Summary

Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff

Published: January 26, 2019
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Summary

Menschlichen Nabelschnur (UC) erhalten Sie während der Perinatalperiode durch Frühgeburt, Begriff und postterm Lieferung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-mesenchymale Stammzellen (UC-MSCs) von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

Abstract

Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) haben erhebliches therapeutische Potenzial und zunehmendes Interesse im Bereich Biomedizin zu gewinnen. MSCs sind ursprünglich isoliert und charakterisiert, die aus dem Knochenmark (BM), dann gewonnenen Gewebe, wie Fettgewebe, Synovialis, Haut, Zahnpulpa und fetalen Anhängseln wie Plazenta, Nabelschnurblut (UCB) und Nabelschnur (UC). MSCs sind eine heterogene Zellpopulation mit einer Kapazität für (1) die Einhaltung Kunststoff in standard Kulturbedingungen, (2) Oberfläche Marker Ausdruck CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34/CD14/CD19 /HLA-DR Phänotypen, und (3) Trilineage Differenzierung in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten, wie Sie derzeit von der internationalen Gesellschaft für zelluläre Therapie (ISCT) definiert. Obwohl BM die am weitesten verbreitete Quelle der MSCs ist, schränkt die invasive Art des Strebens BM ethisch seiner Zugänglichkeit. Proliferation und Differenzierung Kapazität von MSCs von BM erhalten in der Regel nimmt mit dem Alter des Spenders. Im Gegensatz dazu haben fetalen MSCs UC gewonnenen Vorteile wie kräftige Proliferation und Differenzierung Kapazität. Da es in der Regel als medizinische Abfälle gilt, gibt es keine ethischen Bedenken für UC Probenahme. Menschlichen UC mit anhaltenden Wachstum des Fruchtwassers Hohlraums bei 4 bis 8 Wochen der Schwangerschaft zu entwickeln beginnt und hält bis zu 50-60 cm in der Länge wachsen, und es kann während der gesamten Neugeborenen Lieferzeit isoliert werden. Um einen Einblick in die Pathophysiologie der hartnäckigen Krankheiten, haben wir UC abgeleitet MSCs (UC-MSCs) vom Säugling geliefert in verschiedenen gestational Alter verwendet. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-MSCs aus Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

Introduction

Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind ursprünglich isoliert und charakterisiert aus dem Knochenmark (BM)1,2 aber erhalten Sie auch bei einer Vielzahl von Geweben einschließlich Fettgewebe, Synovialis, Haut, Zahnpulpa und fetalen Anhängsel 3. MSCs sind anerkannt als eine heterogene Zellpopulation, die sich vermehren und in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten differenzieren kann. Darüber hinaus MSCs besitzen die Fähigkeit, migrieren auf Seiten der Verletzung, zu unterdrücken und zu modulieren, Immunantworten, umgestalten und Verletzungen zu reparieren. MSCs aus verschiedenen Quellen haben derzeit wachsendes Interesse als Quelle für die Zelltherapie gegen eine Reihe von hartnäckigen Krankheiten, einschließlich Graft – Versus – Host-Seuche, Myokardinfarkt und Hirninfarkt4,5 angezogen .

Obwohl BM die meisten gut-gekennzeichneten Quelle der MSCs ist, schränkt die Invasivität der BM Aspiration ethisch seiner Zugänglichkeit. Proliferation und Differenzierung Kapazität von MSCs von BM erhalten in der Regel nimmt mit dem Alter des Spenders. Im Gegensatz dazu fetalen MSCs aus fetalen Anhängseln wie Plazenta und Nabelschnurblut (UCB), und Nabelschnur (UC) haben Vorteile, einschließlich weniger ethische Bedenken hinsichtlich Probenahme und robuste Proliferation und Differenzierung Kapazität6 , 7. unter fetalen Anhängsel, die in der Regel als medizinischer Abfall entsorgt werden, UCB und UC sind als eine fetale Orgel, während Plazenta Fetomaternal gilt. Darüber hinaus müssen Plazenta und UCB abgetastet und auf den genauen Zeitpunkt der Neugeborenen Lieferung erhoben, während Plazenta und UC gesammelt und nach der Neugeborenen Lieferung verarbeitet werden kann. UC ist eine vielversprechende MSC-Quelle für Zelle Therapie8,9.

Menschlichen UC mit fortschreitenden Ausbau der Fruchtblase Hohlraum 4-8 Wochen der Schwangerschaft zu entwickeln beginnt, wächst weiter bis 50-60 cm in der Länge und kann während der gesamten Laufzeit des Neugeborenen Lieferung10isoliert werden. Um einen Einblick in die Pathophysiologie der hartnäckigen Krankheiten, verwenden wir UC abgeleitet MSCs (UC-MSCs) vom Säugling bei verschiedenen gestational Alter11,12geliefert. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zu isolieren und zu charakterisieren UC-MSCs aus Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

Protocol

Die Verwendung von humanen Proben für diese Studie wurde von der Ethikkommission der Kobe University Graduate School of Medicine (Zulassungs-Nr. 1370 und 1694) genehmigt und im Einklang mit den genehmigten Richtlinien. 1. Isolierung und Kultur der UC-MSCs Hinweis: UC-MSCs wurden erfolgreich isoliert, kultiviert, und erweitert (mehr als Durchgangsnummer 4) von mehr als 200 BKS ausgesetzt zu diesem Protokoll. Unter mehr als 200 BKS, 100 % haben gezeigt…

Representative Results

Die Verfahren von UC Sammlung MSC Kultur sind in Abbildung 1zusammengefasst. UC von ca. 5-10 cm Länge kann alle Neugeborenen geliefert per Kaiserschnitt abgeholt werden. UC beginnt bei 4 bis 8 Wochen der Schwangerschaft entwickeln und wächst weiter bis 50-60 cm in der Länge, wie in Abbildung 2dargestellt. Es gibt zwei Arterien (A), eine Vene (V), Kabel-Futter (CL) und Wharton Gelee (WJ) in UC, wie in Abbil…

Discussion

MSCs können aus einer Vielzahl von Geweben isoliert und sind heterogene Bevölkerung der Zellen, die nicht alle Express derselben phänotypischer Marker tun. Wir beschrieben hier, eine Protokoll, die leitet die Sammlung und sezieren von UC von Frühgeborenen und Begriff Säuglingen und Isolation und Kultur der UC-MSCs ermöglicht. Nach diesem Protokoll haben wir erfolgreich UC-MSCs isoliert, die erfüllen die ISCT Kriterien19 von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft geliefert un…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid für Scientific Research (C) (Gewährungsnummer: 25461644) und junge Wissenschaftler (B) (Nummern zu gewähren: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) von JSPS KAKENHI.

Materials

50mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

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Cite This Article
Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

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