Summary
Denne protokollen beskriver prosessen med immunostaining rektal sug biopsier for calretinin, S100 protein, og protein gen produkt 9,5. Denne romanen adjuvant diagnostisk metode for Hirschsprung ' s sykdom har å foretrekke følsomhet og spesifisitet priser.
Abstract
Hirschsprung ' s sykdom (HD) er en medfødt intestinal sykdom som er klinisk manifestert som en manglende evne til å passere mekonium hos spedbarn eller som langsiktig forstoppelse hos barn. Rektal sug biopsi (RSB) for å fastslå fraværet av Ganglion celler og neural hypertrofi er den mest nøyaktige testen for diagnostisering av HS i dag. Tradisjonelle hematoksylin-eosin farging mangler følsomhet og spesifisitet. Acetylkolinesterase farging kan ikke brukes mye på grunn av den kompliserte prosessen. Vår roman protokoll av immunostaining for calretinin, S100 protein, og protein genet produkt 9,5 (PGP 9.5), som vi gjennomførte på RSBs, utstillinger høy følsomhet og spesifisitet priser på 96,49% (95% tillit intervall, 0.88-0.99) og 100% (95% tillit intervall, 0.97-1.00), henholdsvis. De HD-berørte segmentene ofte til stede som fravær av uttrykk for calretinin, S100 protein, og PGP 9.5, som er markører for neural hypertrofi i submucosal vev. Denne protokollen beskriver den detaljerte operasjons prosessen for denne nye diagnostiske metoden.
Introduction
Hirschsprung ' s sykdom (HD) er en felles medfødt tarm uorden preget av mangel på Ganglion celler i ulike segmenter av den, den er i den forskjellige tarmkanalen1. Den menneskelige enteric nervesystemet dannes når invasjonen av embryonale nevrale celler er fullført. Hvis det er en forstyrrelse av prosessen og invasjonen ikke klarer å fullføre, blir den som går i tarmen til den nyfødte aganglioniske2. Denne potensielt fatale tilstanden kalles Hirschsprung ' s sykdom. Spredning, motilitet, og gut vekst er de tre viktigste komponentene i vellykket kolonisering.
Tradisjonelle hematoksylin og eosin (H & E) farging av en begrenset submucosal biopsi kan ikke oppnå så tilfredsstillende resultat som H & E farging av en full-tykkelse vev innhentet fra kirurgi. I tillegg acetylkolinesterase (smerte) farging av rektal suge vev er teoretisk utfordrende på grunn av sin utilstrekkelig følsomhet, som er 91%, og kompleks behandling av frosne seksjoner3,4. Flere andre immunhistokjemiske markører av Ganglion celler og nervefibre som kan beiset i formalin-fast og parafin-embedded eksemplarer er gradvis blitt mainstream HD-diagnostikk. Calretinin er et vitamin D-avhengig kalsium-bindende protein som ikke er uttrykt i myenteric og submucosal plexus av HD-berørte segmenter5. S100 protein uttrykkes i celler avledet fra neural Crest, som nervefibre og gliacellene celler, som ofte presenterer neural hypertrofi i submucosal vev av HD-berørte segmenter6. Protein gen produkt 9,5 (PGP 9.5) pålitelig flekker nervefibre og Ganglion celler; PGP 9.5 farging fungerer som et supplement til calretinin farging, spesielt i tilfeller av isolerte hypoganglionosis. Dobbel farging med S100 og PGP 9.5 kan redusere falske negative rate og øke følsomheten. Som en forutsetning, den nåværende studien tar sikte på å sikre tilstrekkelig spesifisitet og høy følsomhet for denne romanen diagnostisk metode. Vår roman protokollen brukte alle tre markører for diskriminering av aganglioniske tarmen og hypertrofisk nervefibre. En fremtidig studie av 318 barn ble utført av vår Lab og tidligere publisert uten en detaljert protokoll7. Den detaljerte protokollen og forholdsregler er diskutert i denne artikkelen. Eventuelle nyfødte som led av en alvorlig avføring problem siden fødselen eller barn med kronisk forstoppelse unntatt andre vanlige sykdommer er potensielle kandidater for rektal sug biopsi (RSB). Vår romanen protokollen er egnet for farging ikke bare RSBs men også full-tykkelse biopsier eller kirurgiske prøver å lage en endelig diagnose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av forskningsetikk styret ved Union Hospital of Huazhong University of Science and Technology.
1. rektal sug biopsi
- Utfør rektal sug biopsi av en godt trent pediatrisk kirurg og en assistent ved hjelp av en Rbi2 sug rektal biopsi system etter innhente informert samtykke fra verge.
- Utfør RSB på pasienter som har følgende indikasjoner: manglende evne til å passere mekonium hos spedbarn eller lang tids oppblåsthet med eller uten forstoppelse hos barna; barn med lang tids forstoppelse som trenger parafinolje for å fullføre avføring; intestinal obstruksjon eller intestinal perforering med ukjente grunner hos barn gjennomgår en entyerostomiya.
Merk: kontraindikasjoner for RSB er som følger: barn som har alvorlige symptomer, som er i dårlig fysisk tilstand, eller som ikke kan tolerant RSB; barn med akutt-trinns enterokolitt; barn gjennomgår intestinal anastomose uten fullstendig helbredelse.
- Utfør RSB på pasienter som har følgende indikasjoner: manglende evne til å passere mekonium hos spedbarn eller lang tids oppblåsthet med eller uten forstoppelse hos barna; barn med lang tids forstoppelse som trenger parafinolje for å fullføre avføring; intestinal obstruksjon eller intestinal perforering med ukjente grunner hos barn gjennomgår en entyerostomiya.
- Utfør en normal saltvann oppbevaring klyster som tarm forberedelse 36 h før prosedyren for å unngå løs avføring og overdreven ødem i slimhinnen. Tilsett magnesium sulfat løsning hvis barnet har alvorlig forstoppelse. Administrering av vitamin K (1 mg/kg) til nyfødte.
Merk: ikke utføre preoperativ blodprøver eller administrere antibiotika, som de ikke er nødvendig. - Sett pasienten i lithotomy posisjon. Coat overflaten av røret med parafin olje. Sett den butte-endte rør 4-7 cm inn i endetarmen med side hullet vendt mot bakre eller laterale vegger.
- Påfør forsiktig press på røret for å lette tilstrekkelig vedheft av side hullet til endetarmen veggen. Trykk utløseren og trekk ut verktøyet umiddelbart.
- Bruk biopsi instrumentet for å få 4 suge biopsier med en diameter på 2 mm på 3 cm og 6 cm over Dental linjen, anteriort og posteriort. Bruk en nål til å plassere prøven på gasbind fuktet med saltvann.
- Observer pasienten til 2 timer etter inngrepet for å utelukke rektal blødning. Unngå videre rektal og anal manipulasjoner i første 24 h etter RSB.
2. utarbeidelse av RSB seksjoner
- Plasser rektal suge biopsier i 4% paraformaldehyde for 6 t for å fikse vevet. Bruk et bindemiddel volum 5 ganger mer enn vevs volumet.
- Tørke vevet ved hjelp av patologisk vev dehydrator for 11 h. Hele programmert prosessen består av følgende 5 trinn:
- Plasser vevet i formaldehyd og fikse for 1 t.
- Plasser vevet i 75% etanol for 4 t.
- Plasser vevet i absolutt etanol (to endringer, 1 h hver).
- Plasser vevet i absolutt etanol (to endringer, 30 min hver).
- Plasser vevet i xylen (tre endringer, 1 time hver).
- Plasser vevet i parafinvoks (58-60 ° c) (tre endringer, 1 time hver). Bygg inn RSB-vevet i para fin blokker.
- Trim parafinblokkene ved hjelp av en mikrotomen til vevet er helt eksponert med et komplett tverrsnitt plan.
- Skjær blokkene i 0,4 μm seksjoner med en mikrotomen.
- Plasser seksjonene i 45-50 ° c vann i noen få sekunder hver for å la snittene spre seg til en flat tallerken.
- Overfør para fin delene til lysbildene.
- Stek lysbildene i en 60 ° c ovn for 3-5 h. unngå baking for lenge, noe som kan føre til tap av antigener.
- Plasser de deparaffinized lysbildene i xylen (2 endringer, 15 min hver).
- Fukt lysbildene i absolutt etanol, 95%, 80%, og 75% etanol for 5 min hver. Deretter skyll dem i omvendt osmose (RO)-renset vann for ytterligere 5 min.
3. antigen henting
- Make Working fortynninger for calretinin gjenfinning ved å blande 4 mL av EDTA antigen gjenfinning buffer med 200 mL RO-renset vann. Make Working fortynninger for S100 og PGP 9.5 henting ved å blande 1 mL sitronsyre natrium citrate buffer (100) med 99 mL av RO-renset vann.
Merk: Calretinin kan hentes fortrinnsvis av EDTA henting løsning. Men sitronsyre natrium citrate buffer er mer egnet for henting av S100 og PGP 9.5. - Plasser lysbildene i en coplin farge krukke. Fyll glasset med henting løsning og legg den i en forvarmet kokende vannbad. Etter koking i 20 minutter, Fjern glasset fra vannbadet og la det avkjøles til romtemperatur. Kjøleprosessen tar ca. 10 min. Fjern lysbildene og skyll dem forsiktig én gang med fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Tegn en sirkel med en markør penn rundt vevet og Forbered en våt boks for følgende prosedyrer.
4. blokkering
- Gjør arbeidet fortynninger ved å blande 3 mL 30% H2O2 med 27 ml ro-renset vann.
- Tilsett to eller tre dråper 3% H2O2 løsning dråpevis på vevet for å blokkere peroxidates. Legg til H2O2 -løsningen omgående for å sikre at løsningen ikke vil renne over fra sirkelen. Utfør blokkering av peroxidates i en 37 ° c inkubator i 20 min.
- Skyll lysbildene forsiktig med PBS (tre vasker, 5 min hver).
- Blokker lysbildene i 20 min ved 37 ° c med 5% serum albumin (BSA, fremstilt ved å blande 1,5 g av BSA-pulver med 30 mL RO-renset vann).
Merk: blokkering med 3% H2O2 kan forhindre 95% av uspesifisert farging og BLOKKERING med 5% BSA kan forhindre den andre 5% av uspesifisert farging. Kombiner de to metodene for å oppnå et pålitelig resultat.
5. antigen-antistoff reaksjon
- Fjern den 5% BSA og tilsett 50 μL av primær antistoff (calretinin, S100 eller PGP 9.5) i lysbildet. Ruge over natten ved 4 ° c.
- Vask lysbildet med PBS (tre ganger, 3 min hver).
- Tilsett 50 μL av polymer Enhancer (reagens A; se tabell over materialer) til seksjonen og ruge den i 20 min i en 37 ° c inkubator. Deretter vaskes lysbildet med PBS (tre ganger, 3 min hver).
- Tilsett 50 μL av sekundært antistoff B (geit anti-kanin/mus IgG sekundær antistoff) til seksjonen og ruge i 30 minutter i en 37 ° c inkubator. Vask seksjonen med PBS (tre ganger, 5 min hver).
6.3, 3-Diaminobenzidine og Hematoksylin farging
- Tilsett 850 μL av RO-renset vann til et 1,5 mL rør og tilsett farge reagensene (se tabell over materialer) i rekkefølgen a, B og C. Tilsett 50 μL av hver reagens for å få totalt 1 ml 3, 3-DIAMINOBENZIDINE (DAB) arbeids løsning. Hvis det er precipitates, bruk løsningen etter filtrering.
- Legg en dråpe DAB arbeider løsning på vevet delen og beis for 3-10 min. ruge lysbildene i DAB ved romtemperatur til brune flekker oppdages. Overvåk forsiktig med et brightfield mikroskop. Hold DAB-løsningen unna lys. Deretter vaskes lysbildet med PBS i 5 min.
- Legg en dråpe hematoksylin å counterstain kjerner i ca 1 min. Deretter holder coplin glasset og vask det under en vedlikeholdslading av vann for ca 30-40 s til overflødig fargestoff er fjernet. Vær forsiktig så du ikke skader vevs delene.
- Dypp RSB lysbilder i en coplin krukke som inneholder PBS for 25-30 s. Deretter, differensiere i 1% saltsyre-etanol for 10 s. vask lysbildene med PBS i 1 min.
- Tørke lysbildene i motsatt rekkefølge av hydration: 75%, 80%, 95%, og absolutt etanol (5 min hver).
- Utsett lysbildene for xylen (2 endringer, 5 min hver).
- Monter dekkglass ved hjelp av ultrarene montering. Tillat at lysbildene tørker før visualisering ved hjelp av et mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til sammen ble 318 pasienter innrullert i vår studie. Alle pasientene gjennomgikk RSB, og vevet ble beiset for calretinin, S100, og PGP 9.5. Diagnosen er basert på vår romanen protokollen var HD i 97 tilfeller, ikke-HD i 213 tilfeller, og mistenkt HD i 8 tilfeller. Blant de 132 kirurgiske pasientene ble 99 pasienter diagnostisert med HS ved immunostaining av prøver av full tykkelse etter operasjonen. S100 og PGP 9.5 farging viste at 92% og 93% av 99 pasienter, henholdsvis, hadde hypertrophied nerve kofferter. Den andre 83 av 186 pasientene gjennomgikk full-tykkelse biopsier og viste Ganglion celler. Totalt 103 pasienter ble klinisk kurert av konservative terapier, og HS ble ekskludert. Av de 8 pasientene med mistenkt HS ble 3 pasienter kategorisert som kort segment HD, og de øvrige 5 pasientene ble kategorisert som ikke-HD.
Ifølge våre resultater, 97 pasienter ble diagnostisert av RSB utgangspunktet. Detaljert informasjon vises i tabell 1. Protokollen av immunhistokjemiske farging for calretinin, S100, og PGP 9.5, som vi gjennomførte på RSBs, har høy følsomhet og spesifisitet priser på 96,49% (95% tillit intervall [CI], 0.88-0.99) og 100% (95% CI, 0.97-1.00), henholdsvis. Den positive prediktiv verdien er 94,3% (95% CI, 0.87-0.99), og den negative prediktiv verdien er 99,1% (95% CI, 0.95-1.00).
Figur 1a og 1B representerer typiske resultater etter immunostaining for calretinin. Mange Ganglion celler, som uttrykker calretinin, kan bli funnet i normal vev. Men ingen Ganglion celler ble oppdaget i noe område av vevet fra HD segmentet. Som vist i figur 1C-F, S100 og PGP 9.5 immunostaining viser hypertrophied nerve kofferter i submukosa, mens bare kornet farging av noen små nerve kvister ble observert i normalt innervated tarmen. I vår studie, hypertrofisk nerve stammer er nervefibre med en diameter på ≥ 40 μm.
Figur 1: Immunostaining av rektal suge biopsier for calretinin, PGP 9.5 og S100. Immunostaining for calretinin i HS-påvirket vev (A) og i Ganglion celler av myenteric plexuses i normalt innervated vev (B). Det ble ikke oppdaget calretinin flekker i myenteric plexuses av det HS-berørte segmentet. PGP 9.5 farging i HS-berørte vev viste tette hypertrofisk nervefibre i submukosa (C) i motsetning til nervefibre i normal vev (D). (E) tett og fremtredende S100 immunostaining viste hypertrofisk nerve kofferter i submukosa av HS-berørte vev. (F) normale nervefibre i submukosa. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| protein markører | HD (99) | Ikke-HD (219) | ||
| Ganglion celler (+) | Hypertrofisk nerve kofferter (+) | Ganglion celler (+) | Hypertrofisk nerve kofferter (+) | |
| calretinin | 2 | — | 214 for alle | — |
| S100 | — | 91 for alle | — | 3 |
| PGP 9.5 | — | 92 for alle | — | 4 |
Tabell 1: Immunhistokjemiske fargeresultater for de tre protein markørene i rektal suge biopsier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet en prosedyre som bruker tre forskjellige immunhistokjemiske antistoffer for å flekk RBS seksjoner for diagnostisering av HS. Følsomheten til vår diagnostiske protokoll var 96,49% (95% CI, 0.88-0.99), og spesifisitet var 100% (95% CI, 0.97-1.00).
De mest kritiske trinnene i protokollen er RSB og antigen-antistoff reaksjon. Størrelsen på biopsi bestemmer nøyaktigheten av farging. En liten biopsi vil ikke gi nok vev til å gjøre en presis diagnose, mens en stor biopsi fører til en høyere risiko for blødning. Som et spørsmål om erfaring, biopsier med en diameter på 2 mm er den optimale størrelsen. For antigen-antistoff reaksjon, kan riktig bevaring av antistoff ikke ignoreres. Etter protokollen trinn for trinn og forsiktig arbeid er nødvendig. Omvendt osmose-renset vann anbefales i alle trinn, noe som gir et klarere felt for observasjon og gjør det enklere for patologer å gjøre en nøyaktig diagnose.
Kontrast klyster, anorectal manometry, og biopsi med histologi er tre preoperativ diagnostiske metoder som har blitt brukt de siste årene. Ifølge Takawira et al. s forskning, biopsi med histologi har den høyeste følsomhet og spesifisitet8. Meier-ruge et al. First rapporterte bruk av Acetylkolinesterase (knip) flekker på frossen rektal suge vev for å diagnostisere HD i 19729. Denne farge metoden oppdager hypertrofisk nerve kofferter i submukosa. Etter denne rapporten, mange institusjoner rundt om i verden begynte å bruke denne metoden som et supplement for diagnostisering av HS. på grunn av sine diagnostiske begrensninger begynte forskerne å konsentrere seg om andre markører som også kan farge Ganglion celler og nervefibre i formalin, faste og para fin integrerte prøver. I 2004 fant Barshack et al. at tap av calretinin uttrykk kan bidra til å diagnostisere aganglioniske SEGMENTER i HD10. Kapur et al. og Guinard-Samuel et al. gjentok protokollen i 2009 og konkluderte med at immunhistokjemiske farging for calretinin var overlegen farging for acetylkolinesterase. I 1988 ble S100 immunostaining for diagnostisering av HS først introdusert av Robey et al. 13. Monforte-Muñoz et al. gjentok metoden i 1998 og fant at 90% av deres 20 Hirschsprung tilfeller hadde nervefibre bredere enn 40 μm14. Derfor kan S100 immunostaining tjene som en hjelpeutstyr diagnostisk metode i tilfeller uten Ganglion celler. Videre, Bachmann et al. bemerket det immunhistokjemiske flekk for MAP2, CALRETININ, GLUT1, og S100 kunne få en pålitelig resultere idet akkurat idet frosset avdeling teknikker15. Men i 1992, Sams et al. evaluerte verdien av PGP 9.5 i DIAGNOSTISERING av HD16. Selv S100 kan oppdage mer lamina propria nervefibre, den har en høyere falsk-negativ rate. Derfor valgte vi å bruke PGP 9.5 og S100 sammen for immunhistokjemiske diagnostisering av HS, som tidligere studier anbefalte. Mange tilfeller av farging for Nevron-spesifikke enolase i overgangsordning soner viste også positive Ganglion celler i myenteric og submucosal plexus, men disse cellene var sparsom og små12. Tilsvarende er calretinin-positive Ganglion celler små og har en gruppert formasjon. En tidligere studie indikerte at noen litt tykkere nerve stammer kan også påvises i overgangs segmentene av HS, men med total colonic aganglionosis, kan nerve stammene være innenfor normale grenser (< 40 μm)17. Vi bør analysere resultatene saken ved tilfelle og kombinere disse resultatene med kliniske manifestasjoner for å unngå feildiagnostisering.
Denne protokollen kan ikke representere den endelige patologiske diagnosen, så vi gjennomførte minst ett år med grundig klinisk oppfølging for hvert barn. I tillegg krever denne protokollen flere eksempler for å bevise sin pålitelighet.
Som konklusjon, diagnostisering av HD ved RSB er en praktisk metode som gir en ideell histologiske diagnose med akseptabel minimal skade. Følsomheten er nært beslektet med om stedet for prøvetaking er riktig. Immunhistokjemiske farging av RSB for calretinin, S100, og PGP 9.5 er følsom og spesifikk i påvisning av Ganglion celler og hypertrofisk nerve kofferter. Kombinasjonen av disse tre markørene gir en mer pålitelig diagnostisk metode for HS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Weibing tang for sin store hjelp i å gi filming Lab. Denne artikkelen er støttet av offentlig velferd Research, og spesielle midler ble mottatt fra den nasjonale helse og familieplanlegging av Kina (Grant no. 201402007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
