Summary
该方案描述了对卡莱丁、S100 蛋白和蛋白质基因产物9.5 进行免疫染色直肠抽吸活检的过程。这种新型辅助诊断方法对先天性巨结肠病具有较好的敏感性和特异性。
Abstract
先天性巨结肠病 (HD) 是一种先天性肠道疾病, 临床表现为婴儿无法通过胎粪或儿童长期便秘。直肠抽吸活检 (RSB) 测定神经节细胞的缺失和神经肥大是目前诊断亨廷顿舞蹈症最准确的方法。传统的血红素-eosin 染色缺乏敏感性和特异性。乙酰胆碱酯酶染色由于其复杂的过程, 不能被广泛使用。我们在 rsb 上进行的用于卡利丁、S100 蛋白和蛋白质基因产物 9.5 (PGP9.5) 的免疫染色新协议, 具有 96.49 (95% 置信区间、0.88-0.99) 和 100% (95% 置信度) 的高灵敏度和特异性。间隔, 分别为 0.97-1.00)。受 hd 影响的片段通常表现为缺乏卡莱丁、S100 蛋白和 PGP9.5 的表达, 而这些都是黏膜下组织中神经肥大的标志物。此协议描述了这种新诊断方法的详细操作过程。
Introduction
先天性巨结肠病 (HD) 是一种常见的先天性肠道疾病, 其特点是肠远端1的不同部分缺乏神经节细胞.胚胎神经细胞的入侵完成后, 就形成了人类肠道神经系统。如果有一个过程的干扰, 并且入侵未能完成, 新生儿的远端肠成为琼脂2。这种潜在的致命疾病被称为先天性巨结肠病。增殖、运动和肠道生长是成功殖民的三个主要组成部分。
传统的半粘膜下活检的血起毒素和 eosin (H & E) 染色不能像手术中获得的全厚度组织的 h & E 染色那样令人满意。此外, 直肠吸力组织的乙酰胆碱酯酶 (ache) 染色由于其灵敏度不足 (91%) 和冷冻切片 3, 4 的复杂处理, 在理论上具有挑战性。神经节细胞和神经纤维的其他几个免疫组织化学标志物, 可以染色的福尔马林固定和石蜡嵌入标本正在逐渐成为主流的亨廷顿舞蹈症诊断。卡莱丁素是一种维生素 d 依赖性钙结合蛋白, 不表达在肌肠内和粘膜下神经丛的 hd 影响段 5.S100 蛋白在神经冠产生的细胞中表达, 如神经纤维和胶质细胞, 这些细胞通常在 hd 影响的段的粘膜下组织中表现出神经肥大 6.蛋白质基因产品 9.5 (PGP9.5) 可靠地染色神经纤维和神经节细胞;PGP9.5 染色是对卡氏素染色的补充, 特别是在孤立的性腺功能减退症的情况下。双染色 S100 和 PGP9.5 可以降低假阴性率, 提高灵敏度。作为一个前提, 目前的研究旨在确保充分的特异性和高灵敏度的这种新的诊断方法。我们的新协议使用了所有三个标记的鉴别共济术肠和肥厚神经纤维。我们的实验室对318个儿童进行了前瞻性研究, 此前没有详细的协议7发表。本文讨论了详细的协议和注意事项。任何新生儿从出生起就患有严重的排便问题, 或患有慢性便秘的儿童, 不包括其他常见疾病, 都是直肠抽吸活检 (RSB) 的潜在候选人。我们的新方案不仅适用于动态实验室染色, 还适用于全厚度活检或手术标本的染色, 以做出最终诊断。
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Protocol
该协议得到了华中科技大学联合医院研究伦理委员会的批准。
1. 直肠穿刺活检
- 在获得监护人的知情同意后, 由训练有素的儿科外科医生和助理使用 Rbi2 抽吸直肠活检系统进行直肠穿刺活检。
- 对有以下症状的患者实施 RSB: 婴儿无法通过胎粪, 或儿童长期腹胀, 有或没有便秘;长期便秘的儿童, 需要石蜡油完成排便;患有肠造口术的儿童肠梗阻或肠穿孔, 原因不明。
注: RSB 的禁忌症如下: 有严重症状、身体状况差或不能耐受 RSB 的儿童;急性期小肠结肠炎患儿;正在接受肠道吻合的儿童, 没有完全愈合。
- 对有以下症状的患者实施 RSB: 婴儿无法通过胎粪, 或儿童长期腹胀, 有或没有便秘;长期便秘的儿童, 需要石蜡油完成排便;患有肠造口术的儿童肠梗阻或肠穿孔, 原因不明。
- 在手术前36小时进行正常的生理盐水保留灌肠, 以避免大便松动和粘膜过度水肿。如果孩子有严重便秘, 请加入硫酸镁溶液。对新生儿使用维生素 K (1 mg/kg)。
注: 不要进行术前血液检查或使用抗生素, 因为它们是不需要的。 - 把病人放在取石器的位置。在管表面涂上石蜡油。将钝管4-7 厘米插入直肠, 侧孔面向后壁或外侧壁。
- 在管上施加温和的压力, 以促进侧孔与直肠壁的充分粘附。按下扳机并立即取出工具。
- 使用活检仪获得4个吸力活检, 直径为2毫米, 在牙线上方3厘米, 6 厘米以上, 前后。使用针头将标本放在用盐水润湿的纱布上。
- 观察患者, 直到手术后 2小时, 以排除直肠出血。避免在 RSB 后的前24小时内进一步的直肠和肛门操作。
2. RSB 部分的编写
- 将直肠吸吮活检在4% 的甲醛中放置 6小时, 以固定组织。使用固定体积是组织体积的5倍。
- 使用病理组织脱水剂使组织脱水11小时。整个编程过程包括以下5个步骤:
- 将组织放入甲醛中, 固定1小时。
- 将组织放入75% 乙醇中4小时。
- 将组织放入绝对乙醇 (两个变化, 每个变化 1小时)。
- 将组织放入绝对乙醇 (两个变化, 每个变化 30分钟)。
- 将组织置于二甲苯中 (三个变化, 每个变化 1小时)。
- 将组织放入石蜡 (58-60°c) (三次变化, 每次 1小时)。将 RSB 组织嵌入石蜡块中。
- 用微孔修剪石蜡块, 直到组织完全暴露在一个完整的截面平面上。
- 用微孔将块切割成0.4 微米的部分。
- 将部分放入45-50 的水中, 每片几秒钟, 使部分扩散到平板上。
- 将石蜡部分传输到幻灯片上。
- 将幻灯片在60°c 的烤箱中烘烤3-5 小时, 避免烘焙太久, 这可能会导致抗原的丢失。
- 将幻灯片放入二甲苯中 (2个变化, 每次 15分钟)。
- 将幻灯片在绝对乙醇、95%、80% 和75% 乙醇中进行一次, 每次5分钟。然后, 在反渗透 (RO) 纯净水中冲洗5分钟。
3. 抗原回收
- 将 EDTA 抗原回收缓冲液的4毫升与200毫升的 r-净化水混合, 进行钙蛋白回收的工作稀释。将柠檬酸柠檬酸钠缓冲液 (100x) 1 毫升与99毫升的 RO-A纯化水混合, 对 S100 和 PGP9.5 的回收进行工作稀释。
注: 卡尔雷丁可以通过 EDTA 检索解决方案优先检索。然而, 柠檬酸柠檬酸钠的柠檬酸钠缓冲液更适合于检索 S100 和 PGP9.5。 - 将幻灯片放入可切片染色罐中。将罐子灌满回收液, 放入预热的沸水浴中。煮沸20分钟后, 将罐子从水浴中取出, 冷却至室温。冷却过程大约需要 10分钟, 取出幻灯片, 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 轻轻冲洗一次。
- 用标记笔在纸巾周围画一个圆圈, 并准备一个湿箱, 以便进行以下操作。
4. 阻塞
- 将 30% h2o2 的3毫升与 ro-a纯化的 27毫升混合, 进行工作稀释。
- 在组织上滴入两滴或三滴 3% h2o2 溶液, 以阻断过氧化物.及时添加 H2o2 解决方案, 以确保解决方案不会从圆圈溢出.在37°c 的孵化器中对过氧化物进行堵塞20分钟。
- 用 PBS 轻轻冲洗幻灯片 (每次洗三次, 每次洗 5分钟)。
- 在37°c 下用5% 的牛血清白蛋白 (BSA, 将1.5 克 BSA 粉末与30毫升的 Ro-p来说的水混合制备) 将幻灯片块20分钟。
注: 用 3% h2o2染色可以防止95% 的非特异性染色, 用 5% bsa 阻塞可以防止其余5% 的非特异性染色。将这两种方法结合起来, 获得可靠的结果。
5. 抗原抗体反应
- 取出 5% BSA, 并在幻灯片中添加50μl 的原代抗体 (卡莱丁、S100 或 PGP9.5)。在4°C 下过夜。
- 用 PBS 清洗幻灯片 (三次, 每次 3分钟)。
- 在该部分添加50Μl 聚合物增强剂 (试剂 A; 见材料表), 并在37°c 孵化器中孵育20分钟。然后, 用 PBS 清洗幻灯片 (三次, 每次 3分钟)。
- 在切片中加入50μl 的二级抗体 B (山羊抗兔子小鼠 IgG 二级抗体), 并在37°c 孵化器中孵育30分钟。用 PBS 清洗部分 (三次, 每次 5分钟)。
6. 3、3-二氨基苯并吡啶和半甲氧基染色
- 在 1.5 mL 管中加入850Μl 的 RO-purified 水, 并按 a、B 和 C 的顺序添加染色试剂 (见材料表), 每种试剂加入 50Μl, 以获得 3, 3-二胺 (dab) 的工作溶液, 总共为1毫升。如果有沉淀物, 过滤后使用溶液。
- 在组织部分加入一滴 DAB 工作溶液, 并在室温下在 DAB 中加染 3-10, 直到检测到棕色染色。使用明亮场显微镜仔细监测。使 DAB 工作解决方案远离光线。然后, 用 PBS 清洗幻灯片5分钟。
- 加入一滴血红素, 以对抗细胞核约1分钟。然后, 拿着椰子罐, 在一滴水下清洗大约 30-40秒, 直到多余的染料被去除。注意不要损坏组织部分。
- 将 RSB 幻灯片浸入含有 PBS 的共装罐中25-30。然后, 在1% 盐酸乙醇中进行分化, 用 PBS 清洗滑块1分钟。
- 按水合作用的相反顺序脱水幻灯片: 75%、80%、95% 和绝对乙醇 (各 5分钟)。
- 将幻灯片曝光至二甲苯 (2次更改, 每次 5分钟)。
- 使用超薄安装安装盖板。在使用显微镜进行可视化之前, 请让幻灯片干燥。
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Representative Results
共有318名患者参加了我们的研究。所有患者均接受 RSB 治疗, 并对组织进行了卡瑞丁、S100 和 PGP9.5 的染色。基于我们的新协议的诊断是 HD 97 例, 非 hd 213 例, 疑似 HD 8 例。在132例手术患者中, 99 例经手术后对全厚度标本进行免疫染色, 诊断为亨廷顿舞蹈症。S100 和 PGP9.5 显示, 在99例患者中, 92% 和93% 的患者分别有神经干肥大。186名患者中, 其余83例接受了全厚度活检, 并显示了神经节细胞。共有103例患者经保守治疗临床治愈, HD 被排除在外。在8例疑似亨廷顿舞蹈症患者中, 3 例被归类为短段亨廷顿舞蹈症, 其余5例被归类为非 hd。
根据我们的研究结果, 97名患者最初被 RSB 诊断出来。详细信息如表 1所示。我们在 Rsb 上进行的卡莱丁、S100 和 PGP9.5 的免疫组化染色程序具有较高的灵敏度和特异性, 分别为 99.49% (95% 置信区间 [ci]、0.88-0.99) 和 100% (95% CI, 0.88-1.00)。阳性预测值为 94.3% (95% CI, 0.87-0.87), 阴性预测值为 99.1% (95% CI, 0.95-1.00)。
图 1 a和1 b 代表了卡瑞清素免疫染色后的典型结果。许多神经节细胞, 表达卡雷丁, 可以在正常的组织中找到。然而, 没有检测到神经节细胞在组织的任何区域从 HD 段。如图 1C-f、s100 和 PGP9.5 免疫染色显示粘膜下层神经干过度, 而在正常神经支配的肠道中只观察到一些小神经小枝的颗粒染色。在我们的研究中, 肥厚的神经干是直径≥40μm 的神经纤维。
图 1: 直肠吸血活检对钙蛋白、PGP9.5 和 S100 的免疫染色.热蛋白受 hd 影响的组织 (a) 和正常神经支配组织 (b) 肠内神经丛神经节细胞中的钙定值的免疫染色。在 hd 影响段的肠系膜丛中未检测到卡氏素染色。在受 hd 影响的组织中, PGP9.5 染色显示, 粘膜下层 (c) 存在致密的肥厚神经纤维, 而正常组织中的神经纤维 (d) 则为不同。(E) 密集和突出的 s100 免疫染色显示肥厚的神经干在黏膜下的 hd 影响的组织。(F) 粘膜下层正常的神经纤维。请点击这里查看此图的较大版本.
| 蛋白质标记 | HD(99) | 非 HD(219) | ||
| 神经节细胞 (+) | 肥厚性神经干 (+) | 神经节细胞 (+) | 肥厚性神经干 (+) | |
| 卡列丁 | 2 | — | 214 | — |
| S100 | — | 91 | — | 3个 |
| PGP9。5 | — | 92 | — | 4个 |
表 1: 直肠吸血活检中三种蛋白标记物的免疫组织化学染色评分。
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Discussion
在这里, 我们描述了一个程序, 使用三种不同的免疫组织化学抗体染色 RBS 部分诊断亨廷顿舞蹈症。我们的诊断方案的敏感性为 99.49% (95% CI, 0.88-0.99), 特异性为 100% (95% CI, 0.88-1.00)。
该协议最关键的步骤是 RSB 和抗原抗体反应。活检的大小决定了染色的准确性。小活检不会提供足够的组织来做出准确的诊断, 而大的活检会导致更高的出血风险。根据经验, 直径为2毫米的活检是最佳尺寸。对于抗原抗体反应, 不能忽视抗体的适当保存。按照协议一步一步, 轻轻工作是必要的。在所有步骤中都建议使用反渗透净化的水, 从而获得更清晰的观察视野, 并使病理学家更容易做出准确的诊断。
对比灌肠、肛门直肠测压和组织学活检是近年来使用的三种术前诊断方法。据 Takawira等人说.其研究表明, 组织学活检具有最高的敏感性和特异性8。Meier-Ruge等人首次报告了 1972年9年在冷冻直肠吸入组织上使用乙酰胆碱酯酶 (ache) 染色的情况, 以帮助诊断亨廷顿舞蹈症。这种染色方法检测粘膜下层的肥厚性神经干。在这份报告之后, 世界各地的许多机构开始使用这种方法作为诊断亨廷顿舞蹈症的辅助手段, 由于其诊断的局限性, 研究人员开始专注于其他标记, 这些标记也可以染色神经节细胞和神经纤维。福尔马林固定和石蜡包埋标本。2004年, Barshack等人发现, calretinin 表达的丧失可能有助于诊断 hd10中的琼脂段。Kapur等人和 guinard-samuel 等人在2009年重申了该协议, 并得出结论认为, 对 calretinin 的免疫组织化学染色优于乙酰胆碱酯酶11,12的染色。1988年, Robey 等人首次介绍了用于诊断亨廷顿舞蹈症的 S100 免疫染色.13. Monforte-Muñoz等人在1998年重复了这一方法, 发现他们的 20个 hirschsprung 病例中有90% 的神经纤维大于40微米14。因此, S100 免疫染色可作为一种辅助诊断方法, 在没有神经节细胞的情况下。此外, Bachmann等人注意到, MAP2、calretinin、Glut1 和 s100 的免疫组化染色可以获得与冷冻切片技术15一样准确的可靠结果。然而, 1992年, Sams等人评估了 PGP9.5 在诊断 hd16方面的价值。虽然 S100 可以检测到更多的固有神经纤维, 但它有更高的假阴性率。因此, 我们选择使用 PGP9.5 和 S100 一起诊断亨廷顿舞蹈症, 正如以前的研究所建议的。过渡区神经元特异性烯醇酶染色病例在肠系膜和粘膜下神经丛中也显示神经节细胞呈阳性, 但这些细胞稀疏和小12。同样, 卡利视宁阳性神经节细胞较小, 并有聚集形成。先前的一项研究表明, 一些轻微增厚的神经干也可以检测到在 HD 的过渡段, 但与总结肠性共济会病, 神经干可能在正常范围内 (< 40μm)17。我们应该分析结果的情况下, 并结合这些结果与临床表现, 以避免误诊。
该方案不能代表最终的病理诊断, 因此我们对每个孩子进行了至少一年的彻底临床随访。此外, 此协议需要更多的样本来证明其可靠性。
总之, RSB 对 HD 的诊断是一种简便的方法, 它提供了一种理想的组织学诊断方法, 可接受最小损伤。灵敏度与采样地点是否正确密切相关。RSB 对卡氏素、S100 和 PGP9.5 的免疫组化染色在神经节细胞和肥厚神经干的检测中具有敏感性和特异性。这三个标记的组合为 HD 提供了更可靠的诊断方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢唐伟兵在提供拍摄实验室方面的巨大帮助。本文得到了公共福利研究的支持, 并从中国国家卫生和计划生育组织获得了特别资金 (赠款号 20140: 2007)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
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