Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

Burada, nucleosome parçacıklar, statik ve hızlandırılmış atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleme teknikleri kullanılarak tek molekül düzeyinde karakterize etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yakalama yapısı ve dinamik oluşturarlar içinde olan yüzey functionalization yöntemi sağlar nano, yüksek çözünürlüklü.

Abstract

Nucleosome alt birimleri uzun bir zincir olan kromatin, DNA ikileşmesi ve transkripsiyonu almaya ökaryotik hücrelerde yer olarak böyle kritik süreçleri için sağlayan dinamik bir sistemdir. Oluşturarlar dinamikleri ve transkripsiyonu makineleri tarafından DNA'yı erişim sağlar ve eleştirel kromatin işlevlerini temel moleküler mekanizmaları katkıda bulunur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) gibi görüntüleme tek molekül çalışmaları önemli ölçüde nucleosome yapısı ve dinamik rolünün geçerli anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Geçerli protokol oluşturarlar yapısal ve dinamik özelliklerini incelemek yüksek çözünürlüklü AFM görüntüleme teknikleri etkinleştirme adımları açıklar. Protokol H3 histon onun muadili şeması protein A (CENP-A) ile değiştirilir şeması oluşturarlar için elde edilen AFM veri tarafından gösterilmektedir. Protokol mono-oluşturarlar sürekli seyreltme yöntemiyle derleme ile başlar. Nucleosome görüntüleme için kullanılan aminopropyl silatrane (APS-Mika) ile functionalized Mika yüzey hazırlanması açıklanan oluşturarlar AFM görselleştirme için önemlidir ve yüzey hazırlamak için yordam sağlanmıştır. APS-Mika yüzeyinde biriken oluşturarlar ilk nucleosome nüfus bir görüntüsünü yakalar statik AFM kullanarak yansıma. Bu görüntülerin analizleri, böyle parametre DNA buna sarılarak oluşturarlar boyutu olarak ölçülebilir ve bu işlem ayrıca ayrıntılı. Sıvı yordamda Imaging hızlandırılmış AFM birkaç çerçeveleri yakalayabilir yüksek hızlı hızlandırılmış AFM için anlatılan nucleosome dinamiği saniyede. Son olarak, dinamik süreçler nicel karakterizasyonu etkinleştirme nucleosome dinamiklerini analiz açıklanan ve resimli.

Introduction

Ökaryotik hücrelerde DNA son derece yoğun ve kromozomlar içine organize olduğunu. 1 ilk DNA organizasyon bir kromozom içinde hangi 147 oluşturarlar derlemede düzeyidir bp DNA'ın histon octamer çekirdek sıkıca sarılmış. 2 , 3 nucleosome parçacıklar son derece kompakt kromozom birimi kurdu kadar hangi sonra düzenlenen bir kromatin dizi oluşturan uzun bir DNA molekülü üzerinde topla. 4 kromatin sökme Gen transkripsiyonu ve genom çoğaltma, kritik hücresel işlemler tarafından gerekli DNA o kromatin son derece dinamik bir sistemdir öne ücretsiz erişim sağlar. 5 , 6 , 7 DNA çeşitli kromatin düzeylerde dinamik özelliklerini anlama moleküler seviyede nerede hatalar hücre ölümü veya kanser gibi hastalıkların gelişimine yol açabilir genetik işlemleri elucidating için kritik öneme sahip. 8 bir kromatin büyük önem oluşturarlar dinamikleri özelliğidir. 9 , 10 , 11 , 12 bu parçacıklar yüksek kararlılık crystallographic tekniklerle yapısal karakterizasyon için izin verdi. 2 ne bu çalışmalar eksikliği oluşturarlar DNA mekanizması gibi dinamik ayrıntılarını histon çekirdeğinden unwrapping vardır; transkripsiyon ve çoğaltma işlemleri için gerekli olan dinamik yoludur. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 Ayrıca, özel proteinler remodeling faktörler olarak adlandırdığı nucleosomal parçacıklar17sökme kolaylaştırmak gösterilmiştir; Ancak, oluşturarlar iç dinamikleri tüm sökme işleminin katkıda bu süreçte önemli faktördür. 14 , 16 , 18 , 19

Tek molekül floresans19,20,21, optik yakalama (cımbız)13,18,22,23 ve AFM gibi tek molekül teknikleri 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 oluşturarlar dinamikleri anlamakta vesile olmuştur. Bu yöntemler arasında AFM birkaç benzersiz ve çekici özelliklerinden yararlanır. AFM bir görselleştirmek ve bireysel oluşturarlar yanı sıra uzun diziler27karakterize etmek izin verir. AFM görüntülerden ölçülen 10,14,26,28nucleosome yapısı DNA buna sarılarak histon çekirdek uzunluğu gibi önemli özellikleri olabilir; nucleosome çıkartıyorum dynamics karakterizasyonu için merkezi bir parametre. AFM olması son derece dinamik sistemleri ve DNA kendiliğinden histon çekirdek14paketini oluşturarlar çalışmalar ortaya koymuştur. Spontan DNA'sı oluşturarlar unwrapping doğrudan görüntüleme sulu çözümler 14,26,29bitince hızlandırılmış modunda çalışan AFM tarafından görüntülenmiştir.

Yüksek hızlı hızlandırılmış AFM (HS-AFM) araçları gelişiyle nucleosome çıkartıyorum işleminin milisaniyelik zaman-ölçek 14,15,24görselleştirmek mümkün kıldı. HS-AFM 16,30 ile ilgili çalışmalar şeması belirli oluşturarlar kurallı türüyle karşılaştırıldığında oluşturarlar çeşitli yeni özellikler ortaya koydu. Şeması oluşturarlar bir şeması, kromozom kromozom segregasyon31için kritik düzeyde önemli küçük bir kısmını oluşturmaktadır. Toplu kromatin içinde kurallı oluşturarlar şeması oluşturarlar histon özünü CENP-A histon histon H332,33yerine içerir. Bu histon sonucu olarak, DNA kaydırma şeması oluşturarlar içinde ~ 120 ikamesidir ~ 147 yerine bp bp için kanonik oluşturarlar; farklı türleri morfoloji şeması ve kurallı oluşturarlar için neden olabilir bir fark daha yüksek dynamics toplu ile karşılaştırıldığında bu şeması kromatin uğrar düşündüren34, diziler. HS-AFM16,30 çalışmalarda şeması oluşturarlar tarafından görüntülenen roman dynamics benzersiz fırsat doğrudan yapısal ve dinamik özelliklerini görselleştirmek için bu tek molekül tekniği ile sağlanan örnekler oluşturarlar. Bu özelliklerinin örnekleri kısaca ele olacak ve kağıdın sonunda resimli. Bu ilerleme roman protokollerde oluşturarlar AFM görüntüleme gibi değişiklikler mevcut yöntemlerden gelişimi nedeniyle yapıldı. Burada açıklanan protokol amacı bu heyecan verici gelişmeler tek molekül AFM nucleosome çalışmalarda bu teknikleri onların kromatin araştırmalarda kullanmak isteyen herkes için erişilebilir hale getirmektir. Açıklanan teknikleri oluşturarlar çalışmanın ötesinde sorunlar için geçerlidir ve diğer protein ve DNA sistemleri ilgi soruşturma için kullanılabilir. Bu tür uygulamalar birkaç örnek yayınları35,36,37,38,39,40,41bulunabilir, 42,43,44,45,46,47,48,49 ve AFM çalışmaların geleceği çeşitli biyomoleküler sistemleri verilen29,50,51,53,54değerlendirmeleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mono-oluşturarlar Meclisi sürekli seyreltme

  1. Oluşturmak ve bir kapalı merkezli Widom 601 nucleosome sıra konumlandırma içeren bir yaklaşık 400 bp DNA substrat arındırmak. 55
    Not: di-oluşturarlar istenmeyen oluşumu sınırlamak için 'her kol kanat konumlandırma sıra' ~ 150 geçmemelidir bp.
    1. Plazmid pGEM3Z-601 tasarlanmış astar ile birlikte kullanın ve substrat DNA PCR kullanarak yükseltmek. Burada kullanılan 122 ve 154 bp kol uzunlukları ile 423 bp substrat için ileri kullanın (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') ve ters (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') astar.
    2. Termal cycler tepki karışıma içeren tüpler 95 ° C'ye ısıtılmış Ekle 33 devredir 95 ° c 30 s denatürasyon 95 ° C, 30 s TAV 49 ° C'de, 35 s uzantısı 72 ° C'de 5 dakika sonra bir ilk denatürasyon için aşağıdaki programı çalıştır 10 dk 33 döngüleri takip için 72 ° C'de son uzantısı ayarla.
    3. Piyasada bulunan PCR arıtma Kit kullanarak PCR karışımı DNA'dan arındırmak. DNA PCR Temizleme sütundan eluting 10 mM Tris arabellek (pH 7.5) elüsyon arabellek sağlanan seti yerine kullanın.
      Not: arabellekleri arıtma adımları arasında aktarmak için ekstra dikkat. Kirlenmiş eluent sorunları neden olabilir aşağı ne zaman DNA toplama ölçüm ve/veya nucleosome derleme karışımı başlangıç tuz konsantrasyonu değiştirebilirsiniz.
  2. 260 saf DNA absorbans ölçerek DNA konsantrasyonu belirlemek nm.
    1. Boş değer UV VIS yalnızca 10 mM Tris pH 7.5 elüsyon tampon kullanarak spektrofotometre üzerinde toplamak. Bir ölçüm saf DNA toplamak.
  3. Konsantrasyon ile belirlenen, 0.6 mL microfuge tüp içine saf DNA aliquot 25 pmol ve çözüm zar zor görünene kadar bir vakum santrifüje yerleştirin; Bu 30 dk 1 h için bir gereksinimdir.
    Not: DNA substrat şimdi nucleosome derleme için hazırdır. Aksi halde, iletişim kuralı burada durdu ve DNA-20 ° C kadar kullanmak depolanan.
  4. 25 pmol buz üzerinde DNA içeren microfuge tüpü yerleştirin ve nucleosome derleme bileşenleri Tablo 1' de listelenen sırada ekleyin. Tüm bileşenleri ekledikten sonra karışımı buz kaldırmak ve oda sıcaklığında (RT) 30 dk için kuluçkaya.
    Not: Stok histon arabellek tuz içeriği ne zaman NaCl hesaplama 2 M son konsantrasyonu elde etmek için gerekli olarak kabul edilir önemlidir. 15 , 56
  5. Oluşturarlar 200 mM sürekli oranı dilüsyonu kullanılarak karışıma 2 M tuz konsantrasyonu azaltarak topla. 57
    1. Bir şırınga içeren 10 mM Tris pH 7.5 sulandırma arabellek 100 µL ile doldurun ve bir enjektör pompası yerleştirin.
    2. Doğrudan şırınga microfuge tüp şapkalı önceden delinmiş bir delikten iğne, iletişim sağlanması (Şekil 1) derleme karışımı ile yapılır.
    3. Enjektör pompa 120 min için 0,75 µL/dk hızında çalıştırın.
      Not: 250 nM oluşturarlar ve 200 mM NaCl elde edilen 100 µL çözüm içerir.
    4. Karışımı 10 K MWCO diyaliz düğmesini aktarmak ve önceden soğutulmuş (4 ° C) düşük tuz arabellek 4 ° C'de 1 saat için 10 mM Tris pH 7.5, 0,25 mM EDTA ve 2.5 mM NaCl, içeren 200 mL karşı diyaliz
  6. Nucleosome derleme histon içeriğini değerlendirmek için % 15 ayıran ve yukarıda açıklanan30istifleme % 6 ile kesintili SDS-sayfa jel hazırlayın.
    1. Aliquot 10-20 µL nucleosome, microfuge tüp için stok ve 4 Laemmli örnek arabellek x 1-2 x çalışma konsantrasyonu için ekleyin. 58
    2. Bir denetim olarak bu hazırlık ayrı microfuge tüp içinde 1-2 µg histon stokunun için yineleyin. Örnekleri için 95 ° C'de ısı ~ 5 dak.
    3. Jel üzerinde birbirlerine bitişik Lanes örnekleri yükleyin. Örnek arabellek bile grup geçişi teşvik etmek için kullanılmayan yolları ekleyin.
    4. Boya açık yığın jel ile taşır kadar jel 65 V çalıştırın. Ayıran jel ulaşıldığında, 150 V artırmak ve boya açık tamamen dışarı jel göç kadar çalıştırın.
    5. Elektroforez birim ortadan kaldırmak ve yavaşça dd H2ile O. dolu bir boyama kapsayıcı jel transfer Nazik ajitasyon ile 5 min için oturup jel izin. İki kez daha fazla taze dd H2O her zaman kullanılan ile bu işlemi tekrarlayın.
      Not: Bu protokol için kullanılan Coomassie leke ( Tablo malzemelerigörmek) Coomassie lekeleri için tipik sabitleme adımları gerektirmez. Başka bir Coomassie hazırlık kullanılıyorsa, sabitleme adımları gereken şekilde ayarlayın.
    6. Son durulama suyu kaldırın ve jel karşılamak için yeterli leke ekleyin. En az 1 h için nazik ajitasyon ile oturup jel izin.
      Not: ajitasyon için boyama konteyner da sıvıyla kaplı jel tutarken jel üzerinde leke hareketi teşvik herhangi bir cihaz üzerinde yerleştirilebilir.
    7. Leke kapsayıcıdan kaldır ve jel dd H2O. Değiştir dd H2O ile durulayın ve nazik ajitasyon ile 30 dk için jel ıslatın. (Jel gibi gösterildiği Şekil 2, histon gruplarından açık ayırmalı görünmesi gerekir.)
  7. 4 ° C'de oluşturarlar kullanmak kadar saklamak.
    Not: Bu koşullarda saklandığında oluşturarlar birkaç ay için kararlı kalır. Protokol burada duraklatılmış.

2. Mika yüzey oluşturarlar statik AFM görüntüleme için functionalization

  1. Bir 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS hisse senedi çözümde deiyonize su açıklandığı şekilde hazırlayın. Bu çözümün kullanım kadar 4 ° C'de 30 mağaza 1 mL aliquots.
    Not:-Ebilmek var olmak stok aliquots 4 ° C'de fazla bir yıl için 59
  2. 15 mL dd H2o 50 mM APS stokunun 50 µL çözülerek Mika değiştirilmesi için çalışan bir APS 1:300 çözüm hazırlamak
    Not: Bu çalışma çözüm birkaç gün için oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
  3. Mika kaliteli Mika sayfalarından ( Malzemeler tablo bkz: burada kullanılan Mika için), 1 x 3 cm şeritler kesin.
    1. Ne zaman çapraz bir küvet içinde konulmak parça uygun onay. İpucu keskin cımbız, traş bıçağı veya bant, her iki taraf taze i ciddi ve parça (Şekil 3A) ~0.1 mm ince kadar Mika katmanları ayırmak için kullanın. Mika parça APS dolu küvet yerleştirin ve yaklaşık 30 dk (Şekil 3B) için kuluçkaya.
  4. Mika parçanın gg H2O ve emmek için 30 dolu bir küvet transfer s (Şekil 3 c). Her iki APS-Mika şeridi bir argon akışı altında kurumasını.
    Not: Bir dokuma olmayan Selüloz ve polyester temiz oda temizleme işlemi (önerilen temizleme malzemeleri konusunda ayrıntılı) su Mika kenarından kurutma zaman esneklik yardım etmek için kullanılabilir.
  5. Kullanım kuru Mika şerit şimdi için örnek hazırlıktır. Aksi takdirde, parça bir temiz, Kuru küvet (şekil 3D) depolar.
    Not: bir vakum 1-2 h için ek depolama ortamı nemli olduğunda önerilir. Protokol burada duraklatılmış.

3. statik AFM görüntüleme için APS-Mika Nucleosome örnekleri hazırlanması

  1. İkiyüzlü yapışkan bant birkaç manyetik adam için geçerlidir ve kenara koyun.
  2. APS-Mika substrat istediğiniz boyuta (burada kullanılan MM AFM araç için 1 x 1 cm kare) kesilmiş. Bu temiz bir kabında alin ve kapalı tutun.
  3. Üç dilutions hazırlamak monte oluşturarlar (son nucleosome konsantrasyonları 0,5, 1,0 ve 2,0 nM) 0.22 µm kullanarak filtre tampon içeren 10 mM HEPES pH 7.5 ve 4 mM MgCl2.
    Not: oluşturarlar düşük son konsantrasyon kaybı sınırlamak için dilutions teker teker ifade APS-Mika üzerinde hemen önce yapılmalıdır.
  4. 5-10 µL seyreltilmiş nucleosome örnek APS-Mika parçanın ortasına de mevduat ve iki dakikalığına kuluçkaya izin. Yavaşça örnek dd H2O tüm arabellek bileşenleri kaldırmak için 2-3 mL ile yıkayın. Dd H2O kullanılan her ~0.5 mL sonra yavaşça aşırı durulama su kaldırmak için mika sallamak.
    Not: Bir tek kullanımlık şırınga için durulama Bu adım önerilir.
  5. Yatırılan örnek temiz argon gazı hafif bir akış altında kuru.
    Not: Örnek yansıması hazır veya bir boşluk kabine içinde saklanabilir veya desiccator argon ile dolu. Hazırlanan ve açıklandığı gibi saklanan örnekleri bir yıl hazırlık kalite kaybı olmadan takip görüntüsü. Protokol burada duraklatılmış.

4. statik AFM oluşturarlar görüntüleme

  1. İpucu sahibi AFM ucuna bağlayın. Bir bahar sabit ~ 40 N/m ve 300 ve 340 kHz arasında bir rezonans frekansı sahip bir ipucu kullanın (bkz. burada kullanılan cantilevers için Malzemeler tablo ).
  2. Madde 3 te örnek yüzey ile değil dikkatli olmak AFM sahne alanı'nda hazırlanan örnek bağlayın.
  3. En yüksek seviyede toplamıdır kadar lazer konsol üzerinde konumlandırın ve sıfır yakınındaki için dikey ve yatay saptırma değerlerini ayarlayın.
  4. Rezonans frekansını bulmak ve sürücü genlik ayarlamak ve görüntü boyutu 100 x 100'e ayarlamak için AFM sonda nağme nm. Yaklaşım başlamak için meşgul düğmesini tıklatın.
  5. Numune yüzeyi açıkça görülür kadar yaklaştı sonra yavaş yavaş genlik Setpoint optimize edin. 1 x 1 µm için tarama boyutu ve 512 x 512 piksel çözünürlüğünü artırın. Resim alma başlamak için meşgul düğmesini tarafından takip yakala düğmesini tıklatın.
    Not: Şekil 4 Albümdeki bu örnekler Imaging zaman beklenebilir düz arka plan gösterir.
  6. Nucleosome örneğini analiz için AFM aletleri analiz yazılımı kullanarak yakalanan görüntüleri açın.
    1. Bir polinom hat çıkarma veya benzer özellik kullanarak Görüntüyü Düzleştir.
    2. En düşük değer için minimum ve maksimum en yüksek değeri yansıtmak için renk tablosunu ayarlayın. Daha sonraki bir adımda gerekli olacak gibi bu değerler her resim için bir kaydını tutmak.
      Not: kesit nucleosome çekirdek eşit yerine değişen yükseklik yaylalar görüneceği şekilde bu değerleri kullanılmazsa, yükseklik verileri daha sonra analiz hatalı olur.
    3. Görüntüyü orijinal boyutunda .tiff görüntü olarak dışa aktarın. Herhangi bir seçenek ile sınır veya ölçek çubuğu görüntü kaydetmek için seçimi kaldırın.
    4. Açık belgili tanımlık imge analiz yazılımı kontur uzunluğu ölçümleri kapasitesine sahiptir.
    5. X, y ve z ayarla ölçekler görüntü aynı.
    6. Bir iç uzunluğu kalibrasyon olarak ölçmek ve ücretsiz DNA'sı bir ucundan diğerine kontur uzunluğu kaydedin. Bu kalibrasyon faktörü için bir çubuk grafik oluşturmak ve bir normal (Gauss) dağılımı ile uygun ölçüleri kullanmak. En yüksek merkezi bölmek (c) x baz çifti substrat boy farkla.
      Not: Bu görüntü belirli dönüştürme faktörünü nanometre gelen DNA baz çiftleri için değerdir.
    7. Ölçmek ve tutarlılık (5A rakam) için çekirdek merkezine ücretsiz kol sonundan itibaren her nucleosome için her iki silah kontur uzunluğu kaydedin.
    8. Her nucleosome çekirdek için toplamak tam iki yarım en fazla (FWHM) değerleri dikey bir çift çekirdek genişlikte (Şekil 5B iki FWHM ölçümler ortalama ve yarım saniyeden her nucleosome kol elde edilen değerden çıkarma kesit ölçüleri için çıkış/giriş DNA gelen çekirdek ölçülen uzunluğu merkezine doğru parçası kol boyu olan değil.
    9. Her kol boyu kol uzunlukları DNA baz çifti içinde elde etmek için hesaplanan kalibrasyon faktörü (adım 4.5.6) bölün.
    10. Nucleosome kol toplamı unwrapped substrat toplam baz çifti uzunluğu üzerinden çıkararak kaydırma DNA ölçüde hesaplayın. Bu değerler bir çubuk grafik arsa ve ortalama kaydırılan baz çifti DNA'ın nucleosome nüfus için elde etmek için normal bir (Gauss) dağılımı ile peak(s) uygun.
    11. Ölçülen kesit ortalama nucleosome yükseklikten hesaplayın. Bu bir çubuk grafik arsa ve nucleosome nüfus yüksekliği elde etmek için normal bir (Gauss) dağılımı ile peak(s) uygun.

5. hızlandırılmış AFM görüntüleme Nucleosome dinamiği

  1. İpucu sahibi AFM ucuna bağlayın. Bir sonda bir bahar sabit yaklaşık 0.1 N/m ve 7-10 kHz bir rezonans frekansı ile kullanılabilir (burada kullanılan cantilevers için malzeme listesi bakın).
  2. 1 x 1 cm biteviye-in APS-Mika Çift sopa şerit kullanarak bir manyetik disk takın ve Pak AFM araç üzerinde monte.
  3. 1 nM konsantrasyonu içeren 10 mM HEPES pH 7.5 ve 4 mM MgCl2bir 0,22 µm filtre uygulanmış görüntüleme arabelleği oluşturarlar sulandırmak.
  4. 5-10 µL seyreltilmiş nucleosome, 2 dk. durulama için mika parçanın Merkezi'nde iki kez 20µL görüntüleme arabelleği ile yatırılan örnek Kasası. Sonra ikinci durulama, arabellek yüzeyi görüntüleme bir damlacık tutun.
  5. Ucu ~ 100-500 kadar ipucu ve yaklaşım yüzeye el ile bulmak için üst-görüş kamerası kullanın yüzeyden µm.
  6. Ek görüntüleme tampon ucu ve yüzey arasındaki boşluğu doldurmak için ekleyin. Örneğin, yaklaşık 50 µL görüntüleme arabellek boşluğu doldurmak yeterli olur. Bir rezonans zirve için belgili tanımlık uç bulmak.
  7. Bilgisayar kontrollü yaklaşım yüzeye başlar. Yaklaştı, düşsel bir ilgi ~ 500 nm alanı seçmek için 1-2 µm alan ile başlar. Seçili ilgi bu alan ile 512 x 512 piksel veri edinme yoğunluğunu ayarlayın.
  8. Ayar noktası gerilimi ayarlamak ve görüntü kalitesini artırmak için genlik parametrelerini sür. 10 ücretsiz genliği nm veya daha az ve ~ 2 Hz tarama hızı kaliteli görüntüler yakalamak için kullanılabilir. Hızlandırılmış AFM kullanarak yakalanan nucleosome dynamics örneği Şekil 6' da gösterilmiştir.

6. yüksek hızlı hızlandırılmış AFM görüntüleme Nucleosome dinamiği

Not: Aşağıdaki protokol Ando grubu (Kanazawa Üniversitesi, Kanazawa, Japonya) tarafından geliştirilen HS-AFM araç için sağlanır. 60

  1. APS-Mika sıvı görüntüleme için hazır olun.
    1. Cam çubuk cam çubuk - tarayıcı tutkal kullanarak AFM tarayıcı sahne alanı'na takın (bkz. Tablo malzeme). Bu kuru en az 10 dakika izin ver.
    2. ~0.1 daha büyük bir mika sayfasından delme tarafından Mika 1.5 mm çapında mm kalın dairesel parçaları olun. HS-AFM Mika cam çubuk yapıştırıcı (cam çubuk HS-AFM ve kuru, en az 10 dakika için el değmemiş bu Mika parça eklemek Malzemeler tablobkz:). Bir de cleaved katman kasette görülür kadar basınca duyarlı bant kullanarak katmanları ayırmak.
    3. Yapmak a 500 µM APS eriyik için dd H2O 99 µL içinde 50 mM APS stokunun 1 µL sulandırmak. Bu çözümün 2.5 µL taze i ciddi Mika yüzey üzerinde mevduat ve 30 dk için functionalize izin.
      Not: functionalizing sırasında yüzey kurutma önlemek için 50 mL konik santrifüj tüpü kap getirilebilir filtre kağıdı nemli bir parçası ile uygun ve tarayıcı yerleştirilir. APS hisse senedi seyreltilmiş 3 kat daha az dynamics AFM ile gözlenen bir oranı için kontrol için statik görüntüleme için sıvı görüntüleme daha için.
    4. Mika dd H2O 20 µL ile birkaç ~ 3 µL durular uygulayarak durulayın. Tamamen Mika kenarında bir dokuma olmayan silin yerleştirerek her durulama sonrasında su kaldırın. Sonra son durulama ~ 3 µL dd H2O yüzeye ve en az 5 dk nonspecifically ilişkili herhangi bir APS kaldırmak için oturmak izin.
  2. Sonda yer HS-AFM tutucu ve sahibi AFM sahne alanı'nda ucu yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. 10 mM HEPES pH 7.5 ve 4 mM MgCl2~ 100 µL dd H kullanarak tutucu2Imaging 0,22 filtre µm oluşturarlar iki ~ 100 µL durular tarafından takip O tampon hangi durulama içerir.
  3. Bitmiş durular ile odası tampon ucu batış, görüntüleme nucleosome ~ 100 µL ile doldurun. Lazer ile düğmelerini tıklatana kadar konsol pozisyonunu ayarlayýn. APS-Mika ~ 4 µL durulama başına kullanarak filtre uygulanmış nucleosome arabellek, Imaging 20 µL ile yıkayın.
  4. Filtre uygulanmış nucleosome 1 son nucleosome konsantrasyon için arabellek Imaging 250 µL içine nucleosome derleme stokunun 1 µL seyreltik nM. Yüzeyde bu seyreltme 2.5 µL mevduat ve 2 dk. durulama için yüzey ile oturmak izin ~ 4 µL arabellek iki kez görüntüleme nucleosome. Sonra son durulama, arabellek Imaging'de kaplı yüzey bırakın.
    Not: Eğer yüzey nucleosome örnek yatırma sonra durulanır değil, yüzeye hızla kalabalık haline.
  5. Yüz aşağı örneğidir inceden inceye gözden geçirmek ve örnek ipucu tutucu üzerine ayarlayın. Yaklaşım başlamak için bir ayar noktası genlik, ücretsiz salınım genlik A0yakıns ile auto-yaklaşım işlevini kullanın.
    Not: İdeal olarak, birs = 0,95 %820 çalışan bir0, ancak, eğer dikkatli de çalışacaktır.
  6. Yüzey de izlenmekte olan edene kadar ayar noktası ayarlayın.
    Not: nucleosome örnek AFM ipucu enerji transferi en aza indirmek için konsol genliği küçük, genlikleri 1 düşük tutulmalıdır nm en iyi.
  7. Görüntü alanı yaklaşık 150 x 150 200 x 200 nm nm ile veri toplama hızı ~ 300 ms çerçeve görüntüleme başına.
    Not: Bu görüntü boyutu birkaç oluşturarlar dinamikleri aynı anda yakalamak için genellikle yeterli olur. Daha az nüfuslu bir yüzey bu parametrelerinde yapılan değişiklikler için çağırabilir. Önerilen kare hızı döngü, sürgülü ve diğerleri (bkz. aşağıda temsilcisi sonuçları bölümü) arasında unwrapping gibi nucleosome dynamics yakalamak yeterli olur.

7. hızlandırılmış AFM kullanarak yakalanan Nucleosome Dynamics Analizi

  1. Görüntüleri HS AFM veri türünden (.asd) .tiff resimlere dönüştürmek.
    1. AFM sistemin analiz yazılımı arka plan üniforma kontrast olana uçak ya da satır işlevlerini kullanarak görüntüleri düzleştirin.
    2. Görüntü kontrastı (renk ölçeği) otomatik olarak ayarlayın.
      Not: Kontrast el ile sunum amaçlı ama analiz için ayarlanabilir. Bu yükseklik ayrıntı dönüştürülmüş Albümdeki kayıp olacak neden olur.
    3. Görüntüler seçili dizi .mov dosya olarak kaydedin. Ölçek çubuğunun seçimini kaldırın ve seçenekleri kaydetmeden önce sınır.
      Notlar: ölçek çubukları çerçevede olabilir görüntüleri analiz yapmak. Bu görüntünün boyutunu değiştirmek ve yanlış ölçümlerde neden olur.
    4. .Mov dosya için uygun bir yazılım kullanarak TIFF görüntüleri dönüştürmek ( Tablo malzemelerigörmek). Aynı kare hızı dönüşüm için .mov dosya oluştururken kullanılan gibi kullanın.
  2. Kol uzunluğu kontur ölçülerini, ölçüm yazılımı bu ölçümü kapasitesine sahiptir görüntüleri açın (bkz. Tablo reçetesi) yazın.
    1. Bu yakalandığı uyum için görüntü boyutlarını ayarlayın.
    2. Her nucleosome kol kol sonundan itibaren nucleosome çekirdek ortasına kontur uzunluğunu ölçmek ve ölçümler bir elektronik tabloda (Şekil 4A) kaydedin.
    3. Bir nucleosome unwraps sonra unwrapped DNA substrat karelerde uzunluğunu ölçmek. Bu hesaplamalar kaydırma nucleosome için kullanılan nm/bp oranı film belirli kalibrasyonu için kullanın
    4. Nucleosome çekirdek için iki kesit profili ve iki çıplak DNA'ın (Şekil 4B) toplamak.
    5. Bir elektronik tablo yazılımı kesit profillerini alma ve araziler profildeki tüm noktalarından en düşük z değeri çıkararak normalleştirmek.
    6. Her kesit için yarım en (FWHM) tam genişliği ve yüksekliği hesaplamak ve her çerçeve için iki profillerinden değerlerin ortalamasını.
  3. Yarısı çıkarma her nucleosome FWHM değerinin silah silah hesaplanmış toplamı ile birlikte bir dağılım çizim olarak arsa vardır.
    1. Ortalama kontur uzunluğu gelen karelerdeki DNA'ın nucleosome açalım sonra yapılan DNA ölçümleri hesaplayın.
    2. Ücretsiz DNA ortalama kontur uzunluğu DNA substrat baz çifti uzunluğu tarafından bölerek nm/bp kalibrasyon faktörü belirlemek. 5.12 bölümünde anlatıldığı gibi nucleosome kaydırma her çerçevede hesaplamak için bu değeri kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mono-oluşturarlar ilk sürekli seyreltme derleme yöntemi (resim 1) kullanarak deneyler Imaging AFM için hazırlanmıştır. Hazırlanan oluşturarlar sonra kesintili SDS-sayfa (Şekil 2) kullanarak kontrol edildi. Mika yüzey sonraki oluşturarlar yüzeyi pürüzsüz bir arka plan için yüksek çözünürlüklü düşsel (Şekil 3) korunarak yakalar APS kullanarak functionalized. Oluşturarlar APS-Mika üzerinde tevdi ve daha sonra statik AFM Imaging'i kullanma görüntüsü. Bir denetim için derleme ve ifade olarak H3 mono-oluşturarlar hazırlanmıştır ve statik AFM kullanarak yansıma. Biriktirme, oluşturarlar başarıyla toplandı teyit anlarıyla varolan gibi H3 mono-oluşturarlar (Şekil 4A) görüntüsünü bir anlık görüntü nucleosome nüfusunun sağlar. 2 nM nucleosome ifade nucleosome ve DNA parçacıkları tekdüze dağılım yüzeyi boyunca sağlanan ve hiçbir kalabalık için çok az görülmüştür.

H3 denetimi derleme ile bir başarı sunulan yöntemleri sonraki CENP-A oluşturarlar çalışma uygulandı. Bu örnek (4B rakam) statik AFM görüntüleme ortaya derleme bir başarı vardı. Nucleosome konsantrasyonu yüzey parçacık yoğunluğu üzerinde etkisini göstermek için CENP-A oluşturarlar 1'de tevdi 2 ile karşılaştırıldığında nM (Şekil 4B), H3 için kullanılan nM (Şekil 4A). Bu CENP-A örnek için bir düşük yüzey parçacık yoğunluğu yaklaşık yarım H3 örnek sonuçlandı. Statik AFM görüntülerden mono-oluşturarlar yükseklik ve sıra numarası ile karakterize (Şekil 5). Ücretsiz DNA silah ve ücretsiz DNA silah uzunluğu arasındaki açı hem bireysel nucleosome DNA sayısı döner belirlemek için kullanıldı.

Arabellekteki oluşturarlar hızlandırılmış AFM görüntüleme oluşturarlar (Şekil 6) genel olarak spontan çıkartıyorum davranışını görselleştirmek için kullanıldı. Nucleosome silah ve sıra numarasının çerçevede çıkartıyorum bu süreçte (Şekil 6 B-C) belirlenmesi izin verilen silah kontur uzunluğu arasındaki açı ölçme. Nucleosome dönüş sayısı azaldıkça, nucleosome temel birim karşılık gelen bir düşüş de (Şekil 6C) görülmektedir. Yüksek hızlı hızlandırılmış AFM sonraki standart hızlandırılmış Imaging'i kullanma cevapsız daha karmaşık nucleosome dynamics soruşturma için kullanıldı. Bu teknik dinamikleri uzun bir süre içinde yakalama yeteneği bir uzun mesafe translocation ~ 1200 kare boyunca yakalandığı bir CENP-A nucleosome çekirdek (Şekil 7) görselleştirme için gerekli. Bu teknik aynı zamanda nadir transferi bir CENP-A nucleosome çekirdek bir DNA substrat başka bir (Şekil 8) yakalama son derece önemliydi. Hızlı görüntü yakalama oranı (~ 300 ms/çerçeve) sadece tamamlamak için birkaç kare götürdüğünde görselleştirme dinamik bu olayın mümkün kılan.

Tablo 1: sürekli tuz degrade nucleosome derleme için gerekli reaktifler. Listelenen bileşenlerin her biri saf DNA içeren microfuge tüp eklenir. Bu sırada reaktifleri ile su tabloda listelenir ve ardından H2A/H2B dimer ve son eklenen histon tetramer Birincisi, NaCl eklenir yapılmalıdır. Önceden katlanmış histon octamers kullanılmak üzere varsa, yukarıdaki tetramer gelince aynı oranında ekleyin. * NaCl her histon hisse senetleri içinde içerik dikkat ve buna göre final [NaCl] 2 M eşit olmalıdır eklemek için 5 M NaCl ayarlayın.  ( Malzemelerin tabloyabakın).

Figure 1
Şekil 1: Microscale nucleosome montaj için kullanılan şırınga pompa şematik. Derleme karışımı şırınga iğne sonu ile temas halinde olacak şekilde konumlandırılır. Seyreltme arabellek nucleosome derleme teşvik NaCl konsantrasyonu azalır derleme karışıma şırınga pompa tarafından teslim edilir. Stumme-Diers ve arkadapte bir rakamdır. 30 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: SDS-sayfa monte oluşturarlar. Şerit 1 ve 2 H3 octamer ve histon, CENP-A Meclisi sırasıyla içerir. Şerit 3 ve 4 birleştirilmiş H3 oluşturarlar ve monte CENP-A oluşturarlar sırasıyla içerir. Lanes, histon tek denetimlere monte oluşturarlar karşılaştırılması onaylamak oluşturarlar düzgün monte. Çizgi film şematik her lane üzerinde hangi histon bileşenler gösterir. Stumme-Diers ve arkadapte bir rakamdır. 30 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: APS hazırlamak için işleminin şematik Mika oluşturarlar AFM görüntüleme için functionalized. (A)Mika ~0.1 mm kalınlığında bir parça taze i ciddi her iki taraf vardır. (B) i ciddi Mika parçanın derhal çapraz APS solüsyon içeren bir küvet içinde yerleştirilir ve 30 dk (C) aşağıdaki APS functionalization adım için kuluçkaya ayarlanır, APS-Mika parçanın gg2 H ile dolu bir küvet transfer edilir O 30 s durulama için. (D) APS-Mika parça kadar kullanmak bir küvet içinde depolanır.   Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: örnek AFM H3 ve CNEP-A oluşturarlar görüntülerini. (A)örnek görüntü H3 mono-oluşturarlar APS-Mika üzerinde statik AFM kullanarak yakalanan, yatırılır. Her parlak blob makarna benzeri silah görünen kanat DNA bölgeleri ile bir nucleosome temel parçacık olduğunu. Histon çekirdek ile ilişkili olmayan ücretsiz DNA parçacıkları uzun erişte gibi özelliklerdir. Bu resim için tekdüze dağılım yüzeyi boyunca hiçbir kalabalık için küçük sağlamış bir 2 nM nucleosome konsantrasyon kullanıldı. (B) bu nucleosome örnek 1'de yatırılır nM ve daha az--dan 2 doldurulur (A) kullanılan nM. Bu nucleosome seyreltme oluşturarlar yüzey yoğunluğu doğrudan etkisini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Ambalaj ve nucleosome parçacıklar yüksekliğini tanımlamak için kullanılan analiz görsel gösterimi. (A) A temsilcisi nucleosome parçacık o şekil 3'te gösterildiği gibi görüntülerden. Her nucleosome kol kontur uzunluğu (noktalı yeşil çizgiler) çekirdek merkeze kol sonundan ölçülür.  Kesit profilleri (kırmızı ve mavi çizgiler) bir nucleosome (B) gösterilen eğrileri bu eğrileri, yükseklik üretmek ve parçacık detayını genişliği belirlenebilir.  (C) şeması çeşitli durumları oluşturarlar sarılmış. (D) sarılı her devlet DNA silah, DNA döner sayısı ve kaydırılan DNA'ın kan basıncı arasındaki açı kullanarak karakterizedir. Ölçek çubuğu = 20 nm. Bu rakam Lyubchenko ve ark. adapte 24 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6. Hızlandırılmış AFM örnek görüntüleri oluşturarlar spontan unwrapping yakalama. (A) A dizi ardışık AFM resmi sürekli arabellekte tarayarak yakalanan oluşturarlar spontan çıkartıyorum sürecinin. Her kare büyüklüğünde 200 nm ve görüntüleri ~ 170 oranında Yakalanan edildi s kare başına. (B) çıkartıyorum işlem olarak DNA düşmesiyle sonuçlanan ilerledikçe her çerçevede, nucleosome artış, (C) kol uzunlukları nucleosome döner. Bu sıra numarası ölçülen kol uzunlukları (siyah) veya nucleosome silah (kırmızı) arasındaki açı belirlenebilir. Dönüş sayısı azaldıkça, nucleosome birim bir azalma (mavi eğri, sağ eksen) da görülmektedir. Her kare olur 200 x 200 nm boyutunda. Bu rakam Lyubchenko ve ark. adapte 24 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7. Yüksek hızlı hızlandırılmış AFM yüksek kapasiteli gösteri için uzun görüntü edinme kere (A) A Galeri CENP-A oluşturarlar çekirdek translocation davranışını gösteren 1200'den fazla çerçevelerden seçili görüntüler. Her resim ~ 300 ms oranında yakalandı/çerçeve. (B) dağılımı uzunluk ölçüleri DNA substrat bir ucunu CENP-A çekirdek bu uzun translocation işlemi tanımlamak için kullanılır. Ölçek çubuğu = 25 nm. Bu rakam Stumme-Diers vd. adapte 16 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8. Yüksek hızlı hızlandırılmış AFM kullanarak yakalanan bir dinamik nucleosome çekirdek transferi örneği (şekil Stumme-Diers vd. uyarlanmıştır Bir DNA yüzey--dan CENP-A nucleosome çekirdek spontan transferini gösteren 16 (a)Seçili çerçeveler. Bu işlem ~ 300 ms oranında ele geçirildi çeşitli çerçeveler içinde gerçekleşti/çerçeve. (B) A (A) gösterilen aktarım işleminin şematik. Ölçek çubuğu = 25 nm. Bu rakam Stumme-Diers vd. adapte 16 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıda açıklanan iletişim kuralı oldukça basit ve son derece tekrarlanabilir sonuçlar, ancak birkaç önemli konular vurguladı sağlar. Functionalized APS-Mika güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar almak için anahtar bir substrat var. APS-Mika yüksek kararlılığını bir görüntüleme substrat önceden hazırlıklı olmak sonra en az iki hafta kullanılabilir kullanmak için hazırlamak izin verir bu substrat önemli özelliklerinden biridir. 59 , 61 metal puck montaj Mika için kullandıysanız ancak, yüzeye Yapıştırıcı buharı tarafından zarar görebilir. Bu nedenle, bu Protokolü (Bölüm 2) açıklandığı gibi montaj Mika Çift sopa şerit kullanmak için tavsiye edilir. Yapıştırıcı kullanımı gerektiğinde, durumlarda örneğin, bazı kullanıcılar tutkallar Mika sıvı, görüntüleme için metal disklerdeki montajı için kullanması bir HS-AFM görüntüleme için örnek hazırlanması için 6.1.3 bölümde açıklanan değişiklik aşağıdaki yordamı önerilir . Mika metal disk ya da diğer sağlam malzeme yapıştırılmış ve sonra tutkal katılaşmış i ciddi. Darbe Mika argonla doldurdum tutkal potansiyel buharlar kaldırmak için. O zaman Mika ile İskoç teyibini i ciddi ve taze i ciddi Mika şerit kapsayacak şekilde APS Mika çalışma çözüm yerleştirilir. Çözüm Mika şerit büyüklüğüne bağlıdır. APS 30 dk için tepki sağlar. Buharlaşma en aza indirmek için bir ıslak kabında tepki çalıştırın. Aşağıdaki yordamı kullanın: emmek laboratuvar silin kağıt ve yer olduğunu Petri kabına alt kısmında. 5 mm kalınlığında plastik disk üzerinde ıslak mendil yerleştirin ve alt kısmındaki Petri kabına su ile temas kaçınarak üzerine yapıştırılmış Mika ile metal disk koymak. 30 dk sonra Mika/disk montaj kaldırın ve Mika yüzey 6.1.3 bölümünde açıklandığı gibi pipet dd su ile iyice durulayın. Yüzey örnek ifade için hazırdır. 2.2 bölümünde açıklanan APS çözüm (1:300) çalışma iyi bir başlangıç noktası olmalı rağmen APS konsantrasyon ile DNA, deneylerde ayarlanması gerekiyor. Açıklanan protokolündeki oluşturarlar HS-AFM ile görüntüleme için prosedür açıklanan 6.1.3 bölümünde, APS (1: 100) üç kat daha yüksek konsantrasyon kullanıldı.

Açıklanan protokol Mika functionalization APS ile temel alır. Bu en sağlam, tekrarlanabilir ve basit bir işlemdir. Tek dezavantajı bu APS, aminopropyl silatrane ticari olarak mevcut değil. Ancak, yordamı APS sentezi basittir ve onun sentezi için protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 59 sentez yordam sorunlu, piyasada bulunan reaktif ise, aminopropyltriethoxy silane (APTES) Mika functionalization (AP-Mika) için kullanılabilir. Aynı kağıt iletişim kuralı için AP-Mika hazırlanması sağlar APTES buharlar kullanarak. Prosedür test ve topolojik farklı türdeki DNA 35,36,50,62,63 ve oluşturarlar dahil olmak üzere çeşitli protein-DNA komplekslerinde görüntüleme için kullanılan. 27 , 50 , 64 benzer şekilde APS-Mika, AP-Mika hafta içinde kararlı ve toplu olarak önceden hazırlanmış olabilir; AP-Mika yüzey APS-Mika olabildiğince sorunsuz ve arabellek oluşturma oldukça duyarsız örnekleri tampon çözeltiler pH10 ve arasında 1 mM ve 200 mM NaCl iyonik güçlü kadar pH değerleri ile hazırlanan yüzden. 59 , 65 AP-Mika kullanımı ile tek dezavantajı hidrolize ve bu işlem olabilir toplamları ile oldukça yavaş olsa da toplamları yüzeyde su, hızlandırılmış görüntüleme sırasında bir araya aminopropyl silane imkanı vardır. yüzeyde seçkin, DNA'ın çok yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde edilebilir. 35 hiçbir görünür toplamları uzun vadeli görüntüleme sırasında görülen silatrane yan hidroliz çok yavaş, bu yüzden; 26 , 35 , 56 , 66 , bu nedenle, Eğer su görüntülemede istihdam AP-Mika ile karşılaştırıldığında tercih edilir substrat APS-Mica piyasaya sürüldü. APTES kullanarak tekrarlanabilirlik için reaktif Distilasyon AP-Mika hazırlanmasında önerilir. İletişim kuralı APTES damıtma için kağıt 59yılında tanımlanmıştır.

AFM, bir tek molekül Teknik olarak nucleosome konsantrasyonları nanomolar aralığı ve o oluşturarlar kendiliğinden böyle düşük konsantrasyonlarda ayırmak ile çalışır. Bizim veri 25göre AFM çalışmaları için örnek sadece ifade önce hazırlanmalıdır düşündüren dakika onlarca ayrılma işlemi gerçekleşir. 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio gibi bazı deterjanlar] -1-propanesulfonate (çocuklar) artırmak nucleosome istikrar oluşturarlar ömürleri birkaç büyüklük 25tarafından artırmak, ama deterjan kullanımı yapılmalıdır dikkatli bir şekilde. Oluşturarlar istikrar sıra özgüllük değişiklik tarafından eşlik ediyor 25 gösterdik, nucleosome bile böyle kullanımı ile sıra böylece Widom 601 şablon olarak belirli motifi, 601 için bağlayıcı bir özgüllüğü monte sıra.

Diğer AFM örnek hazırlama yöntemleri göre önerilen yöntemi ile önemli konular vardır. İlk olarak, APS-Mika ve AP-Mika yüzeylerde hafta boyunca stabildir ve toplu olarak önceden hazırlanmış olabilir; Böylece örnekleri tampon çözeltiler pH10 ve arasında 1 mM ve 200 mM NaCl iyonik güçlü kadar pH değerleri ile hazırlanabilir yüzeyleri pürüzsüz ve arabellek oluşturma oldukça duyarsız. 59 , 65 mevcut yöntemlerden hiçbiri bu özellikleri aynı. İkinci olarak, AFM bir tek molekül teknik ve çok küçük bir örnek gerektirir. Açıklanan protokol hazırlık nano miktarda ile çalışır. Üçüncü olarak, hızlandırılmış AFM çalışmalar ve HS-AFM veri toplama, oluşturmak ve elde büyük veri kümeleri karakterize etmek için gereken süre önemli miktarda olduğunu. Burada açıklanan metodoloji AFM görüntüleri yüzlerce analiz etmek için uygundur.

Örnek hazırlama yöntemi nucleosome türü örnekleri için sınırlı değildir. Oldukça duyarsız protein-DNA komplekslerinde türüne ve belirli dizileri üzerinde DNA, örneğin kısıtlamaları enzimler 67,68,69, tek iplikçikli DNA tanıma bir numara proteinler için zaten uygulanmış proteinler 44,45,56,70,71 karmaşık protein sistemleri DNA çoğaltma 47,72 ' dahil birlikte bağlama ve Rekombinasyon68,73. Önemlisi, HS-AFM bu sistemlerin dinamikleri takip etmek bu sistemleri uygulanmıştır.  Bu çalışmalar nucleosome diziler içinde önerilen olarak karakterizasyonu gelişmiş yöntemler uygulamak ve şeması protein B olarak böyle şeması belirli proteinlerin rolü (CENP-B) veya C (CENP-C) şeması derlemesindeki aydınlatmak olanak sağlar ve birçok kanser33,34gelişimi rolünü anlama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Yazar Katkıları: YLL ve MSD tasarlanan proje; MSD oluşturarlar toplandı. MSD ve ZS AFM deneyleri ve veri analizleri yapılır. Tüm yazarları yazdı ve el yazması düzenlenebilir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Tags

Biyokimya sayı 143 AFM hızlandırılmış nucleosome kromatin dynamics yapısı histon tek - molekül DNA epigenetik görüntüleme
Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T.,… More

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter