्यास नैदानिक पद्धति की पर्याप्त विशिष्टता और उच्च संवेदनशीलता को सुनिश्चित करना है । हमारे उपंयास प्रोटोकॉल aganglionic आंत और hypertrophic तंत्रिका तंतुओं के भेदभाव के लिए सभी तीन मार्कर का इस्तेमाल किया । ३१८ बच्चों का एक संभावित अध्ययन हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रदर्शन किया गया था और पहले एक विस्तृत प्रोटोकॉल के बिना प्रकाशित7। विस्तृत प्रोटोकॉल और सावधानियों इस लेख में चर्चा कर रहे हैं । किसी भी नवजात शिशु जो जंम के बाद से एक गंभीर शौच की समस्या से पीड़ित या अन्य आम रोगों को छोड़कर पुरानी कब्ज के साथ बच्चों को गुदा चूषण बायोप्सी (आरएसबी) के लिए संभावित उंमीदवार हैं । हमारे उपंयास प्रोटोकॉल न केवल RSBs लेकिन यह भी पूर्ण मोटाई बायोप्सी या शल्य नमूनों के लिए एक अंतिम निदान बनाने धुंधला के लिए उपयुक्त है ।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को हएहांग यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी के यूनियन हॉस्पिटल के रिसर्च एथिक्स बोर्ड ने मंजूरी दे दी ।

1. मलाशय सक्शन बायोप्सी

  1. संरक्षक से सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित बाल चिकित्सा सर्जन और एक Rbi2 suction गुदा बायोप्सी प्रणाली का उपयोग कर एक सहायक द्वारा गुदा सक्शन बायोप्सी प्रदर्शन ।
    1. रोगियों है कि निंनलिखित संकेत है पर RSB प्रदर्शन: शिशुओं या लंबी अवधि के साथ या बच्चों में कब्ज के बिना सूजन में जामीनियम पारित करने के लिए असमर्थता; लंबे समय तक कब्ज के साथ बच्चों को जो पूर्ण शौच के लिए पैराफिन तेल की जरूरत है; आंत्ररोध के दौर से गुजर रहे बच् चों में अज्ञात कारणों से आंत्र अवरोध या आंत्र वेध
      नोट: आरएसबी के लिए मतभेद इस प्रकार हैं: जिन बच्चों में गंभीर लक्षण होते हैं, जो खराब शारीरिक स्थिति में होते हैं, या जो आरएसबी को सहन नहीं कर सकते हैं; तीव्र चरण enterocolitis के साथ बच्चों; पूर्ण उपचार के बिना आंत्र एनास्टोसिस के दौर से गुजर रहे बच्चे ।
  2. आंत्र तैयारी ३६ घंटे के रूप में एक सामान्य खारा प्रतिधारण एनीमा प्रदर्शन ढीला मल और श्लेष्मा झिल्ली की अत्यधिक सूजन से बचने के लिए । अगर बच्चे को गंभीर कब्ज है तो मैग्नीशियम सल्फेट का घोल डालें । नवजात शिशुओं को विटामिन के (1 मिग्रा प्रति किग्रा) की व्यवस्था करें ।
    नोट: पूर्व शल्य चिकित्सा रक्त परीक्षण या एंटीबायोटिक दवाओं प्रशासन नहीं करते, के रूप में वे आवश्यक नहीं हैं ।
  3. लिथोटॉमी स्थिति में रोगी रखो । कोट पैराफिन तेल के साथ ट्यूब की सतह । एक तरफ छेद के साथ मलाशय में कुंद समाप्त ट्यूब 4-7 सेमी डालें पीछे या पार्श्व दीवारों का सामना करना पड़ रहा ।
  4. गुदा दीवार को साइड होल के पर्याप्त आसंजन की सुविधा के लिए ट्यूब पर कोमल दबाव लागू करें । ट्रिगर दबाएं और तुरंत टूल वापस लें ।
  5. 2 मिमी के एक व्यास के साथ 4 चूषण बायोप्सी प्राप्त करने के लिए बायोप्सी साधन का प्रयोग करें 3 सेमी और 6 सेमी दंत रेखा से ऊपर, काटनें और posteriorly. एक सुई का उपयोग करने के लिए जाली पर नमूना जगह खारा के साथ सिक्त ।
  6. मलाशय से रक्तस्राव को नियम करने के लिए प्रक्रिया के बाद 2 घंटे तक रोगी का निरीक्षण करें । RSB के बाद पहले 24 घंटे में आगे मलाशय और गुदा जोड़तोड़ से बचें ।

2. आरएसबी वर्गों की तैयारी

  1. ऊतक को ठीक करने के लिए 6 ज के लिए 4% पैराफॉर्मलाडिहाइड में गुदा सक्शन बायोप्सी रखें । एक लगानेवाला मात्रा ऊतक की मात्रा से 5 गुना अधिक का उपयोग करें ।
  2. 11 घंटे के लिए रोग ऊतक dehydrator का उपयोग ऊतक dehydrate । पूरे क्रमादेशित प्रक्रिया निम्नलिखित 5 चरणों के होते हैं:
    1. ऊतक को फॉर्ल्डिहाइड में रखें और 1 ज के लिए ठीक करें ।
    2. 4 ज के लिए ७५% इथेनॉल में ऊतक प्लेस ।
    3. पूर्ण इथेनॉल (दो परिवर्तन, 1 ज प्रत्येक) में ऊतक प्लेस ।
    4. पूर्ण इथेनॉल में ऊतक प्लेस (दो परिवर्तन, 30 मिनट प्रत्येक) ।
    5. जाइलिन (तीन परिवर्तन, 1 ज प्रत्येक) में ऊतक प्लेस ।
  3. पैराफिन वैक्स (58-60 डिग्री सेल्सियस) (तीन परिवर्तन, 1 h प्रत्येक) में ऊतक रखें । पैराफिन ब्लॉक्स में आरएसबी के ऊतकों को एम्बेड करें ।
  4. एक माइक्रोटोम का उपयोग कर जब तक ऊतक पूरी तरह से एक पूर्ण खंड विमान के साथ उजागर है पैराफिन ब्लॉकों ट्रिम ।
  5. एक माइक्रोटोम के साथ ०.४ μm वर्गों में ब्लॉकों में कटौती ।
  6. वर्गों को एक फ्लैट प्लेट में फैल करने के लिए अनुमति देने के लिए एक कुछ सेकंड के लिए 45-50 ° c पानी में रखें ।
  7. पैराफिन अनुभागों को स्लाइड् स पर स्थानांतरित करना ।
  8. एक ६० ° c के लिए ओवन में स्लाइड सेंकना 3-5 एच । बहुत देर तक बेकिंग से बचें, जिससे एंटीजन को नुकसान हो सकता है ।
  9. जाइलिन में प्रस्थान स्लाइड प्लेस (2 परिवर्तन, 15 मिनट प्रत्येक) ।
  10. पूर्ण इथेनॉल में स्लाइड हाइड्रेट, ९५%, ८०%, और 5 मिनट प्रत्येक के लिए ७५% इथेनॉल । फिर, उंहें रिवर्स ऑस्मोसिस (आरओ) में कुल्ला-एक और 5 मिनट के लिए शुद्ध पानी ।

3. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति

  1. RO-शुद्ध पानी की २०० मिलीलीटर के साथ EDTA प्रतिजन रिट्रीवल बफर के 4 मिलीलीटर मिश्रण द्वारा calretinin पुनर्प्राप्ति के लिए काम कर रहे dilutions बनाओ । RO-शुद्ध पानी के ९९ मिलीलीटर के साथ साइट्रिक एसिड सोडियम साइट्रेट बफर (100x) के 1 मिलीलीटर मिश्रण से S100 और पीजीपी 9.5 पुनर्प्राप्ति के लिए काम dilutions बनाओ ।
    नोट: एडटा रिट्रीवल सॉल्यूशन द्वारा कैरेटिनो को अधिमान्य रूप से पुनर्प्राप्त किया जा सकता है । हालांकि, साइट्रिक एसिड सोडियम साइट्रेट बफर S100 और पीजीपी 9.5 की पुनर्प्राप्ति के लिए अधिक उपयुक्त है ।
  2. एक coplin धुंधला जार में स्लाइड प्लेस । पुनर्प्राप्ति समाधान के साथ जार भरें और यह एक preheated उबलते पानी स्नान में जगह है । 20 मिनट के लिए उबलते के बाद, पानी स्नान से जार हटा दें और इसे कमरे के तापमान को शांत करते हैं । कूलिंग प्रक्रिया में लगभग 10 मिनट लगते हैं । स्लाइडों को निकालें और धीरे से उन्हें फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) के साथ कुल्ला ।
  3. ऊतक के चारों ओर एक मार्कर कलम के साथ एक चक्र ड्रा और निम्नलिखित प्रक्रियाओं के लिए एक गीला बॉक्स तैयार करते हैं ।

4. ब्लॉक करना

  1. 30% एच2ओ2 के 3 मिलीलीटर आरओ-शुद्ध पानी के 27 मिलीलीटर के साथ मिश्रण द्वारा काम dilutions बनाओ ।
  2. Peroxidates ब्लॉक करने के लिए ऊतक परबूंद 2 ओ2 समाधान 3% की दो या तीन बूंदें जोड़ें । यह सुनिश्चित करने के लिए कि हल सर्कल से ओवरफ़्लो नहीं होगा, H2O2 समाधान तुरंत जोड़ें । ३७ ° c में peroxidates के अवरुद्ध प्रदर्शन 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर.
  3. PBS (तीन washes, 5 मिनट प्रत्येक) के साथ धीरे स्लाइड कुल्ला ।
  4. स्लाइडों को ३७ ° c पर 20 मिनट के लिए ब्लॉक करें 5% बोवाइन सीरम एल्ब्युमिन (बीएसए, १.५ ग्राम बीएसए पाउडर के साथ 30 मिलीलीटर आरओ-शुद्ध पानी के मिश्रण द्वारा तैयार) ।
    नोट: 3% एच2ओ2 के साथ ब्लॉक अविशिष्ट धुंधला और 5% BSA के साथ अवरुद्ध ९५% रोक सकता है अविशिष्ट धुंधला के अंय 5% से रोका जा सकता है । एक विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए दो विधियों का मिश्रण है ।

5. प्रतिजन-प्रतिपिंड अभिक्रिया

  1. 5% BSA निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी (calretinin, S100, या पीजीपी 9.5) के ५० μL स्लाइड करने के लिए जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं ।
  2. PBS (तीन बार, 3 मिनट प्रत्येक) के साथ स्लाइड धो लें ।
  3. इस खंड के लिए बहुलक बढ़ाने (अभिकर्मक एक; सामग्री तालिकादेखें) के ५० μl जोड़ें और इसे एक ३७ ° c इनक्यूबेटर में 20 मिनट के लिए सेते । फिर, PBS (तीन बार, 3 मिनट) के साथ स्लाइड धोने ।
  4. इस खंड के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी बी (बकरी विरोधी खरगोश/माउस IgG माध्यमिक एंटीबॉडी) के ५० μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते । PBS (तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक) के साथ अनुभाग धोएं ।

6.3, 3-diaminobenzidine और हेमेटोक्सिलिन धुंधला

  1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए RO-शुद्ध पानी की ८५० μl जोड़ें और धुंधला अभिकर्मक जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) क्रम a, B, और C. add प्रत्येक अभिकर्मकों के ५० μl 3, 3-diaminobenzidine के 1 मिलीलीटर की कुल प्राप्त करने के लिए (dab) कार्य समाधान । अगर वहाँ precipitates हैं, छानने का काम के बाद समाधान का उपयोग करें ।
  2. ऊतक अनुभाग के लिए काम कर रहे DAB समाधान की एक बूंद जोड़ें और 3-10 मिनट के लिए दाग । कमरे के तापमान पर DAB में स्लाइड सेते जब तक भूरे रंग धुंधला पता चला है । एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ध्यानपूर्वक निगरानी करें । DAB काम समाधान प्रकाश से दूर रखो । फिर, 5 मिनट के लिए PBS के साथ स्लाइड धोने ।
  3. लगभग 1 मिनट के लिए नाभिक counterstain करने के लिए hematoxylin की एक बूंद जोड़ें । फिर, coplin जार पकड़ो और यह लगभग 30-40 एस के लिए पानी की एक टपकना के तहत धोने जब तक अतिरिक्त डाई निकाल दिया जाता है । ऊतक वर्गों को नुकसान नहीं करने के लिए सावधान रहें ।
  4. 25-30 s के लिए PBS युक्त coplin जार में RSB स्लाइड्स विसर्जित फिर, 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड में अंतर-10 एस के लिए इथेनॉल PBS के साथ स्लाइड धोने 1 मिनट के लिए ।
  5. निर्जलीकरण के रिवर्स क्रम में स्लाइड dehydrate: ७५%, ८०%, ९५%, और निरपेक्ष इथेनॉल (प्रत्येक 5 मिनट) ।
  6. एक्सलीन करने के लिए स्लाइड्स का पर्दाफाश (2 परिवर्तन, 5 मिनट प्रत्येक) ।
  7. Ultraclean बढ़ते का उपयोग कर coverslip माउंट । स्लाइड को सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके दृश्यावलोकन से पहले सूखने दें ।

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Representative Results

कुल मिलाकर हमारे अध्ययन में ३१८ मरीजों को नामांकित किया गया । रोगियों के सभी आरएसबी से गुजरना पड़ा, और ऊतकों calretinin, S100, और पीजीपी 9.5 के लिए दाग रहे थे । हमारे उपन्यास प्रोटोकॉल पर आधारित निदान ९७ मामलों में एचडी था, २१३ मामलों में गैर-एचडी और 8 मामलों में संदिग्ध एचडी था । १३२ शल्य चिकित्सा रोगियों के अलावा, ९९ रोगियों को सर्जरी के बाद पूर्ण मोटाई नमूनों की immunostaining द्वारा HD के साथ का निदान किया गया । S100 और पीजीपी 9.5 धुंधला से पता चला कि ९२% और ९३% ९९ रोगियों के, क्रमशः, hypertrophied तंत्रिका चड्डी था । अन्य ८३ के १८६ मरीजों को पूरी मोटाई की बायोप्सी करानी पड़ी और गैंगलियन सेल्स दिखाई । कुल १०३ रोगियों चिकित्सकीय रूढ़िवादी चिकित्सा द्वारा ठीक किया गया, और एच. डी. बाहर रखा गया था । संदिग्ध एचडी वाले 8 मरीजों में से 3 मरीजों को शॉर्ट-सेगमेंट एचडी के रूप में वर्गीकृत किया गया था, वहीं अन्य 5 मरीजों को नॉन एचडी के रूप में वर्गीकृत किया गया था ।

हमारे परिणामों के अनुसार, आरएसबी द्वारा शुरू में ९७ रोगियों का पता चला । विस्तृत जानकारी तालिका 1में दिखाया गया है । Immunohistochemical धुंधला के लिए calretinin, S100, और पीजीपी 9.5, जो हम RSBs पर आयोजित के प्रोटोकॉल, उच्च संवेदनशीलता और ९६.४९% की विशिष्टता दर (९५% विश्वास अंतराल [CI], 0.88-0.99) और १००% (९५% CI, 097-1.00), क्रमशः । सकारात्मक भविष्य कहनेवाला मान ९४.३% (९५% CI, 087-0.99) है, और नकारात्मक भविष्य कहनेवाला मान ९९.१% है (९५% CI, 0.95-1.00) ।

चित्र 1 क और 1बी में कैल्रेटिनो के लिए प्रतिरक्षा अभिरंजन के बाद विशिष्ट परिणाम दर्शाते हैं । कई गुच्छिका कोशिकाएं, जो कैरेटिनो को अभिव्यक्त करते हैं, सामान्य ऊतकों में पाई जा सकती हैं । हालांकि, HD खंड से ऊतक के किसी भी क्षेत्र में कोई गंगासिंह कोशिकाओं का पता चला । जैसा कि चित्र 1C-थ् में दर्शाया गया है, S100 और पीजीपी 9.5 इम्यूनोस्टेइंग, सबम्यूकोसा में हाइपरट्रोफिड तंत्रिका चड्डी से पता चलता है, जबकि सामान्य रूप से अंतर्वेशित आंत में कुछ छोटे तंत्रिका टहनियों का केवल बारीक धुंधला पाया गया था । हमारे अध्ययन में, hypertrophic तंत्रिका चड्डी ≥ ४० μm के व्यास के साथ तंत्रिका तंतुओं रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: calretinin के लिए गुदा चूषण बायोप्सी के Immunostaining, पीजीपी 9.5, और S100. एच. डी.-प्रभावित ऊतक (A) और गुच्छिका कोशिकाओं में मायोमेरिक प्लैनेज़ की सामान्य रूप से innervated ऊतक (ख) में calretinin के लिए immunostaining. एच. डी.-प्रभावित खंड के myenteric जाल में कोई calretinin धुंधला का पता चला. (ग) सामान्य ऊतकों में तंत्रिका तंतुओं की तुलना में (घ) उच्च hypertrophic तंत्रिका तंतुओं में दिखाया गया है । (ड) सघन एवं प्रमुख S100 इम्यूनोस्टेनिंग से एचडी प्रभावित ऊतक के सबम्यूकोसा में हाइपरपोषी तंत्रिका चड्डी दिखाई दी । (च) सबम्यूकोसा में सामान्य तंत्रिका तंतु इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

प्रोटीन मार्कर एच डी (99) गैर-HD (219)
गुच्छिका कोशिकाएं (+) Hypertrophic तंत्रिका चड्डी (+) गुच्छिका कोशिकाएं (+) Hypertrophic तंत्रिका चड्डी (+)
कैलोरेटिनो 2 — २१४ —
S100 — ९१ — 3
पीजीपी 9.5 — ९२ — 4

तालिका 1: गुदा चूषण बायोप्सी में तीन प्रोटीन मार्कर के लिए Immunohistochemical धुंधला स्कोर ।

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Discussion

यहां हम एक प्रक्रिया तीन अलग immunohistochemical एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए HD के निदान के लिए आरबीएस वर्गों दाग बताया । हमारे नैदानिक प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता ९६.४९% (९५% CI, 0.88-0.99) था, और विशिष्टता १००% था (९५% CI, 097-1.00) ।

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम आरएसबी और प्रतिजन एंटीबॉडी रिएक्शन हैं । बायोप्सी का आकार धुंधला की सटीकता निर्धारित करता है । एक छोटी बायोप्सी एक सटीक निदान बनाने के लिए पर्याप्त ऊतक प्रदान नहीं करेगा, जबकि एक बड़ी बायोप्सी रक्तस्राव का एक उच्च जोखिम की ओर जाता है । अनुभव की बात के रूप में, 2 मिमी व्यास के साथ बायोप्सी इष्टतम आकार रहे हैं । Antigen-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के लिए, एंटीबॉडी के उचित संरक्षण को नजरअंदाज नहीं किया जा सकता । कदम से प्रोटोकॉल कदम के बाद और धीरे काम करने की जरूरत है । रिवर्स असमस-शुद्ध पानी सभी चरणों में सिफारिश की है, अवलोकन के लिए एक स्पष्ट क्षेत्र उपज और यह आसान रोगविज्ञानियों के लिए एक सटीक निदान बनाने के लिए बना रही है ।

इसके विपरीत एनीमा, एनोरेक्टल मैनोमेट्री, और ऊतक विज्ञान के साथ बायोप्सी तीन पूर्व शल्य चिकित्सा नैदानिक तरीकों कि हाल के वर्षों में इस्तेमाल किया गया है । Takawira एट अलके अनुसार । एस अनुसंधान, ऊतक विज्ञान के साथ बायोप्सी उच्चतम संवेदनशीलता और विशिष्टता8है । Meier-ruge एट अल पहले एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ (दर्द) जमे हुए गुदा सक्शन ऊतक पर धुंधला के उपयोग की सूचना १९७२ में HD के निदान में मदद करने के लिए9. यह धुंधला तरीका सबम्यूकोसा में hypertrophic तंत्रिका चड्डी का पता लगाता है । उस रिपोर्ट के बाद, दुनिया भर के कई संस्थानों एच. डी. के निदान के लिए एक सहायक के रूप में इस विधि का उपयोग करने के लिए शुरू कर दिया. अपनी नैदानिक सीमाओं के कारण, शोधकर्ताओं ने भी अन्य मार्कर पर ध्यान केंद्रित करने के लिए शुरू कर सकते हैं कि गुच्छिका कोशिकाओं और तंत्रिका तंतुओं में दाग formalin-फिक्स्ड और पैराफिन एंबेडेड नमूनों । २००४ में, Barshack एट अल. पाया कि calretinin अभिव्यक्ति के नुकसान में मदद कर सकता है aganglionic क्षेत्रों में HD10। कपूर एट अल. और guinard-सैमुअल एट अल. २००९ में प्रोटोकॉल दोहराया और निष्कर्ष निकाला है कि calretinin के लिए immunohistochemical धुंधला एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़11,12के लिए धुंधला करने के लिए बेहतर था । १९८८ में, एच. डी. के निदान के लिए S100 immunostaining पहले रोबे एट अल द्वारा शुरू की गई थी । 13. monforte-Muñoz एट अल १९९८ में विधि दोहराया और पाया कि उनके 20 hirschsprung मामलों के ९०% तंत्रिका तंतुओं ४० μm14से अधिक व्यापक था । इसलिए, S100 immunostaining मामलों में एक सहायक नैदानिक विधि के रूप में गुच्छिका कोशिकाओं के बिना सेवा कर सकते हैं । इसके अलावा, Bachmann एट अल. देखा है कि MAP2 के लिए immunohistochemical धुंधला, calretinin, GLUT1, और S100 जमे हुए अनुभाग15तकनीकों के रूप में सटीक रूप में एक विश्वसनीय परिणाम प्राप्त कर सकता है । हालांकि, में १९९२, Sams एट अल. मूल्यांकन pgp के मूल्य 9.5 HD16के निदान में । हालांकि S100 अधिक स्तरिका मलकीत तंत्रिका तंतुओं का पता लगाने कर सकते हैं, यह एक उच्च झूठी नकारात्मक दर है । इसलिए, हम पिछले अध्ययनों की सिफारिश के रूप में, HD के immunohistochemical निदान के लिए पीजीपी 9.5 और एक साथ S100 का उपयोग करने के लिए चुना है । ंयूरॉन के लिए धुंधला के कई मामलों-विशिष्ट संक्रमणकालीन क्षेत्रों में enolase भी myenteric और सबम्यूकोसल जाल में सकारात्मक गुच्छिका कोशिकाओं को दिखाया, लेकिन इन कोशिकाओं विरल और छोटे थे12. इसी तरह, calretinin-सकारात्मक गुच्छिका कोशिकाओं छोटे होते हैं और एक संकुल गठन किया है । पिछले अध्ययन से पता चला है कि कुछ थोड़ा गाढ़ा तंत्रिका ट्रंक भी एच. डी. के संक्रमणकालीन खंडों में पाया जा सकता है, लेकिन कुल colonic अगोलियोसिस के साथ, तंत्रिका चड्डी सामान्य सीमा के भीतर हो सकता है (< ४० μm)17. हम मामले से परिणाम मामले का विश्लेषण और नैदानिक अभिव्यक्तियाँ के साथ इन परिणामों के misडायग्नोसिस से बचने के लिए गठबंधन करना चाहिए ।

यह प्रोटोकॉल अंतिम रोग निदान का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है, इसलिए हम प्रत्येक बच्चे के लिए पूरी तरह से नैदानिक अनुवर्ती के एक वर्ष की एक ंयूनतम किया । साथ ही, इस प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता को प्रमाणित करने के लिए अधिक नमूनों की आवश्यकता है ।

अंत में, आरएसबी द्वारा एचडी के निदान एक सुविधाजनक तरीका है कि स्वीकार्य ंयूनतम चोट के साथ एक आदर्श ऊतकीय निदान प्रदान करता है । संवेदनशीलता बारीकी से है कि क्या नमूने की साइट सही है से संबंधित है । (क) में दिया गया है---------------------------------------------------। इन तीन मार्करों का संयोजन एचडी के लिए एक अधिक विश्वसनीय नैदानिक विधि प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को फिल्माने प्रयोगशाला प्रदान करने में उनकी बड़ी मदद के लिए Weibing तांग धंयवाद । इस लेख को सार्वजनिक कल्याण अनुसंधान द्वारा समर्थित है, और विशेष धन चीन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और परिवार नियोजन (अनुदान No. 201402007) से प्राप्त किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
calretinin antibody MXB Biotechnologies MAB-0716 170416405c antibody: primary antibody
S-100 antibody MXB Biotechnologies Kit-0007 antibody: primary antibody
PGP9.5 antibody Shanghai long island antibody Co. Ltd R-0457-03 antibody: primary antibody
enhancer reagent MXB Biotechnologies KIT-9902-A 170416405a antibody: secondary antibody A
Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody MXB Biotechnologies KIT-9902-B antibody: secondary antibody B
DAB staining kit (containing reagent A B and C) MXB Biotechnologies DAB-0031 staining kit
Heat incubator Shanghai yiheng instrument Co. Ltd DHP-9082 instrument
Rbi2 suction rectal biopsy system Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia CP1200 HP1000 SS1000 instrument
microtome Leica leica RM2016 instrument
citric acid sodium citrate buffer(100X) MXB Biotechnologies MVS-0101 antigen retrieval buffer
pathological tissue dehydrator wuhan junjie electronic Co. Ltd JT-12F instrument

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References

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा १४६ Hirschsprung रोग मलाशय सक्शन बायोप्सी calretinin S100 प्रोटीन प्रोटीन जीन उत्पाद ९.५ immunostaining
Calretinin के लिए Immunostaining गुदा चूषण बायोप्सी द्वारा Hirschsprung रोग का निदान, S100 प्रोटीन और प्रोटीन जीन उत्पाद ९.५
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Chi, S., Fang, M., Li, K., Yang, L., … More

Chi, S., Fang, M., Li, K., Yang, L., Tang, S. t. Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5. J. Vis. Exp. (146), e58799, doi:10.3791/58799 (2019).

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