Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

Vi præsenterer her, en protokol til at karakterisere nucleosome partikler på enkelt-molekyle niveau ved hjælp af statisk og time-lapse atomic force mikroskopi (AFM) imaging teknikker. Den beskrevne overflade functionalization metode giver mulighed for opsamling af strukturen og dynamikken i nucleosomes i høj opløsning på nanoplan.

Abstract

Kromatin, som er en lang kæde af nucleosome subunits, er et dynamisk system, der giver mulighed for disse kritiske processer som DNA-replikation og transskription til at tage plads i eukaryote celler. Dynamikken i nucleosomes giver adgang til DNA af replikering og transskription machineries og bidrager kritisk til de molekylære mekanismer bag kromatin funktioner. Enkelt-molekyle studier såsom atomic force mikroskopi (AFM) imaging har bidraget væsentligt til vores nuværende forståelse af rollen, nucleosome struktur og dynamik. Den nuværende protokol beskrives den fremgangsmåde, der giver høj opløsning AFM Billeddannende teknikker til at studere de strukturelle og dynamiske egenskaber af nucleosomes. Protokollen er illustreret af AFM data indhentet for centromer nucleosomes hvor H3 Histon er erstattet med sit modstykke centromer protein en (CENP-A). Protokollen starter med samling af mono-nucleosomes ved hjælp af en kontinuerlig fortynding metode. Forberedelse af glimmer substrat functionalized med aminopropyl silatrane (APS-glimmer), der bruges til nucleosome imaging er kritisk for AFM visualisering af nucleosomes beskrevet og fremgangsmaade at forberede substratet. Nucleosomes deponeret på APS-glimmer overflade er først afbildet ved hjælp af statisk AFM, som indfanger et øjebliksbillede af nucleosome befolkningen. Fra analyser af disse billeder, sådanne parametre som størrelsen af DNA snoet omkring nucleosomes kan måles, og denne proces er også detaljeret. Time-lapse AFM imaging procedure i væsken er beskrevet for højhastighedstog time-lapse AFM, der kan indfange flere billeder af nucleosome dynamics pr. sekund. Endelig, analyse af nucleosome dynamics aktivering kvantitative karakterisering af de dynamiske processer er beskrevet og illustreret.

Introduction

I eukaryote celler er DNA meget komprimeret og organiseret i kromosomer. 1 det første niveau af DNA organisation inden for et kromosom er forsamlingen af nucleosomes i hvilke 147 bp DNA er tæt pakket omkring en Histon octamer kerne. 2 , 3 nucleosome partikler samle på et langt DNA molekyle danner en kromatin array, som er så organiseret indtil en meget kompakt kromosom enhed er dannet. 4 demonteringen af kromatin giver adgang til gratis DNA, der kræves af kritiske cellulære processer såsom gen transskription og genom replikering, tyder på, at kromatin er et meget dynamisk system. 5 , 6 , 7 forståelse de dynamiske egenskaber af DNA på forskellige kromatin niveauer er kritisk vigtigt belyse genetiske processer på det molekylære niveau, hvor fejl kan føre til celledød eller udvikling af sygdomme såsom kræft. 8 en kromatin egenskab af stor betydning er dynamikken i nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 den høje stabilitet af disse partikler har tilladt for en strukturel karakterisering af krystallografiske teknikker. 2 hvad disse undersøgelser mangler er de dynamiske detaljer af nucleosomes såsom mekanismen for DNA udpakning af Histon kerne; den dynamiske pathway der er påkrævet ved processer, transskription og replikering. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 endvidere særlige proteiner kaldes remodeling faktorer har vist sig at lette demonteringen af nucleosomal partikler17; nucleosomes iboende dynamik er imidlertid den afgørende faktor i denne proces, der bidrager til hele demontering proces. 14 , 16 , 18 , 19

Enkelt-molekyle teknikker som enkelt-molekyle fluorescens19,20,21, optisk diffusering (pincet)13,18,22,23 og AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 har været medvirkende til at forstå dynamikken i nucleosomes. Blandt disse metoder, AFM fordele fra flere unikke og attraktive funktioner. AFM gør det muligt at visualisere og karakterisere individuelle nucleosomes samt den længere arrays27. Fra AFM billeder, kan vigtige egenskaber af nucleosome struktur som længden af DNA svøbt omkring Histon kernen være målt 10,14,26,28; en parameter, der er centrale for karakterisering af nucleosome udpakning dynamics. Forbi AFM har undersøgelser afsløret nucleosomes at være stærkt dynamiske systemer og at DNA spontant kan udpakke fra Histon core14. Den spontane udpakning af DNA fra nucleosomes var direkte visualiseret af AFM opererer i tilstanden time-lapse når billeddannelse sker i vandige opløsninger 14,26,29.

Fremkomsten af højhastighedstog time-lapse AFM (HS-AFM) instrumenteringen gjort det muligt at visualisere nucleosome udpakning proces på millisekund tidsskala 14,15,24. Seneste HS-AFM 16,30 undersøgelser af centromer specifikke nucleosomes afslørede flere nye funktioner i nucleosomes sammenlignet med den kanoniske form. Centromer nucleosomes udgør af en centromer, en lille del af den kritisk vigtige til kromosom segregation31kromosom. I modsætning til kanoniske nucleosomes i bulk kromatin indeholder Histon kernen af centromer nucleosomes CENP-A Histon i stedet for Histon H332,33. Som følge af denne Histon substitution, DNA indpakning i centromer nucleosomes er ~ 120 bp i stedet for ~ 147 bp for kanoniske nucleosomes; en forskel, der kan føre til forskellige morfologier centromer og kanoniske nucleosomes arrays34, tyder på, at centromer kromatin gennemgår højere dynamics sammenlignet med størstedelen en. Den nye dynamik vises af centromer nucleosomes i HS-AFM16,30 undersøgelser eksemplificere den enestående lejlighed leveres af denne enkelt-molekyle teknik til direkte visualisere de strukturelle og dynamiske egenskaber af nucleosomes. Eksempler på disse funktioner vil være kort drøftet og illustreret i slutningen af papiret. Dette fremskridt blev gjort på grund af udviklingen af nye protokoller til AFM billeddannelse af nucleosomes samt ændringer af eksisterende metoder. Målet med protokollen beskrevet her er at gøre disse spændende fremskridt i enkelt-molekyle AFM nucleosome undersøgelser tilgængelige for enhver, der ønsker at udnytte disse teknikker i deres kromatin undersøgelser. Mange af de teknikker beskrevet gælder for problemer ud over undersøgelsen af nucleosomes og kan bruges til undersøgelser af andre proteiner og DNA systemer af interesse. Et par eksempler på sådanne programmer kan findes i publikationer35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 og udsigterne til AFM undersøgelser af forskellige Biomolekylær systemer gives i anmeldelser29,50,51,53,54.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. løbende fortynding forsamling af Mono-nucleosomes

  1. Generere og rense en ca 400 bp DNA substrat, der indeholder en off-centreret Widom 601 nucleosome positionering sekvens. 55
    Bemærk: For at begrænse uønskede dannelsen af di-nucleosomes, hver 'arm' flankerende positionering rækkefølgen bør ikke overstige ~ 150 bp.
    1. Bruge plasmidet pGEM3Z-601 sammen med de designede primere og forstærke substrat DNA ved hjælp af PCR. 423 bp bærematerialet med 122 og 154 bp arm længder bruges her, bruge frem (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') og omvendt (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') primere.
    2. Føje rør indeholdende reaktionsblandingen til en termisk cycler forvarmes til 95 ° C. Køre følgende program for 33 cykler efter en indledende denaturering for 5 min. ved 95 ° C: 30 s denaturering på 95 ° C, 30 s udglødning på 49 ° C, 35 s udvidelse på 72 ° C. Angiv filtypenavnet endelige ved 72 ° C i 10 min efter 33 cyklusser.
    3. Rense DNA fra PCR blandingen ved hjælp af en kommercielt tilgængelig PCR rensning Kit. Når eluerer DNA fra kolonnen PCR oprydning, skal du bruge 10 mM Tris buffer (pH 7,5) i stedet for sættet leveres eluering buffer.
      Bemærk: Vær ekstra forsigtig ikke at overføre buffere mellem trinene rensning. En forurenet elueringsvæsken kan give problemer nedenstrøms når måling DNA koncentration og/eller kan ændre start salt koncentrationen af nucleosome forsamling blanding.
  2. Bestemme DNA-koncentrationen ved at måle absorbansen af oprenset DNA på 260 nm.
    1. Indsamle en tom på UV-VIS Spektrofotometer ved hjælp af kun i 10 mM Tris pH 7,5 eluering buffer. Indsamle en måling af oprenset DNA.
  3. Med koncentrationen bestemmes, alikvot 25 pmol af oprenset DNA ind i et 0,6 mL mikrofuge rør og placere den i et vakuum centrifuge, indtil løsningen er knap synlige; Dette er typisk 30 min. til 1 time.
    Bemærk: DNA substrat er nu klar til nucleosome forsamling. Ellers, protokollen kan stå i pause her og DNA opbevares ved-20 ° C indtil brug.
  4. Placer mikrofuge rør indeholdende den 25 pmol DNA på isen og tilføje nucleosome forsamling komponenter i tabel 1, i den anførte rækkefølge. Når alle komponenter er blevet tilføjet, skal du fjerne blandingen fra isen og inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 30 min.
    Bemærk: Det er afgørende, at saltindholdet stock Histon buffer anses for Hvornår beregningen af NaCl for at opnå slutkoncentration 2 M. 15 , 56
  5. Samle nucleosomes ved at reducere 2 M saltkoncentration af blandingen til 200 mM ved hjælp af en kontinuerlig sats fortynding. 57
    1. Fyld en sprøjte med 100 µL af fortynding buffer indeholdende 10 mM Tris pH 7,5 og placere den på en sprøjten pumpe.
    2. Direkte nålen i sprøjten gennem en pre punkteret hul i hætten af det mikrofuge rør, sikre kontakt er lavet med forsamling blanding (figur 1).
    3. Køre sprøjten pumpe med en hastighed på 0,75 µL/min for 120 min.
      Bemærk: Den resulterende 100 µL opløsning indeholder 250 nM nucleosomes og 200 mM NaCl.
    4. Overfør blandingen til en 10 K MWCO dialyse knap og dialyze mod 200 mL af en pre kølet (4 ° C) lav salt buffer indeholdende 10 mM Tris pH 7,5, 0,25 mM EDTA og 2,5 mM NaCl, for 1 time ved 4 ° C.
  6. For at vurdere Histon indholdet af nucleosome forsamlingen, forberede en diskontinuerlig SDS-PAGE gel med en 15% adskillelse og 6% stabling som tidligere beskrevet30.
    1. Alikvot 10-20 µL af nucleosome materiel til et mikrofuge rør og tilføjes en arbejdende koncentration af 1-2 x 4 x Laemmli prøvebuffer. 58
    2. Som kontrol, Gentag dette præparat i en separat mikrofuge tube for 1-2 µg af Histon lager. Opvarme prøverne ved 95 ° C for ~ 5 min.
    3. Indlæse prøver i tilstødende baner til hinanden på gelen. Tilføje prøvebuffer til de ubrugte baner at fremme selv band migration.
    4. Kør gelen på 65 V indtil farvestof fronten bevæger sig gennem den stabling gel. Når de adskillende gel er nået, øges til 150 V og køre indtil farvestof front har flyttet helt ud af gelen.
    5. Demontere elektroforese enhed og forsigtigt overføre gel til en farvning container fyldt med dd Hansen2O. Lad gelen sidde i 5 min. med blid agitation. Gentag processen to gange mere med friske dd H2O bruges hver gang.
      Bemærk: Coomassie pletten bruges i denne protokol kræver ikke de typiske fastsættelse trin til Coomassie pletter (Se Tabel af materialer). Hvis der bruges en anden Coomassie forberedelse justere fastsættelse trin efter behov.
    6. Fjerne vandet fra den sidste skylning og Tilføj lige nok pletten for at dække gel. Lad gelen sidde med blid agitation i mindst 1 time.
      Bemærk: For agitation, farvning beholderen kan placeres på ethvert apparat, der fremmer bevægelse af pletten over gelen samtidig også holde gelen er omfattet i væske.
    7. Fjerne pletten fra beholderen og skyl gel med dd Hansen2O. Erstat dd H2O og blød gel for 30 min med blid agitation. (Gel bør vises som vist i figur 2, med klar adskillelse af Histon bands).
  7. Opbevar nucleosomes ved 4 ° C indtil brug.
    Bemærk: Når den gemmes i disse betingelser, nucleosomes forbliver stabil i flere måneder. Protokollen kan være midlertidigt her.

2. functionalization af glimmer overflade for statisk AFM billeddannelse af Nucleosomes

  1. Forberede en 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS stamopløsning i ionbyttet vand som beskrevet. 30 butik 1 mL alikvoter af denne oploesning ved 4 ° C indtil brug.
    Bemærk: Delprøver kan lagres i mere end et år ved 4 ° C. 59
  2. Forberede glimmer ændring ved at opløse 50 µL af 50 mM APS bestanden i 15 mL dd Hansen2O. 1: 300 en brugsopløsning APS
    Bemærk: Denne brugsopløsning kan opbevares ved stuetemperatur i flere dage.
  3. Skær 1 x 3 cm strimler af glimmer fra høj kvalitet glimmer ark (Se Tabel af materialer for glimmer bruges her).
    1. Kontroller, at brik passer når placeret diagonalt i en kuvette. Brug spidsen af skarpe pincet, et barberblad eller scotch tape, for at kløve lag af glimmer, indtil begge sider er frisk kløvet og stykket er så tynd som ~0.1 mm (figur 3A). Straks Placér glimmer i APS fyldt kuvette og Inkuber i 30 min (figur 3B).
  4. Overføre glimmer stykke til en kuvette, fyldt med dd H2O og blød i 30 s (figur 3 c). Helt tørre begge sider af APS-glimmer bånd under en argon flow.
    Bemærk: En ikke-vævede cellulose og polyester renrum tørre (anbefalede tørre detaljeret i materialer) kan bruges til at støtte i fugtspredende vand fra kanten af glimmer, når tørring.
  5. Brug tørre glimmer strip er nu for prøveforberedelsen. Ellers gemme stykket i en ren, tør kuvette (figur 3D).
    Bemærk: Ekstra lagerplads i et tomrum i 1-2 timer anbefales når miljøet er fugtigt. Protokollen kan være midlertidigt her.

3. forberedelse af Nucleosome prøver på APS-glimmer til statisk AFM Imaging

  1. Gælde flere magnetiske puck dobbeltsidet selvklæbende tape og læg dem til side.
  2. Skære APS-glimmer substrat til den ønskede størrelse (1 x 1 cm firkanter for MM AFM måleapparatet her). Placer disse stykker i en ren petriskål og holde dækket.
  3. Forberede tre fortyndinger af de samlede nucleosomes (endelige nucleosome koncentrationer på 0,5, 1,0 og 2,0 nM) ved hjælp af et 0,22 µm filtreret buffer indeholdende 10 mM HEPES pH 7,5 og 4 mM MgCl2.
    Bemærk: For at begrænse tabet af nucleosomes i den lave endelige koncentration, Fortyndingerne skal gøres en ad gangen, umiddelbart før deposition på APS-glimmer.
  4. Indbetaling 5-10 µL af de fortyndede nucleosome prøve på midten af APS-glimmer stykke, og lad Inkubér i to minutter. Skyl forsigtigt prøve med 2-3 mL af dd H2O fjerne alle buffer komponenter. Efter hver ~0.5 mL dd H2O bruges, Ryst forsigtigt glimmer for at fjerne det overskydende skyllevandet.
    Bemærk: En engangs sprøjte anbefales for dette føres trin.
  5. Tør den deponerede prøve under en let strøm af ren argon gas.
    Bemærk: Eksemplet er nu klar til afbildning eller kan opbevares i et vakuum kabinet eller ekssikkator fyldt med argon. Prøver tilberedes og opbevares som beskrevet har været afbildet et år efter forberedelse uden kvalitet tab. Protokollen kan være midlertidigt her.

4. statisk AFM billeddannelse af Nucleosomes

  1. Montere en AFM tip tip indehaveren. Bruge et tip, der har en fjeder konstant ~ 40 N/m og en resonansfrekvens mellem 300 og 340 kHz (Se Tabel af materialer til udkragninger bruges her).
  2. Montere den prøve, der tilberedes i afsnit 3 på AFM scenen er omhyggelig med ikke at kontakte prøveoverfladen.
  3. Placer laser over cantilever indtil summen er maksimale og justere de lodrette og tværgående afbøjning værdier til nær nul.
  4. Tune AFM sonde for at finde sin resonansfrekvens og justere drev amplitude og indstille billedstørrelsen til 100 x 100 nm. Klik på knappen engagere sig for at starte tilgangen.
  5. Når nærmede sig, gradvist optimere Amplitude Setpoint, indtil overfladen af prøven ses tydeligt. Øge scanningsstørrelse til 1 x 1 µm og opløsning til 512 x 512 pixel. Klik på knappen capture efterfulgt af engagere-knappen for at begynde billede erhvervelse.
    Bemærk: Billederne i figur 4 viser glat baggrunden, der kan forventes, når imaging disse prøver.
  6. For at analysere nucleosome prøven, åbne billederne ved hjælp af AFM instrumenter analyse software.
    1. Samkopiere billedet ved hjælp af et polynomium linje subtraktion eller lignende funktion.
    2. Indstille Farvetabel til at afspejle den laveste værdi for mindst og den højeste værdi for maksimal. Føre en fortegnelse over disse værdier for hvert billede, som de vil være nødvendige i et senere trin.
      Bemærk: Hvis disse værdier ikke anvendes, bliver højde data forkert i den senere analyse, som tværsnit af nucleosome kerner vil fremstå som plateauer af lig, snarere end varierende højde.
    3. Eksportere billedet som en .tiff billede på den oprindelige størrelse. Fravælge nogen muligheder for at gemme billedet med en kant eller skala barer.
    4. Åbn billedet i analyse software i stand til at contour længde målinger.
    5. Sæt x, y og z skalaer til at matche billedet.
    6. Som en indre længde kalibrering, måle og registrere contour længden af gratis DNA fra den ene ende til den anden. For denne kalibreringsfaktor kan bruge målinger til at generere et histogram og passer det med en normal (Gaussian) distribution. Opdele peak center (x-c) af substrat længde i basepar.
      Bemærk: Denne værdi er billedet bestemt omregningsfaktoren fra nanometer til base par af DNA.
    7. Måle og registrere contour længden af begge arme for hver nucleosome fra den frie ende af armen til byens kerne, for sammenhæng (figur 5A).
    8. For hver nucleosome kerne, indsamle to fuld bredde på halv maksimum (FWHM) værdier fra en vinkelret par core tværsnit målinger (figur 5B gennemsnitlig to FWHM målingerne og trække halvdelen af den resulterende værdi fra hver nucleosome arm til korrekt for den målte længde fra exit/indgang DNA til centrum af kernen, er ikke en del af arm længde.
    9. Opdele hver arm længde af den beregnede kalibreringsfaktoren (trin 4.5.6) at opnå arm længder i DNA basepar.
    10. Beregne omfanget af DNA indpakning ved at fratrække nucleosome arm summen fra den samlede basepar længde af uindpakkede substratet. Afbilde disse værdier som et histogram og passe kromatografiske med en normal (Gaussian) distribution at få de gennemsnitlige indpakket basepar af DNA for befolkningens nucleosome.
    11. Beregn den gennemsnitlige nucleosome højde fra de målte tværsnit. Plot dette som et histogram og passe kromatografiske med en normal (Gaussian) distribution at få højden af nucleosome befolkningen.

5. time-Lapse AFM billeddannelse af Nucleosome Dynamics

  1. Montere AFM tip tip indehaveren. En sonde med en foråret konstant på ca 0,1 N/m og en resonansfrekvens på 7-10 kHz kan bruges (Se listen materialer for udkragninger bruges her).
  2. Tillægger en magnetisk pucken med dobbelt-stick tape 1 x 1 cm stykke af APS-glimmer og montere pucken på AFM instrument.
  3. Fortynd nucleosomes til en 1 nM koncentration i et 0,22 µm filtrerede imaging buffer indeholdende 10 mM HEPES pH 7,5 og 4 mM MgCl2.
  4. Deponere 5-10 µL af de fortyndede nucleosome på midten af glimmer stykke i 2 min. Skyl den deponerede prøve med 20µL af imaging bufferen to gange. Efter den anden skyl, holde en dråbe af imaging buffer på overfladen.
  5. Brug den top-kamera til at finde tip og tilgang til overfladen manuelt indtil spidsen er ~ 100-500 µm fra overfladen.
  6. Tilføje yderligere billeddiagnostik buffer for at udfylde hullet mellem spidsen og overfladen. I dette eksempel er ca 50 µL af imaging buffer tilstrækkelig til at fylde hullet. Find en resonans peak nemlig aflæsse.
  7. Begynd den computerstyrede tilgang til overfladen. Når nærmede sig, Begynd imaging med en 1-2 µm område til at vælge en ~ 500 nm område af interesse. Med dette område af interesse valgt, justere data erhvervelse tæthed til 512 x 512 pixel.
  8. Justere sætpunktet spænding og drive amplitude parametre til at forbedre billedkvaliteten. En gratis amplitude af 10 nm eller derunder og en scan rate af ~ 2 Hz kan bruges til at fange billeder af kvalitet. Et eksempel på nucleosome dynamics fanget ved hjælp af time-lapse AFM er vist i figur 6.

6. højhastighedstog Time-Lapse AFM billeddannelse af Nucleosome Dynamics

Bemærk: Nedenstående protokollen er fastsat for HS-AFM instrument udviklet af gruppen Ando (Kanazawa universitetet, Kanazawa, Japan). 60

  1. Forberede flydende billeddannelse APS-glimmer.
    1. Tillægger AFM scanner scene ved hjælp af glasstav - scanner lim glasstaven (Se Tabel af materialer). Lad denne tørre i mindst 10 min.
    2. Gøre ~0.1 mm tyk cirkulære stykker af glimmer med en 1,5 mm diameter af stansning dem fra en større glimmerplade. HS-AFM mica-glas stang lim (Se Tabel af materialer) at knytte denne glimmer stykke til glasstav på HS-AFM og tør, urørt i mindst 10 minutter. Kløve lag ved hjælp af en trykfølsomme tape, indtil et godt kløvet lag er set på båndet.
    3. Fortyndes 1 µL af 50 mM APS lager i 99 µL af dd H2O at gøre en 500 µM APS løsning. Indbetal 2,5 µL af denne løsning på frisk kløvet glimmer overfladen og lad functionalize i 30 min.
      Bemærk: For at forhindre udtørring af overfladen, mens functionalizing, fælles landbrugspolitik i et 50 mL konisk centrifugeglas kan passe med et fugtigt stykke filtrerpapir og placeret over scanneren. APS-bestanden er fortyndet 3 gange mindre for flydende billeddannelse end for statisk imaging for at styre dynamik til en sats, der kan observeres med AFM.
    4. Skyl glimmer med 20 µL af dd H2O ved at anvende flere ~ 3 µL skylninger. Fjerne vand helt efter hver skylning ved at placere en ikke-vævede tørre på kanten af glimmer. Efter den sidste skylning, placere ~ 3 µL af dd H2O på overfladen og lad det sidde i mindst 5 min. til at fjerne enhver nonspecifically bundne APS.
  2. Placere sonden i HS-AFM ihændehaver og Placer holderen på stadiet AFM med spidsen opad. Skyl indehaveren bruge ~ 100 µL af dd H2O efterfulgt af to ~ 100 µL skylninger af 0,22 µm filtreret nucleosomes imaging buffer som indeholder 10 mM HEPES pH 7,5 og 4 mM MgCl2.
  3. Med skylninger gjort, fylde salen med ~ 100 µL af nucleosome imaging buffer, sænkes ned i spidsen. Justere positionen cantilever, indtil det er hit med laser. Skyl den APS-glimmer med 20 µL af filtrerede nucleosome imaging buffer, bruger ~ 4 µL pr. Skyl.
  4. Fortyndes 1 µL af nucleosome forsamling bestanden i 250 µL af filtrerede nucleosome imaging buffer for en afsluttende nucleosome koncentration på 1 nM. Indbetal 2,5 µL af denne fortynding på overfladen og lad det sidde i 2 min. Skyl overfladen med ~ 4 µL af nucleosome imaging bufferen to gange. Efter den sidste skylning, efterlade overfladen dækket i imaging buffer.
    Bemærk: Hvis overfladen ikke er skyllet efter deponeringen nucleosome prøven, vil overfladen hurtigt blevet overfyldte.
  5. Indstille scanneren og prøve oven på aflæsse indehaveren, så prøven er ansigt ned. Til at begynde tilgangen, skal du bruge funktionen auto-tilgang med et sæt punkt amplitude, ens tæt på gratis svingning amplitude A0.
    Bemærk: Ideelt set ens = 0,95 en0, men kører på 82% af en0 vil arbejde så godt hvis forsigtig.
  6. Justere sætpunktet, indtil overfladen er godt sporet.
    Bemærk: For at minimere overførslen af energi fra AFM tip til eksemplet nucleosome, amplituden af justerbare bør holdes små med amplituder så lavt som 1 nm optimal.
  7. Sæt billedområdet omkring 150 x 150 nm til 200 x 200 nm med data erhvervelse sats på ~ 300 ms pr. imaging ramme.
    Bemærk: Denne billedstørrelse er normalt tilstrækkelig til at fange dynamikken i flere nucleosomes samtidigt. En mindre befolkede overflade kan kræve ændringer af disse parametre. Den foreslåede framerate er tilstrækkelige til at fange nucleosome dynamics som looping, glidende og udpakning, blandt andre (Se repræsentant resultater afsnittet nedenfor).

7. analyse af Nucleosome Dynamics fanget ved hjælp af Time-Lapse AFM

  1. Konvertere billederne fra HS AFM datatype (.asd) til .tiff billeder.
    1. Flade billeder ved hjælp af AFM system analyse software ved hjælp af enten fly eller linje funktioner, indtil baggrunden har ensartede kontrast.
    2. Indstille billedets kontrast (farveskala) til automatisk.
      Bemærk: Kontrasten kan justeres manuelt til præsentation formål, men ikke til analyse. Dette forårsager højde detaljer vil gå tabt i de konverterede billeder.
    3. Gem den markerede række billeder som en .mov-fil. Fravælg skalalinjen og grænse indstillinger før du gemmer.
      NOTER: Ikke gør analyse på billeder, der har skala barer i rammen. Disse ændre størrelsen af billedet og vil resultere i forkerte målinger.
    4. Konvertere .mov-filen til tiff billeder ved hjælp af en passende software (Se Tabel af materialer). Brug den samme billedfrekvens for konvertering, som blev brugt ved oprettelse af .mov-filen.
  2. Arm længde contour målinger, åbne billederne i en måling software i stand til at denne måling (Se Tabel af materialer).
    1. Angive Billeddimensionerne til at matche dem, hvor den blev erobret.
    2. Måle contour længden af hver nucleosome arm fra enden af armen til midten af nucleosome kernen og optage målingerne i et regneark (figur 4A).
    3. Måle længden af uindpakkede DNA underlaget i rammer, efter en nucleosome ombrydes. Brug denne til en film specifikke kalibrering af nm/bp ratio, som bruges til nucleosome indpakning beregninger
    4. Indsamle to tværsnit profiler for nucleosome kerne og to for den nøgne DNA (figur 4B).
    5. Importere tværsnit profiler til et regneark software og normalisere parceller ved at fratrække den laveste z-værdi fra alle punkter i profilen.
    6. Beregn højden og fuld bredde på halv maksimum (FWHM) for hver tværsnit og gennemsnitlige værdier fra de to profiler for hver ramme.
  3. Trække halvdelen af FWHM værdien fra hver af nucleosome arme er plot som en scatter plot sammen med den beregnede sum af armene.
    1. Beregn den gennemsnitlige kontur længde fra DNA målinger foretaget for DNA i rammer efter nucleosome uindpakket.
    2. Bestemme nm/bp kalibreringsfaktoren ved at dividere betyder kontur længden af den gratis DNA basepar længde af DNA substrat. Brug denne værdi til at beregne nucleosome indpakning i hver ramme, som beskrevet i punkt 5.12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mono-nucleosomes blev første gang forberedes til AFM imaging eksperimenter ved hjælp af en kontinuerlig fortynding forsamling metode (figur 1). Rede nucleosomes blev derefter kontrolleres ved hjælp af diskontinuert SDS-PAGE (figur 2). En glimmer overflade var næste functionalized ved hjælp af APS, som indfanger nucleosomes på overfladen samtidig bevare en jævn baggrund for høj opløsning imaging (figur 3). Nucleosomes blev deponeret på APS-glimmer og blev efterfølgende fotograferet ved hjælp af statisk AFM imaging. Som kontrol for samling og deposition, H3 mono-nucleosomes blev udarbejdet og afbildet ved hjælp af statisk AFM. Et billede af H3 mono-nucleosomes (figur 4A) giver et øjebliksbillede af nucleosome befolkningen, da det eksisterede øjeblikke før deposition, bekræfter, at nucleosomes held blev samlet. 2 nM nucleosome depositionen forudsat en ensartet fordeling af nucleosome og DNA partikler hen over overfladen og meget lidt at ingen fortrængning blev observeret.

Med H3 kontrollen forsamling en succes, var de præsenterede metoder næste anvendes til undersøgelse af CENP-en nucleosomes. Statisk AFM billeddannelse af denne prøve (figur 4B) afslørede, at forsamlingen var en succes. For at påvise påvirkning af nucleosome koncentration på overfladen partikel tæthed, CENP-en nucleosomes blev deponeret på 1 nM (figur 4B), i forhold til 2 nM anvendes til H3 (figur 4A). Dette resulterede i en reduceret overflade partikel tæthed for CENP-en prøve til ca halv H3 prøve. Fra de statiske AFM billeder, højde og drej antallet af mono-nucleosomes blev præget (figur 5). Begge vinklen mellem de frie DNA arme og længden af de gratis DNA våben blev brugt til at bestemme antallet af DNA viser i den individuelle nucleosome.

Time-lapse AFM billeddannelse af nucleosomes i buffer blev brugt til at visualisere den overordnede spontan udpakning opførsel af nucleosomes (figur 6). Måle vinklen mellem nucleosome arme og kontur længden af armene tilladt for tur antallet skal fastlægges i hvert enkelt af rammerne under denne udpakning proces (Fig. 6 B-C). Da tur antallet af nucleosome falder, er et tilsvarende fald i nucleosome kerne volumen også observeret (figur 6 c). High-Speed time-lapse AFM næste brugte sonde mere indviklede nucleosome dynamik, der var savnet ved hjælp af standard time-lapse billeddannelse. Denne teknik evne til at fange dynamikken over en lang periode var afgørende for visualisering af en langdistance translokation af en CENP-en nucleosome kerne (figur 7), som blev erobret i løbet af ~ 1200 rammer. Denne teknik var også kritisk til at fange de sjældne overførsel af en CENP-en nucleosome kerne fra ét DNA substrat til en anden (figur 8). Hurtig image capture sats (~ 300 ms/ramme) muliggjort visualisering af denne dynamiske begivenhed, som det tog kun flere rammer til at fuldføre.

Tabel 1: reagenser behov for kontinuerlig salt gradient nucleosome forsamling. Hver af de viste komponenter er tilføjet til det mikrofuge rør indeholdende oprenset DNA. Dette bør gøres i den rækkefølge, hvori reagenserne, der er angivet i tabellen med vand og NaCl tilsættes først, efterfulgt af H2A/H2B dimer og Histon tetramer tilføjet sidst. Hvis pre foldede Histon octamers der skal anvendes, tilføje på de samme forhold som for tetramer ovenfor. * Vær opmærksom på NaCl indhold i hver af Histon bestande og justere de 5 M NaCl for at tilføje derfor endelige [NaCl] skal være lig med 2M.  (Se tabel over materialer).

Figure 1
Figur 1: Skematisk af sprøjten pumpe bruges til individuel nucleosome forsamling. Forsamling blandingen er positioneret til at være i kontakt med udgangen af sprøjte nål. Som fortyndingen er buffer leveret af sprøjten pumpe til forsamling blandingen koncentration af NaCl er faldet, fremme nucleosome forsamling. Dette tal er tilpasset fra Stumme-Diers mfl. 30 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: SDS-PAGE af forsamlede nucleosomes. Baner 1 og 2 indeholder H3 octamer og CENP-en samling af histoner, henholdsvis. Banerne 3 og 4 indeholder de forsamlede H3 nucleosomes og de samlede CENP-en nucleosomes, henholdsvis. Sammenligning af de samlede nucleosomes til Histon eneste kontrolelementerne i baner, bekræfte, at nucleosomes var korrekt samlet. Tegneserie skematisk over hver lane angiver, hvilke Histon komponenter er til stede. Dette tal er tilpasset fra Stumme-Diers mfl. 30 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skematisk af processen at forberede APS functionalized glimmer til AFM billeddannelse af nucleosomes. (A) et stykke af glimmer ~0.1 mm i tykkelse har begge sider frisk kløvet. (B) kløvet glimmer stykke straks anbringes diagonalt i en kuvette, der indeholder APS løsning og er indstillet til Inkuber i 30 min. (C) følgende the APS functionalization skridt, APS-glimmer stykke overføres til en kuvette, fyldt med dd Hansen2 O til en 30 s skyl. (D) APS-glimmer stykke er gemt i en kuvette indtil brug.   Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: eksempel AFM billeder af H3 og CNEP-A nucleosomes. (A) eksempelbillede af H3 mono-nucleosomes deponeret på APS-glimmer, fanget ved hjælp af statisk AFM. Hver lyse blob er en nucleosome core partikel med regionerne flankerende DNA optræder som noodle-lignende arme. De lange noodle-lignende funktioner er gratis DNA partikler, der ikke er knyttet til en Histon kerne. For dette billede, blev der brugt en 2 nM nucleosome koncentration, giver en ensartet fordeling hen over overfladen, med lidt at ingen fortrængning. (B) denne nucleosome prøve blev deponeret på 1 nM og udfyldes langt mindre end 2 nM anvendes i (A). Dette viser den direkte effekt, der nucleosome fortynding har på den overflade tæthed af nucleosomes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: visuel afbildning af den analyse, der bruges til at karakterisere indpakning og højden af nucleosome partiklerne. (A) A repræsentative nucleosome partikel fra billeder som dem vist i figur 3. Contour længden af hver nucleosome arm er målt fra slutningen af armen til byens kerne (stiplede grønne linjer).  Plotte tværsnit profiler (rød og blå linjer) af en nucleosome producere kurver vist i (B) fra disse kurver, højde og bredde detaljer af partikel kan bestemmes.  (C) skematisk af de forskellige indpakket stater af nucleosomes. (D) hver indpakket tilstand er karakteriseret ved hjælp af vinklen mellem DNA arme, antallet af DNA sving og bp indpakket DNA. Skalalinjen = 20 nm. Dette tal er tilpasset fra Lyubchenko et al. 24 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Eksempel på time-lapse AFM billeder, opfange de spontane udpakning af nucleosomes. (A) A serie af på hinanden følgende AFM billeder af spontan udpakning processen af nucleosomes fanget af kontinuerlig scanning i bufferen. Hver ramme fylder 200 nm og billeder blev taget med en sats på ~ 170 s pr frame. (B) som udpakning processen skrider frem i hver ramme, arm længder af nucleosome stigning, (C) resulterer i et fald i DNA vender rundt i nucleosome. Denne tur antallet kan bestemmes ud fra enten den målte arm længder (sort) eller vinklen mellem nucleosome våben (rød). Da tur antallet falder, en reduktion af nucleosome volumen også er observeret (blå kurve, højre akse). Hver ramme er 200 x 200 nm i størrelse. Dette tal er tilpasset fra Lyubchenko et al. 24 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. Demonstration af højhastighedstog time-lapse AFM høj kapacitet for lang billede erhvervelse gange (A) A galleri af billeder, valgt fra mere end 1200 rammer demonstrere funktionen translokation af en CENP-en nucleosomes kerne. Hvert billede blev taget med en sats på ~ 300 ms/ramme. (B) kontur længde målinger fra den ene ende af DNA substrat til CENP-en kerne der bruges til at karakterisere denne lange translokation proces. Skalalinjen = 25 nm. Dette tal er tilpasset fra Stumme-Diers et al. 16 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8. Eksempel på en dynamisk nucleosome core transfer fanget ved hjælp af højhastigheds time-lapse AFM (figur tilpasset fra Stumme-Diers et al. 16 (A) markerede rammer demonstrerer den spontane overførsel af en CENP-en nucleosome kerne fra ét DNA substrat til en anden. Denne proces fandt sted i flere rammer, som blev fanget med en sats på ~ 300 ms/ramme. (B) en skematisk af overførselsprocessen vist i (A). Skalalinjen = 25 nm. Dette tal er tilpasset fra Stumme-Diers et al. 16 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den protokol, der er beskrevet ovenfor er temmelig ligetil og give meget reproducerbare resultater, selv om et par vigtige spørgsmål kan fremhæves. Functionalized APS-glimmer er en nøglen substrat for at få pålidelige og reproducerbare resultater. En høj stabilitet af APS-glimmer er en af de vigtige elementer i dette substrat, der gør det muligt at forberede den billeddiagnostiske substrat i forvejen for brug, der kan bruges i mindst to uger efter at være forberedt. 59 , 61 men overfladen kan blive beskadiget af dampe af lim hvis det bruges til glimmer montering på metal pucken. Det anbefales derfor, at bruge dobbelte stick tape for glimmer montering som beskrevet i protokol (afsnit 2). I tilfælde når brug af lim er nødvendig, anbefales for eksempel, nogle brugere bruge lim til montering af glimmer på metal diske for billeddannelse i flydende følgende procedure ændres fra den ene beskrevet i afsnit 6.1.3 for prøveforberedelse til HS-AFM imaging . Glimmer er limet til metal disken eller andre solidt materiale og kløvet når limen er størknet. Blæse glimmer med argon at fjerne potentielle dampe af limen. Så glimmer kan være kløvet med en scotch tape og APS glimmer brugsopløsning placeret til at dække frisk kløvet glimmer bånd. Løsningen afhænger af glimmer strimler størrelse. Tillad APS reagere i 30 min. For at minimere fordampning, køre reaktionen i en våd petriskål. Benyt følgende fremgangsmåde: sættetid lab tørre papir og sted er nederst i petriskålen. Placer en 5 mm tyk plast disken på de våde klude og sætte metal disken med limet glimmer på det undgå kontakt med vand i bunden af petriskålen. Efter 30 min, Fjern glimmer/disk samling og grundigt skylle glimmer overfladen med dd vand og pipette som beskrevet i afsnit 6.1.3. Overfladen er klar til at prøve deposition. APS koncentration skal justeres i eksperimenter med DNA, selvom arbejder APS løsning (1: 300) beskrevet i afsnit 2.2 bør være et godt udgangspunkt. I den protokol, der er beskrevet i afsnit 6.1.3 som proceduren for billeddannelse af nucleosomes med HS-AFM er beskrevet, og de tre gange højere koncentration af APS (1: 100) blev brugt.

Protokollen beskrevet er baseret på glimmer functionalization med APS. Dette er den mest robuste, stærkt reproducerbare og enkel procedure. Den eneste ulempe at APS, aminopropyl silatrane er ikke kommercielt tilgængelige. Dog proceduren i APS syntesen er ligetil og protokol for sin syntese er beskrevet i detaljer. 59 hvis proceduren syntese er problematisk, kommercielt tilgængelige reagens, aminopropyltriethoxy silan (APTES) kan bruges til glimmer functionalization (AP-glimmer). Samme avis indeholder protokollen til forberedelse af AP-glimmer ved hjælp af dampe af APTES. Proceduren blev afprøvet og bruges til billeddannelse af topologisk forskellige typer DNA 35,36,50,62,63 og forskellige protein-DNA komplekser herunder nucleosomes. 27 , 50 , 64 ligeledes til APS-glimmer, AP-glimmer er stabil over uger og kan tilberedes i partier på forhånd; AP-glimmer overfladen er så glat som APS-glimmer og temmelig ufølsomme buffer sammensætning, så prøverne kan tilberedes i buffer løsninger med pH værdier op til pH10 og ioniske styrker mellem 1 og 200 mM af NaCl. 59 , 65 den eneste ulempe med brug af AP-glimmer er muligheden for aminopropyl silan at hydrolysere og samle i aggregater på overfladen under time-lapse imaging i vand, selv om denne proces er forholdsvis langsom med de aggregater, der kan være adskiller sig på overfladen, så høj opløsning billeder af DNA kan opnås. 35 hydrolyse af silatrane gruppe er meget langsom, så ingen synlige aggregater er set under langsigtede imaging; 26 , 35 , 56 , 66 , APS-glimmer er derfor at foretrække substratet sammenlignet med AP-glimmer hvis imaging i vand er ansat. For reproducerbarhed ved hjælp af APTES, anbefales destillation af reagenset i forberedelsen af AP-glimmer. Protokol for APTES destillation er beskrevet i papiret 59.

AFM, opererer som et enkelt molekyle teknik, med nucleosome koncentrationer på rækken nanomolar og at nucleosomes kan spontant adskille ved sådanne lave koncentrationer. Ifølge vores oplysninger 25sker dissociation proces i snesevis af minutter tyder på, at stikprøven for AFM undersøgelser bør være forberedt lige før deposition. Nogle vaskemidler som 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS) øge nucleosome stabilitet, så nucleosomes øge deres levetid af flere størrelsesordener 25, men skal gøres brug af vaske-og rengøringsmidler med forsigtighed. Vi viste i 25 , stabilisering af nucleosomes er ledsaget af ændring af sekvens specificitet, så nucleosome selv med brug af en sådan sekvens specifikt motiv som Widom 601 skabelon, samle uden en specificitet af binding til 601 sekvens.

Der er en række vigtige spørgsmål med den foreslåede metode i forhold til andre AFM prøve præparationsmetoder. Først, APS-glimmer og AP-glimmer substrater er stabil over uger og kan tilberedes i partier på forhånd; overfladerne er glatte og ret ufølsom buffer sammensætning så prøverne kan tilberedes i buffer løsninger med pH værdier op til pH10 og ioniske styrker mellem 1 og 200 mM af NaCl. 59 , 65 ingen af de eksisterende metoder passer disse egenskaber. Andet, AFM er et enkelt molekyle teknik og kræver et meget lille udsnit. Den beskrevne protokol opererer med nanoskala mængder af præparatet. Tredje i time-lapse AFM undersøgelser, og HS-AFM dataopsamling er der en betydelig mængde af tid, der kræves til at generere og karakterisere de store datasæt erhvervet. Den metode beskrevet her er velegnet til at analysere hundredvis af AFM billeder.

Prøven forberedelse metode er ikke begrænset til nucleosome type prøver. Men det er ufølsom over for typen af protein-DNA komplekser og er allerede blevet anvendt til en række proteiner anerkende specifikke sekvenser på DNA, fx restriktioner enzymer 67,68,69, enkeltstrenget DNA bindende proteiner 44,45,56,70,71 sammen med komplekse protein systemer involveret i DNA replikation 47,72 og rekombination68,73. Vigtigere, er HS-AFM blevet anvendt til disse systemer at følge dynamikken i disse systemer.  Disse undersøgelser gør det muligt at anvende den udviklede metode til karakterisering af nucleosome arrays som foreslået i og belyse den rolle af sådanne centromer specifikke proteiner som centromer protein B (CENP-B) eller C (CENP-C) i centromer forsamling og forståelse af deres rolle i udviklingen af mange kræftformer33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatter bidrag: YLL og MSD designet projekt; MSD samlet nucleosomes. MSD og ZS udført AFM eksperimenter og data analyser. Alle forfattere skrev og redigeres håndskriftet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Tags

Biokemi spørgsmålet 143 AFM time-lapse nucleosome kromatin dynamics struktur histoner enkelt - molekyle DNA Epigenetik imaging
Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T.,… More

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter