Summary

Isolement et caractérisation des humains provenant du cordon ombilical cellules souches mésenchymateuses de prématurés et les nouveau-nés à terme

Published: January 26, 2019
doi:

Summary

Cordon ombilical humain (UC) peuvent être obtenu au cours de la période périnatale à la suite de terme prématuré et postterm de livraison. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC dérivées de cellules souches mésenchymateuses (UC-MSCs) du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.

Abstract

Cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont un potentiel thérapeutique considérable et susciter un intérêt croissant dans le domaine biomédical. MSCs sont initialement isolés et caractérisés de la moelle osseuse (BM), puis acquis de tissus, y compris le tissu adipeux, membrane synoviale, peau, pulpe dentaire et appendices fœtales comme le placenta, cordon ombilical (UCB) et du cordon ombilical (UC). MSCs sont une population hétérogène de cellules ayant la capacité (1) l’adhérence sur plastique dans des conditions de culture standard, expression du marqueur (2) surface de CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34/CD14 /CD19 Phénotypes /HLA-DR et (3) trilineage différenciation en adipocytes et ostéocytes chondrocytes, tel qu’il est définis par la société internationale pour la thérapie cellulaire (ISCT). Bien que BM est la source plus largement utilisée de MSCs, le caractère invasif d’aspiration BM limite éthiquement son accessibilité. Capacité de prolifération et la différenciation de MSCs provenant de la BM en général diminuent avec l’âge du donateur. En revanche, MSCs fœtales obtenues UC possèdent des avantages tels que la prolifération vigoureuse et capacité de différenciation. Il n’y a aucun souci éthique pour l’échantillonnage de l’UC, car elle est généralement considérée comme les déchets médicaux. UC humaine commence à se développer avec la croissance de la cavité amniotique à 4-8 semaines d’âge gestationnel continue et continue de croître jusqu’à atteindre 50 à 60 cm de longueur, et il peut être isolé pendant le délai de livraison tout nouveau-né. Pour mieux comprendre la physiopathologie des maladies incurables, nous avons utilisé des dérivés UC MSCs (UC-MSCs) de nourrissons livrés à divers âges gestationnels. Dans ce protocole, nous décrivons l’isolement et la caractérisation des UC-MSCs du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.

Introduction

Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont initialement isolés et caractérisé de la moelle osseuse (BM)1,2 mais peut également être obtenues d’une grande variété de tissus, y compris le tissu adipeux, membrane synoviale, peau, pulpe dentaire et appendices foetales 3. MSCs sont reconnus comme une population de cellules hétérogènes qui peut proliférer et se différencier en adipocytes et ostéocytes chondrocytes. En outre, MSCs possèdent la capacité de migrer vers des sites de blessures, de réprimer et de moduler les réponses immunitaires et remodeler et de réparer la blessure. Actuellement, MSCs provenant de différentes sources ont suscité un intérêt croissant comme source pour la thérapie cellulaire contre un certain nombre de maladies incurables, dont graft – versus – host disease, infarctus du myocarde et infarctus cérébral4,5 .

Bien que BM est la source plus bien caractérisée de MSCs, l’empiétement que constitue l’aspiration BM limite éthiquement son accessibilité. Capacité de prolifération et la différenciation de MSCs provenant de la BM en général diminuent avec l’âge du donateur. En revanche, MSCs foetales provenant de foetus appendices comme le placenta, le sang de cordon ombilical (UCB), et du cordon ombilical (UC) ont des avantages, y compris des préoccupations moins éthiques concernant l’échantillonnage et robuste de la prolifération et la différenciation capacité6 , 7. parmi foetales appendices qui sont habituellement mis au rebut comme déchets médicaux, UCB et UC sont considérés comme un organe fœtal, tandis que le placenta est considéré comme des pathologies. En outre, placenta et UCB doivent être échantillonnés et collectées au moment de la livraison de nouveaux-nés, alors que le placenta et l’UC peuvent être collectées et traitées après la livraison de nouveaux-nés. En conséquence, l’UC est une source prometteuse de MSC pour cell therapy8,9.

UC humaine commence à se développer avec l’expansion progressive de la cavité amniotique à 4-8 semaines de gestation, ne cesse de croître jusqu’à 50-60 cm de longueur et peut être isolé pendant toute la durée de livraison nouveau-né10. Pour mieux comprendre la physiopathologie des maladies incurables, nous utilisons des dérivés UC MSCs (UC-MSCs) de nourrissons livrés à divers âges gestationnels11,12. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler et caractériser des UC-MSCs du foetus/nourrissons à 19 à 40 semaines de gestation.

Protocol

L’utilisation d’échantillons humains pour cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de Kobe University Graduate School of Medicine (agrément n° 1370 et 1694) et conformes aux principes directeurs adoptés. 1. isolement et Culture des UC-MSCs Remarque : UC-MSCs ont été correctement isolées, cultivées, et élargie (plus de numéro de passage 4) de plus de 200 UCs soumis au présent protocole. Parmi plus de 200 UCs, 100 % on…

Representative Results

Les procédures de collecte de l’UC à la culture MSC sont résumées dans la Figure 1. UC d’environ 5-10 cm de longueur peut être prélevé sur tous les nouveaux-nés par césarienne. UC commence à se développer à 4-8 semaines de gestation et ne cesse de croître jusqu’à 50-60 cm de longueur, comme illustré à la Figure 2. Il existe deux artères (A), une veine (V), doublure de cordon (CL) et gelée de Wharton (WJ) en …

Discussion

MSCs peuvent être isolés dans une variété de tissus et sont une population hétérogène de cellules qui font express pas tous les mêmes marqueurs phénotypiques. Ici, nous avons décrit un protocole qui les guides de la collection et la dissection des UC de nouveau-nés prématurés et à terme et permet l’isolement et la culture de UC-MSCs. Suite à ce protocole, nous avons isolé avec succès UC-MSCs qui remplissent les critères ISCT19 de foetus/les enfants livrés à 19 à 40 semaines …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions pour Scientific Research (C) (numéro de licence : 25461644) et de jeunes scientifiques (B) (accorder des numéros : 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) de JSPS KAKENHI.

Materials

50mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).

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Cite This Article
Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

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