Summary
여기, 우리는 프로토콜 nucleosome 정적 및 시간 경과 원자 힘 현미경 (AFM) 이미징 기술을 사용 하 여 단일 분자 수준에서 입자의 특성을 제시. 설명 된 표면 기능화 방법 구조의 캡처 및에 nucleosomes의 역학에 대 한 수는 nanoscale에 고해상도.
Abstract
nucleosome subunits의 긴 사슬, chromatin DNA 복제 그리고 녹음을 진 핵 세포 에서도 이러한 중요 프로세스에 대 한 수 동적 시스템입니다. Nucleosomes의 역학 복제 및 전사 기계에 의해 DNA에 액세스를 제공 하 고 비판적으로 기본 chromatin 기능 분자 메커니즘에 기여. 단일 분자 연구 원자 힘 현미경 (AFM) 같은 이미징 nucleosome 구조 역학의 역할의 우리의 현재 이해에 크게 기여 했다. 현재 프로토콜 고해상도 AFM 이미징 기술을 공부 nucleosomes의 구조와 동적 속성을 사용 하는 단계를 설명 합니다. 프로토콜은 H3 히스톤의 대응 centromere 단백질 (CENP A)으로 대체 됩니다 centromere nucleosomes에 대 한 AFM 데이터 표시 되어 있습니다. 프로토콜의 모노 nucleosomes 연속 희석 방법을 사용 하 여 어셈블리와 함께 시작 합니다. 기능성된 nucleosome 이미징에 사용 되는 aminopropyl silatrane (APS-운 모)와 운 모 기판의 준비 nucleosomes 설명의 AFM 시각화에 대 한 중요 한 이며 기판 준비 하는 절차를 제공 합니다. Nucleosomes APS-운 모 표면에 입금 됩니다 먼저 nucleosome 인구의 스냅샷을 캡처 정적 AFM을 사용 하 여 몇 군데. 이러한 이미지의 분석에서 DNA는 nucleosomes 감싸의 크기 같은 매개 변수 측정 될 수 있다 고이 과정은 또한 상세. 액체의 절차 이미징 시간 경과 AFM 몇 프레임을 캡처할 수 있는 고속 저속 AFM에 대 한 설명의 초당 nucleosome 역학. 마지막으로, 동적 프로세스의 정량적 특성을 사용 하는 nucleosome 역학 분석 설명 이며 그림.
Introduction
진 핵 세포에서 DNA는 매우 압축 하 고 염색체에 조직. 1 염색체 내 DNA 조직의 첫 번째 수준은 147에서 nucleosomes의 어셈블리는 DNA의 혈압은 단단히 히스톤 octamer 코어 주위에 싸여. 2 , 3 높은 소형 염색체 단위 형성 될 때까지 다음 구성 하는 chromatin 배열을 형성 하는 긴 DNA 분자에 nucleosome 입자 조립. 4 chromatin의 해체를 DNA 유전자 전사 및 게놈 복제와 같은 중요 한 세포질 과정에 필요한 제안 하는 chromatin는 매우 동적 시스템을 무료로 액세스를 제공 합니다. 5 , 6 , 7 elucidating 어디 실수 세포 죽음 또는 암과 같은 질병의 발전으로 이어질 수 있습니다 분자 수준에 유전 과정에 대 한 중요성은 다양 한 염색 질 수준에서 DNA의 동적 속성을 이해. 8 매우 중요 chromatin 속성은 nucleosomes의 역학. 9 , 10 , 11 , 12 이 입자의 높은 안정성 구조적 특성에 대 한 결정학 기술을 허용 했다. 2 어떤 이러한 연구 부족은 DNA의 메커니즘 등 nucleosomes의 동적 내용을 풀기 히스톤 코어;에서 동적 경로 녹음 방송 및 복제 프로세스에 대 한 필요 합니다. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 또한, 개장 요소 라고 하는 특별 한 단백질을 보여왔다 nucleosomal 입자17;의 분해를 촉진 그러나, nucleosomes의 기본 역학 전체 분해 과정에 기여 하는이 과정에서 중요 한 요소 이다. 14 , 16 , 18 , 19
단일 분자 형광19,,2021, 광학 트래핑 (핀셋)13,18,,2223 AFM 등 단일-분자 기법 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 nucleosomes의 역학을 이해 하는 수단이 되었습니다. 이러한 방법 중에서 AFM는 몇 가지 독특하고 매력적인 기능에서 혜택. AFM는 시각화 하 고 개별 nucleosomes 뿐만 아니라 더 긴 배열27특징 하나를 수 있습니다. AFM 이미지에서 nucleosome 구조 DNA는 히스톤 코어 주위에 싸여의 길이 등의 중요 한 특성 측정된 10,14,,2628; 수 있습니다. 매개 변수는 nucleosome unwrapping 역학의 특성화 중심입니다. AFM 과거 연구 매우 동적 시스템 및 DNA 수 히스톤 코어14에서 자발적으로 풀 다 nucleosomes를 계시 했다. Nucleosomes에서 DNA의 자발적인 풀기 AFM는 이미징 수성 솔루션 14,,2629끝나면 시간 경과 모드로 작동 하 여 직접 시각화 했다.
저속 고속 AFM (HS-AFM) 계측의 출현 밀리초 시간 단위 14,,1524nucleosome unwrapping 프로세스를 시각화 하 가능 하 게. Centromere 특정 nucleosomes의 최근 HS AFM 16,30 연구 정식 형식에 비해 nucleosomes의 여러 가지 새로운 기능을 공개 했다. Centromere nucleosomes는 centromere, 염색체 분리31에 대 한 비판적으로 중요 한 염색체의 작은 부분을의 구성 한다. 대량 chromatin에서 정식 nucleosomes 달리 centromere nucleosomes의 히스톤 코어 히스톤 H332,33대신 CENP A 히스톤을 포함합니다. 이 히스톤 대체 centromere nucleosomes 줄 바꿈 DNA는 ~ 120 ~ 147 대신 bp bp 정식 nucleosomes;에 대 한 centromere 정식 nucleosomes의 명료한 형태학으로 이어질 수 있는 차이34, 그 centromere chromatin 겪 습 하나 부피에 비해 높은 역학 제안 배열입니다. Centromere nucleosomes HS AFM16,30 연구에 의해 표시 하는 새로운 역학 예증 기회가 단일 분자 기술에 의해 제공의 구조와 동적 속성을 직접 시각화 nucleosomes입니다. 이러한 기능의 예로 간단히 논의 하 합니다 종이의 끝에 그림. 이 진행 nucleosomes의 AFM 이미지 뿐만 아니라 기존 방법의 수정에 대 한 새로운 프로토콜의 개발으로 인해 되었다. 여기에 설명 된 프로토콜의 목표 chromatin 조사에서 이러한 기법을 활용 하고자 하는 사람에 게 액세스할 수 있는 단일 분자 AFM nucleosome 연구에 이러한 흥미로운 진보를 만드는 것입니다. 많은 설명 넘어 nucleosomes의 연구 문제에 적용 되며 다른 단백질 및 DNA 시스템 관심의 수사를 위해 사용할 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램의 몇 가지 예는 간행물35,36,,3738,39,40,41에서 찾을 수 있습니다. 42,43,44,45,,4647,48,49 과 AFM 연구의 전망 다양 한 바이오 시스템 주어진29,50,51,,5354리뷰.
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Protocol
1. 연속 희석 모노 nucleosomes의 어셈블리
- 생성 하 고는 오프 중심으로 Widom 601 nucleosome 시퀀스 위치를 포함 하는 약 400 bp DNA 기질을 정화. 55
참고: 제한 하려면 디 nucleosomes의 원치 않는 형성, 각 '팔' 측면에 서는 위치 시퀀스 초과 해서는 안됩니다 ~ 150 혈압.- 플라스 미드 pGEM3Z-601 설계 된 프라이 머를 함께 사용 하 고 PCR를 사용 하 여 기판 DNA를 증폭. 앞으로 122 및 154 bp 팔 길이 여기 사용 423 bp 기판 사용 (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3')와 역 (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') 뇌관.
- 튜브 열 cycler는 반응 혼합물을 포함 하는 95 ° c.에 preheated 추가 95 ° C, 30 s 49 ° C에서 열 처리, 72 ° c.에 35 s 확장에서 95 ° c: 30의 변성에서 5 분에 대 한 초기 변성 후 33 주기 위해 다음 프로그램을 실행 33 주기를 다음 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장을 설정 합니다.
- 상업적으로 이용 가능한 PCR 정화 키트를 사용 하 여 PCR 혼합물에서 DNA를 정화. PCR 정리 열에서 DNA를 방출, 10 mM Tris 버퍼 (pH 7.5) 차입 버퍼를 제공 하는 키트를 대신 사용 합니다.
참고: 정화 단계 간의 버퍼 전송 않기로 여분의 주의. 오염 된 eluent 문제가 발생할 수 있습니다 다운스트림 DNA 농도 측정을 울리거나 nucleosome 어셈블리 혼합물의 시작 소금 농도 변경할 수 있습니다.
- 260에 순화 된 DNA의 흡 광도 측정 하 여 DNA 농도 결정 nm.
- 만 10 mM Tris pH 7.5 차입 버퍼를 사용 하 여 UV 힘 분 광 광도에 빈을 수집 합니다. 순화 된 DNA의 측정을 수집 합니다.
- 농도 결정, 0.6 mL microfuge 관으로 순화 된 DNA의 aliquot 25 pmol 고에 진공 원심 분리기까지 솔루션은 겨우 볼 수; 이것은 일반적으로 1 시간 30 분 이다.
참고: DNA 기판은 이제 nucleosome 어셈블리에 대 한 준비. 그렇지 않으면, 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 고 DNA까지 사용-20 ° C에 저장. - 장소 microfuge 관 25 pmol 얼음에 DNA를 포함 하 고 순서 대로 표 1, nucleosome 어셈블리 구성 요소를 추가 합니다. 모든 구성 요소에 추가 하면 얼음에서 혼합물을 분리 하 고 30 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어.
참고: 그것은 중요 한 재고 히스톤 버퍼의 소금 콘텐츠 때 2 분 최종 농도 달성 하는 데는 NaCl를 계산으로 간주 됩니다. 15 , 56 - 200mm 연속 속도 희석을 사용 하 여 혼합물의 2 M 소금 농도 감소 시켜는 nucleosomes를 조립. 57
- 10 mM Tris pH 7.5를 포함 하는 희석 버퍼의 100 µ L를 주사기를 주사기 펌프에 그것을 배치.
- 직접 microfuge 관의 모자에 미리 구멍이 구멍을 통해 주사기의 바늘, 접촉을 보장 어셈블리 혼합물 (그림 1)와 함께 이루어집니다.
- 120 분 0.75 µ L/min의 속도로 주사기 펌프를 실행 합니다.
참고: 결과 100 µ L 솔루션 250 nM nucleosomes 및 200 m m NaCl 포함합니다. - 10 K MWCO 투 버튼에 혼합물을 전송 하 고 200ml 4 ° c.에서 1 시간 10 mM Tris pH 7.5, 0.25 m m EDTA와 2.5 m m NaCl를 포함 하는 미리 냉장된 (4 ° C) 낮은 소금 버퍼에 대 한 dialyze
- Nucleosome 어셈블리의 히스톤 콘텐츠를 평가 하는 분리 15%와 6% 앞에서 설명한30스태킹 불연속 SDS 페이지 젤을 준비 합니다.
- Aliquot는 nucleosome의 10-20 µ L microfuge 관을 재고 하 고 1-2 x의 작업 농도를 Laemmli 샘플 버퍼 x 4를 추가 합니다. 58
- 컨트롤, 히스톤의 1-2 µ g에 대 한 별도 microfuge 관에이 준비를 반복 합니다. 95 ° C에서 샘플을 열 ~ 5 분.
- 젤에 서로 인접 한 차선에서 샘플을 로드 합니다. 홍보도 밴드 마이그레이션에 사용 하지 않는 차선 견본 버퍼를 추가 합니다.
- 겹쳐 쌓이는 젤 통해 이동 염료 앞까지 65 V에서 젤을 실행 합니다. 분리 젤에 도달 하면 150 V에 증가 하 고 실행 될 때까지 염료 앞은 완전히는 젤.
- 전기 장치를 해체 하 고 부드럽게 얼룩 컨테이너 dd H2o. 가득 젤 전송 젤 부드러운 동요와 5 분 동안 앉아 보자. 신선한 dd H2O 때마다 사용으로 두 번 더이 과정을 반복 합니다.
참고:이 프로토콜에 사용 된 Coomassie 얼룩 Coomassie 얼룩 ( 재료의 표참조)에 필요한 일반적인 고정 단계를 필요 하지 않습니다. 다른 Coomassie 준비를 사용 하는 경우 필요에 따라 고정 단계를 조정 합니다. - 마지막 행 구 기에서 물을 제거 하 고 젤을 충당 하기 위해 충분 한 얼룩을 추가 합니다. 적어도 1 시간에 대 한 부드러운 동요와 함께 앉아 젤을 하자.
참고: 동요에 대 한 얼룩 컨테이너는 또한 액체에 덮여 젤을 유지 하면서 젤에 얼룩의 이동을 촉진 하는 기구에 배치할 수 있습니다. - 컨테이너에서 얼룩을 제거 하 고 dd H2o. 대체 dd H2O 젤 린스 젤 부드러운 동요와 함께 30 분 동안 담근 다. (젤 그런 표시 그림 2, 히스톤 밴드의 구분이 분명 나타납니다.)
- 사용 될 때까지 4 ° C에서 nucleosomes를 저장 합니다.
참고: 이러한 조건에 저장 될 때 nucleosomes 안정적으로 유지 몇 달 동안. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.
2. 정적 AFM 이미징 Nucleosomes의 운 모 표면 기능화
- 설명 된 대로 50 m m 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS 재고 솔루션에 이온된 수를 준비 합니다. 30 사용까지 4 ° C에서이 솔루션의 저장소 1 mL aliquots.
참고:는 aliquots은 4 ° c.에서 1 년 이상 저장 될 수 있다 59 - 15 mL dd H2o. 50 m m AP 주식의 50 µ L를 용 해 하 여 운 모 수정 작업 AP 1:300 솔루션 준비
참고:이 작업 솔루션 저장할 수 있습니다 실내 온도에 몇 일 동안. - 1 x 3 cm 스트립 고품질 운 모 시트 (운 모 여기 사용 재료의 표 참조)에서 운 모 잘라.
- 맞는 조각은 베트에 대각선으로 배치 하는 경우 확인 합니다. 날카로운 핀셋, 면도날 또는 스카치 테이프의 끝을 사용 하 여 때까지 둘 다 사이드는 신선 하 게 죽 습 작품은 ~0.1 m m (그림 3A) 처럼 얇은 레이어는 운 모를 쪼개 다. 바로 운 모 조각을 가득 APS 베트로 놓고 30 분 (그림 3B) 품 어.
- Dd H2O와 30 담가 가득 베트 운 모 조각을 전송 s (그림 3C). 완전히 건조는 아르곤 흐름에서 APS-운 모 스트립의 양쪽.
참고: 짠 것이 아닌 셀 루 로스와 폴 리 에스테 르 클린 지우기 (재료에 대 한 자세한 권장된 지우기) 건조는 돌비 늘의 가장자리에서 물 wicking에 도움이 사용할 수 있습니다. - 사용 건조 운 모 스트립은 지금 샘플 준비. 그렇지 않으면, 깨끗 하 고 마른 멧 (그림 3D)에 작품을 저장 합니다.
참고: 1-2 h에 대 한 진공에 추가 스토리지 환경이 습 한 때 좋습니다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.
3. 정적 AFM 이미징 APS-운 모에 Nucleosome 샘플의 준비
- 여러 자기 키를 양면 접착 테이프를 적용 하 고 측면에 그들을 배치.
- 원하는 크기 (여기 사용 MM AFM 계기에 대 한 1 x 1 cm 제곱) APS-운 모 기질을 잘라. 이 깨끗 한 페 트리 접시에 놓고 덮여 유지.
- 3 희석 준비 (최종 nucleosome 농도 0.5, 1.0 및 2.0 nM) 조립된 nucleosomes의 버퍼 포함 10 mM HEPES pH 7.5와 4 mM MgCl2필터링 0.22 μ m를 사용 하 여.
참고: 낮은 최종 농도에서 nucleosomes의 손실을 제한 하는 희석 할 수 APS-운 모에 증 착 직전 한 번에 하나씩. - APS-운 모 작품의 중심에 희석된 nucleosome 샘플의 5-10 µ L를 입금 하 고 2 분 동안 품 어 보자. 부드럽게 씻어 dd H2O 버퍼에 대 한 구성 요소를 모두 제거 하려면 2-3 mL과 샘플. 각 ~0.5 mL dd H2O 사용 후 부드럽게 제거 초과 린스 물에 mica 흔들.
참고: 일회용 주사기가 헹 구는 단계에 대 한 좋습니다. - 건조 한 깨끗 한 아르곤 가스의 빛 흐름에서 예금 된 샘플.
참고: 샘플은 이제 몇 군데 될 준비가 진공 캐비닛에 저장 될 수 있다 또는 desiccator 아르곤으로 가득. 샘플 준비 및 저장 설명 된 대로 다음과 같은 품질 손실 없이 준비 하는 1 년을 몇 군데 있다. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다.
4. Nucleosomes의 정적 AFM 이미지
- 팁 홀더에 AFM 팁을 탑재 합니다. ~ 40 N/m 및 300, 340 kHz 사이의 공명 주파수의 스프링 상수는 팁을 사용 하 여 (여기에서 사용 하는 캔틸레버에 대 한 재료의 표 참조).
- 샘플 샘플 표면에 접촉 하지 않도록 주의 되는 AFM 무대에서 제 3에에서 준비를 탑재 합니다.
- 레이저를 캔틸레버 놓고 합계 최대 때까지 고 제로 근처에 수직 및 수평 편향 값을 조정 합니다.
- 그것의 공명 주파수를 찾을 드라이브 진폭을 조정 하 고 이미지 크기를 100 x 100 설정을 AFM 프로브 조정 nm. 접근 하려면 참여 버튼을 클릭 합니다.
- 샘플의 표면 명확 하 게 볼 때까지 일단, 점차 진폭 설정치 최적화. 1 x 1 µ m 스캔 크기와 512 x 512 픽셀 해상도 늘립니다. 이미지 수집 하려면 참여 버튼 다음 캡처 버튼을 클릭 합니다.
참고: 그림 4 에서 이미지 표시 이러한 샘플 이미징 때 기대할 수 있는 부드러운 배경. - Nucleosome 샘플 분석, AFM 계기 분석 소프트웨어를 사용 하 여 캡처한 이미지를 엽니다.
- 다항식 라인 빼기 또는 유사한 기능을 사용 하 여 이미지를 평평.
- 최소에 대 한 최소값 및 최대값에 대 한 가장 높은 값을 반영 하기 위해 색 테이블을 설정 합니다. 그들은 이후 단계에서 필요한 것으로 각 이미지에 대 한이 값의 기록을 유지.
참고: 이러한 값을 사용 하지 않는 경우 높이 데이터 것입니다 잘못 될 나중 분석에서으로 nucleosome 코어의 횡단면, 평등 보다는 다양 한 높이의 고원으로 표시 됩니다. - 원래 크기로 이미지를.tiff로 이미지를 내보냅니다. 드 테두리 또는 스케일 바와 함께 이미지를 저장 옵션을 선택 합니다.
- 윤곽선 길이 측정 수 있는 분석 소프트웨어에서 이미지를 엽니다.
- X, y 및 z 설정 이미지에 맞게 비늘.
- 내부 길이 보정으로 측정 하 고 다른 한쪽 끝에서 무료 DNA의 윤곽선 길이 기록 합니다. 이 보정 계수에 대 한 측정을 사용 하 여 히스토그램을 생성 하 여 정상적인 (가우스) 분포와 맞는. 피크 센터 분할 (c) x 기본적인 쌍의 기판 길이 여.
참고:이 값은 이미지 특정 변환 인수 나노미터에서 DNA의 기본 쌍. - 측정 하 고 기록 (그림 5A) 일관성에 대 한 코어의 중심에는 팔의 자유 끝에서 각 nucleosome에 대 한 두 팔의 윤곽선 길이.
- 각 nucleosome 코어에 대 한 수집 2 코어의 수직 쌍에서 최대 (FWHM) 값은 절반 폭 전체 횡단면 측정 (그림 5B 두 FWHM 측정 평균 고 각 nucleosome 팔에서 결과 값의 절반을 빼기 하는 코어의 센터에 출구/항목 DNA에서에서 측정된 길이 대 한 올바른 그건 부분의 팔 길이.
- DNA 기본적인 쌍에 팔 길이를 계산 된 보정 인자 (단계 4.5.6)에 의해 각 팔 길이 나눕니다.
- 래핑되지 않은 기판의 총 기본적인 쌍 길이에서 nucleosome 팔 합을 빼서 포장 DNA의 범위를 계산 합니다. 히스토그램으로 이러한 값을 플롯 하 고 nucleosome 인구에 대 한 DNA의 평균 포장된 자료 쌍을 얻기 위해 일반 (가우스) 분포와 peak(s).
- 측정 된 횡단면에서 평균 nucleosome 높이 계산 합니다. 히스토그램으로 이것을 플롯 하 고 nucleosome 인구의 높이를 일반 (가우스) 분포와 peak(s).
5. 시간 경과 AFM 이미지 Nucleosome 역학의
- AFM 팁 팁 홀더에 탑재 합니다. 약 0.1 N/m의 스프링 상수와 7-10 kHz의 공명 주파수는 프로브를 사용할 수 있습니다 (여기에 사용 하는 캔틸레버에 대 한 자료 목록 참조).
- APS-운 모 1 x 1 cm 조각 자석 퍽 더블 막대기 테이프를 사용 하 여 연결 하 고 AFM 계기에 퍽을 탑재.
- 10 mM HEPES pH 7.5와 4 mM MgCl2를 포함 하는 0.22 μ m 필터링 된 이미지 버퍼에 1 nM 집중을 nucleosomes를 희석.
- 입금 희석된 nucleosome의 5-10 µ L 2 분 린스에 운 모 조각의 센터에서 예금 된 샘플 이미지 버퍼의 20µL와 함께 두 번. 두 번째 린스 후 표면에 버퍼 이미징의 물방울을 유지.
- 사용 하 여 탑 뷰 카메라 팁과 표면에 대 한 접근 수동으로 팁은 100 ~ 500까지 표면에서 µ m.
- 팁 및 표면 사이의 격차를 채우기 위해 추가 이미징 버퍼를 추가 합니다. 이 예제에서는 약 50 µ L 이미지 버퍼의 격차를 채우기 위해 충분 하다. 팁에 대 한 공명 피크를 찾아.
- 표면에 컴퓨터 제어 접근을 시작 합니다. 때, 관심의 ~ 500 nm 영역을 선택 하려면 1-2 µ m 영역 이미징 시작. 이 지역으로 선정 하는 관심의, 512 x 512 픽셀 데이터 수집 밀도 조정 합니다.
- 설정 지점 전압을 조정 하 고 이미지 품질을 향상 시키기 위해 매개 변수 진폭을 운전. 10의 무료 진폭 nm 이하의 ~ 2 Hz의 스캔 속도 품질의 이미지를 캡처하는 데 사용 될 수 있다. 시간 경과 AFM을 사용 하 여 캡처한 nucleosome 역학의 예는 그림 6에 표시 됩니다.
6. 고속 저속 AFM 이미지 Nucleosome 역학의
참고: 프로토콜 아래 안도 그룹 (가나자와 대학, 가나자와, 일본)에 의해 개발 된 HS AFM 계기를 위해 제공 됩니다. 60
- APS-운 모 액체 이미징에 대 한 준비.
- 유리 막대-스캐너 접착제를 사용 하 여 AFM 스캐너 무대에 유리 막대를 연결 ( 재료의 표참조). 10 분의 최소이 건조 하 게.
- ~0.1 m m 두꺼운 원형 조각 운 모 1.5 m m 직경의 큰 운 모 시트에서 그들을 펀치 하 여 확인 합니다. HS-AFM 운 모 유리 막대 접착제를 사용 하 여 ( 재료의 표참조)이 운 모 조각 HS AFM 및 건조, 10 분의 최소 본래 유리 막대에 연결할. 잘 쪼개진된 레이어는 테이프에 볼 때까지 압력에 민감한 테이프를 사용 하 여 레이어 다니엘
- Dd H2O 500 µ M APS 솔루션의 99 µ L에 50 m m AP 주식의 1 µ L를 희석. 이 솔루션의 2.5 µ L 갓 쪼개진된 운 모 표면에 예금 하 고 30 분 동안 functionalize.
참고: functionalizing 동안 표면의 건조 방지 하기 위해, 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브의 캡 필터 종이의 젖은 부분에 맞게 고 스캐너 위에 배치. APS 재고 희석 3 시간 더 적은 역학 AFM으로 관찰 될 수 있는 속도를 제어 하려면 정적 이미징에 대 한 보다 액체 이미징에 대 한. - 여러 ~ 3 µ L 린스를 적용 하 여 dd H2O의 20 µ L와 운 모 린스. 완전히 비 짠 지우기는 돌비 늘의 가장자리에 배치 하 여 각 린스 다음 물을 제거 합니다. 최종 린스 후 ~ 3 µ L dd H2O의 표면에 놓고 최소 nonspecifically 바인딩된 모든 AP를 제거 하려면 5 분 동안 앉아 보자.
- HS AFM 보유자에 프로브를 놓고 향하도록 팁 홀더 AFM 단계에 위치 합니다. 린스의 dd H ~ 100 µ L를 사용 하 여 소유자2O 2 ~ 100 µ L 린스 이미징 0.22 μ m 필터링 nucleosomes의 다음 버퍼는 10 mM HEPES pH 7.5와 4 mM MgCl2를 포함 합니다.
- 할 린스와 챔버 버퍼, 물속에 넣는 팁을 이미징 하는 nucleosome의 ~ 100 µ L 채워 놓습니다. 레이저로 누르지 외팔보 위치를 조정 합니다. 린스는 APS-운 모 버퍼 이미징 필터링된 nucleosome의 20 µ L로 린스 당 ~ 4 µ L를 사용 하 여.
- 1의 최종 nucleosome 농도 대 한 버퍼 이미징 필터링된 nucleosome의 250 µ L로 nucleosome 어셈블리 주식의 1 µ L를 희석 nM. 이 희석의 2.5 µ L를 표면에 입금 하 고 2 분 린스와 표면에 앉아 보자 ~ 4 µ L 이미징 버퍼 두 번 nucleosome의. 최종 린스 후 버퍼 이미징으로 덮여 표면을 둡니다.
참고: 표면 하지 nucleosome 샘플 입금 후 씻어 서, 표면 것입니다 빠르게 되과 밀. - 샘플 얼굴 아래로 스캐너 및 팁 홀더 위에 샘플을 설정 합니다. 시작 하려면 접근, 세트 포인트 진폭, 자유 진동 진폭 A0에 가까운s 자동 접근 함수를 사용 합니다.
그러나 참고: 이상적으로,s = 0.95 주의 경우0,,0 의 82%에서 잘 작동 합니다. - 표면을 잘 추적 되 고 때까지 세트 포인트를 조정 합니다.
참고: nucleosome 샘플을 AFM 팁에서 에너지의 전달을 최소화 하는 캔틸레버의 진폭 유지 되어야 한다 1로 낮은 진폭으로 작은 최적의 nm. - 약 150 x 150 이미지 영역 설정 200 x 200 nm nm 이미징 프레임 당 ~ 300 ms의 데이터 획득 율.
참고:이 이미지 크기는 일반적으로 동시에 여러 nucleosomes의 역학을 잡으려고 충분. 덜 채워진된 표면 이러한 매개 변수 변경에 대 한 호출 수 있습니다. 제안 된 프레임 속도 반복, 슬라이딩, 다른 사람들 (대표 결과 아래 섹션 참조)을 풀기 등 nucleosome 역학을 잡으려고 충분.
7. 시간 경과 AFM을 사용 하 여 캡처한 Nucleosome 역학 분석
- .Tiff 이미지 HS AFM 데이터 형식 (.asd)에서 이미지를 변환 합니다.
- 백그라운드는 통일 대비까지 비행기 또는 라인 함수를 사용 하 여 AFM 시스템의 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 평평.
- 자동으로 이미지의 명암 (색조)를 설정 합니다.
참고: 대비 조정할 수 있습니다 수동으로 분석 하지만 프레 젠 테이 션을 위해. 그러면 높이 정보 변환 된 이미지에서 손실 됩니다. - .Mov 파일로 이미지의 선택한 범위를 저장 합니다. 눈금 막대를 취소 하 고 저장 하기 전에 옵션을 국경.
참고: 프레임에 규모 바 있는 이미지에 대 한 분석을 하지 않습니다. 이 이미지의 크기를 변경 하 고 거짓 측정 귀 착될 것 이다. - .Mov 파일을 적당 한 소프트웨어를 사용 하 여 tiff 이미지 변환 ( 재료의 표참조). 변환에 대 한 동일한 프레임 속도 사용 하 여.mov 파일을 만들 때 사용 되었다.
- 이 측정의 측정 소프트웨어에는 이미지를 엽니다 팔 길이 윤곽 측정을 위한 입력 ( 재료의 표참조).
- 체포 됐다과 일치 하도록 이미지 크기를 설정 합니다.
- Nucleosome 중 핵의 센터에 있는 팔의 끝에서 각 nucleosome 팔의 윤곽선 길이 측정 하 고 스프레드시트 (그림 4A)에서 측정을 기록 합니다.
- nucleosome의 래핑을 해제 후 프레임에 래핑되지 않은 DNA 기판의 길이 측정 합니다. Nm/bp 비율 nucleosome 포장 계산에 사용 되는의 영화 특정 교정에 대 한 이것을 사용 하 여
- 2 개의 횡단면 nucleosome 코어에 대 한 프로필과 두 벌 거 벗은 DNA (그림 4B)에 대 한 수집 합니다.
- 스프레드시트 소프트웨어를 횡단 프로 파일을 가져오고 프로 파일에 모든 지점에서 최저 z 값을 빼서 음모를 정상화.
- 높이 절반 최대 (FWHM) 각 단면에 대 한 전체 폭을 계산 하 고 각 프레임에 대 한 두 개의 프로필에서 값 평균.
- 절반을 빼기 각은 nucleosome의 FWHM 값의 무기는 무기의 계산 된 합계와 함께 산 점도로 플롯.
- nucleosome 풀어 후 프레임에 DNA에 대 한 만든 DNA 측정에서 평균 윤곽선 길이 계산 합니다.
- DNA 기판의 기본적인 쌍 길이 의해 무료 DNA의 평균 윤곽선 길이 나누어 nm/혈압 보정 요소를 결정 합니다. 5.12 섹션에 설명 된 대로 각 프레임에 nucleosome 포장 계산을이 값을 사용 합니다.
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Representative Results
모노-nucleosomes 처음 실험 연속 희석 조립 방법 (그림 1)를 사용 하 여 이미징 AFM 준비 했다. 준비 nucleosomes 다음 불연속 SDS 페이지 (그림 2)를 사용 하 여 확인 했다. 운 모 표면은 다음 기능성 APS, 고해상도 이미징 (그림 3)에 대 한 부드러운 배경을 유지 하면서 표면에 nucleosomes를 캡처를 사용 하 여. Nucleosomes는 APS-운 모에 예금 되었다 고 이후 정적 AFM 이미지를 사용 하 여 몇 군데 있었다. 어셈블리 및 증 착에 대 한 컨트롤, H3 모노 nucleosomes 준비 했다 하 고 정적 AFM을 사용 하 여 몇 군데. H3 모노 nucleosomes (그림 4A)의 이미지 nucleosomes 성공적으로 조립 되었다 확인 하는 증 착 전에 순간 존재 nucleosome 인구의 스냅숏을 제공 합니다. 2 nM nucleosome 증 착 표면에 걸쳐 nucleosome과 DNA 입자의 균일 한 분포를 제공 하 고 거의 아무 군집 관찰 되었다.
성공 H3 컨트롤 어셈블리와 제시 방법 다음 CENP-A nucleosomes의 연구에 적용 했다. (그림 4B)이이 샘플의 정적 AFM 이미지는 어셈블리가 성공적으로 밝혔다. CENP-A nucleosomes 1에서 예금 되었다 표면 입자 밀도에 nucleosome 농도의 영향을 보여 nM (그림 4B), 2에 비해 nM H3 사용 (그림 4A). 이 결과 CENP A 샘플에 대 한 감소 된 표면 입자 밀도 약 절반에 H3의 샘플. 정적 AFM 이미지에서 모노 nucleosomes의 높이 회전 수 특징 이었다 (그림 5). 무료 DNA 팔과 무료 DNA 팔의 길이 사이의 두 각도 DNA 수 개별 nucleosome 번갈아 확인 하 사용 되었다.
버퍼에 nucleosomes의 시간 경과 AFM 이미지 nucleosomes (그림 6)의 전반적으로 자연 스러운 unwrapping 행동을 시각화 하기 위해 사용 되었다. Nucleosome 팔과 팔이 unwrapping 과정 (그림 6 B-C) 각 프레임에 결정 회전 수에 대 한 허용의 윤곽선 길이 사이의 각도 측정 합니다. 으로 nucleosome의 회전 수가 감소, nucleosome 핵심 볼륨에 해당 감소는 또한 (그림 6 c)을 관찰 하 게 됩니다. 고속 저속 AFM 다음 표준 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 보고 되었다 더 복잡 한 nucleosome 역학 조사에 사용 되었다. 시간의 긴 기간 동안 역학을 잡으려고이 기술의 능력 ~ 1200 프레임에 걸쳐 촬영 되었다 CENP A nucleosome 코어 (그림 7)의 장거리 전 좌의 시각화에 필수적 이었다. 이 기술은 또한 캡처 드문 전송 CENP A nucleosome의 한 DNA 기질에서 다른 (그림 8)에서 중요 했다. 빠른 이미지 캡처 속도 (~ 300 ms/프레임) 가능이 동적 이벤트의 시각화, 그것만 여러 프레임을 완료 했다.
표 1: 연속 솔트 그라디언트 nucleosome 어셈블리에 필요한 시 약. 각 나열 된 구성 요소를 포함 하는 순화 된 DNA microfuge 관에 추가 됩니다. 이 시 약 물으로 테이블에 나열 됩니다과 NaCl 추가 먼저, H2A/H2B 이합체 및 마지막 추가 히스톤 tetramer 순서로 행해져야 한다. 전 접힌된 히스톤 octamers 사용할 수 있다면, 위의 tetramer로 서 동일한 비율로 추가 합니다. * 주의 NaCl의 히스톤의 각 콘텐츠 고 최종 [NaCl] 2m 같아야 따라, 추가 5 M NaCl을 조정 합니다. ( 재료의 표를 참조).
그림 1: 미 nucleosome 어셈블리에 사용 되는 주사기 펌프의 도식. 어셈블리 혼합 주사기 바늘의 끝에 접촉 되도록 배치 됩니다. 희석으로 버퍼는 주사기 펌프 NaCl의 농도 감소 하 고, 홍보 nucleosome 어셈블리 어셈블리 혼합물에 의해 전달 됩니다. 이 그림은 Stumme Diers 외에서 적응. 30 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 조립된 nucleosomes의 SDS 페이지. 레인 1과 2 H3 octamer 및 히스톤의 CENP A 어셈블리에 각각 포함 됩니다. 레인 3 및 4 포함 조립된 H3 nucleosomes 및 조립된 CENP A nucleosomes 각각. 레인, 히스톤 유일한 컨트롤에 조립된 nucleosomes의 비교 확인 nucleosomes 제대로 조립 했다. 각 레인 위의 만화 회로도 히스톤 구성 요소가 나타냅니다. 이 그림은 Stumme Diers 외에서 적응. 30 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: AP를 준비 하는 과정의 회로도 기능성 nucleosomes의 AFM 이미지에 대 한 운 모. (A) 운 모 ~0.1 m m 두께에서 조각에 양쪽 모두 죽 갓 습. (B) 쪼개진된 운 모 조각을 APS 솔루션을 포함 하는 베트에 대각선 배치 즉시 30 분 (C) 다음의 AP 기능화 단계 품 어로 설정, AP-운 모 조각을 dd H2로 가득 베트 전송 됩니다. 30 s 린스에 대 한 오. (D) APS-운 모 조각은 사용까지는 베트에 저장 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 예제 AFM 이미지 H3 CNEP A nucleosomes의. (A) H3 모노 nucleosomes APS-운 모, 정적 AFM을 사용 하 여 캡처에의 샘플 이미지. 각 밝은 blob 국수 같은 팔으로 측면에 서 DNA 영역 nucleosome 코어 입자 이다. 긴 국수 같은 기능은 무료 DNA 입자 히스톤 코어와 연결 되지 않은 있습니다. 이 이미지를 거의 아무 크롤 링 하는 표면에 걸쳐 균일 한 분포를 제공 하는 2 nM nucleosome 농도 사용 되었습니다. (B)이 nucleosome 샘플 1에 예금 되었다 nM는 2 보다 훨씬 적은 채워집니다 nM (A)에서 사용. 이 nucleosome 희석 nucleosomes의 표면 밀도 직접적인 효과 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 포장과 nucleosome 입자의 높이 특성화 하는 데 사용 하는 분석의 시각적 묘사. 그림 3에 표시 된 같은 이미지에서 (A) A 대표 nucleosome 입자. Nucleosome 팔 각의 윤곽선 길이 코어 (점선된 녹색 선)의 중심에는 팔의 끝에서 측정 됩니다. 플롯은 nucleosome의 횡단면 프로필 (빨간색과 파란색 라인)이이 곡선, 높이에서 곡선 (B)에 표시 된 생산 하 고 입자의 너비 정보를 확인할 수 있습니다. 각종의 (C) 회로도 nucleosomes의 포장. (D) 각 포장된 상태는 DNA 팔, DNA 회전 수와 포장된 DNA의 혈압 사이의 각도 사용 하 여 특징입니다. 눈금 막대 = 20 nm. 이 수치는 Lyubchenko 그 외 여러분 에서 적응 24 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6. 시간 경과 AFM의 예 이미지 캡처 nucleosomes의 자발적인 풀기. 연속 스캔 버퍼에 잡혀 nucleosomes의 자발적인 unwrapping 과정의 연속 AFM 이미지의 (A) A 시리즈. 각 프레임의 크기는 200 nm 및 이미지 ~ 170의 속도로 캡처된 프레임 마다 s. (B) unwrapping 과정으로 진행 되는 동안 각 프레임에 nucleosome 증가, (C)의 팔 길이에 DNA에 있는 감소의 결과로 nucleosome 돌아서. 이 회전 수 측정된 팔 길이 (검정) 또는 nucleosome 팔 (빨강) 사이의 각도에서 확인할 수 있습니다. Nucleosome 볼륨 감소 (파란색 곡선, 오른쪽 축)을 또한 관찰로 회전 수 감소,. 각 프레임은 200 x 200 nm 크기에서. 이 수치는 Lyubchenko 그 외 여러분 에서 적응 24 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7입니다. 긴 이미지 수집 시간을 위한 저속 고속 AFM의 고용량의 데모 (A) A CENP A nucleosomes 코어의 전 동작을 시연 하는 이상의 1200 프레임에서 선택한 이미지의 갤러리. 각 이미지 ~ 300 ms의 속도로 캡처된 프레임 /. (B) CENP-A 코어 DNA 기판의 한쪽 끝에서 윤곽선 길이 측정이 긴 전 과정을 특성화 하는 데 사용 됩니다. 눈금 막대 = 25 nm. 이 그림은 Stumme Diers 외. 에서 적응 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8입니다. 고속 저속 AFM을 사용 하 여 캡처한 동적 nucleosome 코어 전송의 예 (그림에서 Stumme Diers 외. 적응 16 (A) 선택한 프레임을 다른 하나의 DNA 기판에서 CENP A nucleosome의 자발적인 전송 시연 합니다. 이 프로세스 했다 ~ 300 ms의 속도로 점령 했다 여러 프레임 내 프레임 /. (A)에 표시 된 전송 과정의 (B) 회로도 눈금 막대 = 25 nm. 이 그림은 Stumme Diers 외. 에서 적응 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
위에서 설명한 프로토콜은 오히려 간단 하 고 재현성 높은 결과 제공 하는 몇 가지 중요 한 문제를 강조 수 있습니다. 기능성된 APS-운 모는 안정적이 고 재현 가능한 결과 얻기를 위한 주요 기판. APS-운 모의 높은 안정성 이미징 기판 사용 준비 중인 후 2 주 이상 사용할 수 있는 사전에 준비를 한이 기판의 중요 한 기능 중 하나입니다. 59 , 그러나 61 , 표면 수 있습니다 손상 될 접착제의 증기에 의해 운 모는 금속 퍽에 장착에 사용 됩니다. 따라서, 운 모 프로토콜 (2 절)에 설명 된 대로 장착에 대 한 두 배 지팡이 테이프를 사용 하는 것이 좋습니다. 경우에 접착제의 사용이 필요한 경우 예를 들어 이미징 액체, 금속 디스크에 돌비 늘의 설치를 위한 접착제를 사용 하는 일부 사용자 섹션 6.1.3 HS AFM 이미징 위한 샘플 준비에에서 설명 된에서 수정 다음 절차는 권장 . 운 모는 금속 디스크 또는 다른 고체 물질에 붙어 하 고 접착제 경화 후 죽 습. 불어는 접착제의 잠재적인 증기를 제거 하는 아르곤과 운 모. 그리고는 운 모는 스카치 테이프로 죽 습 수 APS 운 모 작업 솔루션 배치 갓 쪼개진된 운 모 스트립을 커버. 솔루션 운 모 스트립 크기에 따라 다릅니다. 30 분 동안 반응 APS를 허용 합니다. 증발을 최소화, 젖은 페 트리 접시에 반응을 실행 합니다. 다음 절차를 사용 하 여: 담가 실험실 닦아 종이 장소는 페 트리 접시의 하단에. 젖은 잎사귀에 5 m m 두꺼운 플라스틱 디스크를 놓고 페 트리 접시의 바닥에 물과의 접촉을 피하고 그것에 붙어 운 모와 금속 디스크를 넣어. 30 분 후 운 모/디스크 어셈블리를 제거 하 고 철저 하 게 린스 dd 물과 피 펫 6.1.3 섹션에 설명 된 대로 운 모 표면. 표면 샘플 증 착에 대 한 준비가 되어있습니다. 비록 좋은 출발점 되어야 작업 섹션 2.2에에서 설명 된 APS 솔루션 (1:300) APS 농도 dna, 실험에서 조정 될 필요가 있다. 6.1.3 HS afm nucleosomes의 이미징 절차 설명 섹션에 설명 된 프로토콜에서 APS (1: 100)의 3 배 높은 농도 사용 되었다.
프로토콜 설명 AP와 운 모 기능화를 기반으로 합니다. 이것은 가장 강력한, 높은 재현성 및 간단한 절차 이다. 유일한 단점은 그 APS, aminopropyl silatrane는 상업적으로 사용할 수 없습니다. 그러나, AP 합성의 절차는 간단 하 고 그것의 종합에 대 한 프로토콜 자세히 설명. 59 지금까지 합성 절차 문제, 상업적으로 사용할 수 있는 시 약 인 경우에 aminopropyltriethoxy silane (항) 운 모 기능화 (AP-운 모)에 대 한 사용할 수 있습니다. AP-운 모의 준비에 대 한 프로토콜을 제공 하는 동일한 종이 항의 증기를 사용 하 여. 프로시저 테스트 되었고 nucleosomes를 포함 한 다양 한 단백질 DNA 복합물, 위상적 다른 유형의 DNA 35,36,50,,6263 의 이미징에 대 한 사용. 27 , 50 , 64 APS-운 모, 유사 하 게 AP-운 모 안정 주 동안 이며 일괄에서; 사전에 준비 될 수 있다 AP-운 모 표면 이므로 AP-운 모도 원활 하 고, 버퍼에 오히려 둔감 샘플 pH10 및 1 밀리미터와 NaCl의 200 밀리미터 사이 이오니아 힘 pH 값과 버퍼 솔루션에 준비 될 수 있다. 59 , 65 AP mica를 사용 하 여 유일한 결점은은과 조립 집계에 표면에 물, 시간 경과 화상 진 찰 하는 동안이 프로세스는 집계 될 수 있는 다소 느린 aminopropyl silane의 가능성 표면에 구별, DNA의 그래서 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다. 35 silatrane moiety의 가수분해는 매우 느린, 그래서 아무 표시 집계 장기 이미징; 하는 동안 볼 수 있습니다. 26 , 35 , 56 , 66 , 따라서 APS-운 모 물에 이미징 사용 하는 경우 AP-운 모에 비해 바람직 기판입니다. 재현성 항을 사용 하 여, 시 약의 증 류는 좋습니다 AP-운 모 준비. 항 증에 대 한 프로토콜 종이 59에 설명 되어 있습니다.
AFM, 단일 분자 기술로 nucleosome nanomolar 범위와 그 nucleosomes 농도 같은 낮은 농도에서 자발적으로 해리 수와 함께 작동 합니다. 25의 우리의 데이터 따르면 분리 과정은 수십 분 AFM 연구 샘플 증 착 하기 전에 준비 되어야 한다 제안에서 발생 합니다. 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio 같은 일부 세제]-1-propanesulfonate (챕) nucleosomes는 몇 배나 25, 그들의 일생을 증가 하지만 세제를 사용 하 여 행해져야 한다 그래서 nucleosome 안정성을 증가 와 주의. 우리 25에서 nucleosomes의 안정화 순서 특이성의 변화에 의해 동반, 등의 사용으로도 nucleosome 시퀀스 Widom 601 템플릿으로 특정 주제, 그래서는 601에 바인딩의 특이성 없이 조립 시퀀스입니다.
다른 AFM 샘플 준비 방법 기준으로 제안 된 방법으로 중요 한 문제는 여러 가지가 있습니다. 첫째, APS-운 모와 AP-운 모 기판 안정 주 동안 고 일괄에서; 사전에 준비 될 수 있다 서피스 되므로 버퍼에 오히려 둔감 하 고 부드러운 샘플 pH10 및 1 밀리미터와 NaCl의 200 밀리미터 사이 이오니아 힘 pH 값과 버퍼 솔루션에 준비 될 수 있다. 59 , 65 기존 방법의 이러한 속성을 일치합니다. 둘째, AFM는 단 하나 분자 기술 이며 아주 작은 샘플을 요구 한다. 설명된 프로토콜 nanoscale 양의 준비와 함께 작동합니다. 셋째, 시간 경과 AFM 연구와 HS AFM 데이터 수집, 생성 하 고 획득 하는 큰 데이터 세트를 특성화 하는 데 필요한 시간의 상당한 금액이입니다. 여기서 설명 하는 방법론은 AFM 이미지의 수백을 분석 하는 데 적합 합니다.
샘플 준비 방법론 nucleosome 형식 샘플에 국한 되지 않습니다. 오히려 그것은 단백질-DNA 복합물의 종류를 구분 하지 않습니다 및 DNA, 예: 제한 효소 67,,6869, 단일 가닥 DNA에 특정 시퀀스를 인식 하는 숫자 단백질에 이미 적용 된 단백질 44,,4556,70,71 DNA 복제 47,72 에 관련 된 복잡 한 단백질 시스템 함께 바인딩 및 재결합68,73 중요 한 것은, HS AFM이 시스템의 역학에 따라 이러한 시스템에 적용 되었습니다. 이러한 연구는 제안으로 nucleosome 배열의 특성에 개발된 방법론을 적용 하 여 centromere 단백질 B로 같은 centromere 특정 단백질의 역할 (CENP-B) 또는 C (CENP C) centromere 어셈블리에서 명료 하 게 가능 하 게 하 고 많은 암33,34의 개발에 자신의 역할을 이해합니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
기여 저자: YLL MSD 디자인 프로젝트; MSD nucleosomes를 조립. MSD와 ZS AFM 실험 및 데이터 분석을 수행합니다. 모든 저자 쓴와 원고를 편집.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pGEM3Z-601 | Addgene, Cambridge, MA | 26656 | |
| PCR Primers | IDT, Coralville, IA | Custom Order | (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3' |
| DreamTaq polymerase | ThermoFischer Scientific, Waltham, MA | EP0701 | Catalog number for 200 units |
| PCR purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28104 | Catalog number for 50 units |
| Tris base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 10708976001 | Catalog number for 250 g |
| EDTA | ThermoFischer Scientific, Waltham, MA | 15576028 | Catalog number for 500 g |
| (CENP-A/H4)2, recombinant human | EpiCypher, Durham, NC | 16-0010 | Catalog number for 50 ug |
| H2A/H2B, recombinant human | EpiCypher, Durham, NC | 15-0311 | Catalog number for 50 ug |
| H3 Octamer, recombinant human | EpiCypher, Durham, NC | 16-0001 | Catalog number for 50 ug |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL | ThermoFischer Scientific, Waltham, MA | 69574 | Catalog number for 10 devices |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9888-500G | Catalog number for 500 mg |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | Millipore-sigma, Burlington, MO | UFC501008 | Catalog number for 8 devices |
| HCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 258148-25ML | Catalog number for 25 mL |
| Tricine | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T0377-25G | Catalog number for 25 g |
| SDS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 11667289001 | Catalog number for 1 kg |
| Ammonium Persulfate (AmmPS) | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610700 | Catalog number for 10 g |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610158 | Catalog number for 500 mL |
| TEMED | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610800 | Catalog number for 5 mL |
| 4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610747 | Catalog number for 10 mL |
| 2-ME | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M6250-10ML | Catalog number for 10 mL |
| ageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoFischer Scientific, Waltham, MA | 26616 | Catalog number for 500 uL |
| Bio-Safe™ Coomassie Stain | Bio-Rad, Hercules, CA | 1610786 | Catalog number for 1 L |
| Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth | TexWipe, Kernersvile, NC | TX604 | |
| Muscovite Block Mica | AshevilleMica, Newport News, VA | Grade-1 | |
| Aminopropyl silatrane (APS) | Synthesized as described in 22 | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | H4034-25G | Catalog number for 25 g |
| Scotch Tape | Scotch-3M, St. Paul, MN | ||
| TESPA-V2 afm probe (for static imaging) | Bruker AFM Probes, Camarillo, CA | ||
| MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) | Bruker AFM Probes, Camarillo, CA | ||
| Aron Alpha Industrial Krazy Glue | Toagosei America, West Jefferson, OH | AA480 | Catalog number for 2 g tube |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M8266-100G | Catalog number for 100 g |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | SLGP05010 | Catalog number for 10 devices |
| BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) | Olympus, Japan | ||
| Compound FG-3020C-20 | FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan | ||
| Compound FS-1010S135-0.5 | FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan | ||
| MultiMode Atomic Force Microscope | Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA | ||
| High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy | Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan |
References
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