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Biology

Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Basic Sciences, Loma Linda University

Summary

Montré ici sont des protocoles d’isolement (1) fraîchement endothélium cérébrales intacts « tubes » et des mesures (2) simultanées de calcium endothéliale et potentiel durant l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium de membrane. En outre, ces méthodes permettent d’avoir écouté pharmacologique du calcium des cellules endothéliales et signalisation électrique comme variables expérimentales individuels ou interactives.

Abstract

Artères cérébrales et leur respectif microcirculation livrent l’oxygène et des nutriments à la régulation du débit du cerveau via le sang. Les cellules endothéliales ligne la lumière des vaisseaux sanguins et les modifications de la commande de diamètre vasculaire au besoin pour répondre à la demande métabolique des neurones. Principales voies de signalisation dépendant de l’endothélium de l’Hyperpolarisation du potentiel de membrane (Vm) et l’oxyde nitrique fonctionnent généralement en parallèle de médiation une vasodilatation et d’augmenter ainsi la circulation sanguine. Bien que partie intégrante de la coordination de vasodilatation au cours de plusieurs millimètres de longueur vasculaire, les composants de l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium (EDH) ont été historiquement difficiles à mesurer. Ces composants d’EDH entraînent intracellulaire Ca2 + [Ca2 +]j’ai augmente ainsi que l’activation subséquente de petit - et intermédiaires conductance Ca2 +-activé K+ (SKCa/IKCa) canaux.

Nous présentons ici une illustration simplifiée de l’isolement des frais endothélium des artères cérébrales de souris ; mesures simultanées d’endothéliales [Ca2 +]i et Vm par photométrie Fura-2 et électrodes pointus intracellulaires, respectivement ; et une superfusion continue de solutions salines et des agents pharmacologiques dans des conditions physiologiques (pH 7,4, 37 ° C). Les artères cérébrales postérieures de la cercle de Willis sont supprimés sans le communiquer postérieur et les artères basilaires. Il facilite digestion enzymatique des segments postérieurs nettoyés d’artériels cérébrales et la trituration subséquente de l’adventice, nerfs périvasculaires et des cellules musculaires lisses. Qui en résulte postérieures cérébrales artérielles endothéliales « tubes » sont ensuite fixés sous un microscope et examinés à l’aide d’une caméra, tube photomultiplicateur, et un ou deux électromètres sous superfusion continue. Collectivement, cette méthode permet de mesurer simultanément variations endothéliales [Ca2 +]i et Vm dans des endroits discrets cellulaires, en plus de la diffusion de l’EDH par l’intermédiaire de jonctions jusqu'à des distances de millimètre le long de l’intact endothélium. Cette méthode est censée produire une analyse de haut-débit des fonctions endothéliales cérébrales qui sous-tendent les mécanismes de régulation du débit sanguin dans le cerveau normal et malade.

Introduction

Le débit sanguin dans le cerveau est réglementé par la coordination de la vasodilatation des artères cérébrales et les artérioles dans réseaux vasculaires1. Cellules endothéliales tapissant de résistance cérébral artères commande changements de diamètre vasculaire au besoin afin de répondre à la demande métabolique des neurones1,2,3. En particulier, au cours de l’Hyperpolarisation dérivé de l’endothélium (communément appelé EDH), intracellulaire Ca2 + ([Ca2 +]i) et signalisation électrique dans les cellules endothéliales vasodilatation coordonnée entre les cellules endothéliales et leur cellules musculaires lisses environnantes par jonctions lacunaires pour relaxation artérielle4. Ouverture physiologique d’EDH implique séquentielle stimulation de Gq-récepteurs couplés (RCPG), une augmentation de [Ca2 +]iet activation endothéliale petit - et intermédiaire-Ca2 +-activé K+ (SKCa/IKCa) canaux pour hyperpolarisent membrane endothéliale cérébrale potentielle (Vm)5,6,7. Ainsi, la relation intime entre endothéliales [Ca2 +]i et Vm est partie intégrante de la régulation du débit sanguin et indispensables à la cardio - et cérébrovasculaires fonction6,8. Tout au long de la littérature plus large, de nombreuses études ont signalé à l’association de la dysfonction endothéliale vasculaire avec le développement des maladies chroniques (p. ex., hypertension, diabète, insuffisance cardiaque, maladie coronarienne, l’insuffisance rénale chronique, la maladie artérielle périphérique)9,10, ce qui indique l’importance d’étudier la fonction endothéliale dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Endothélium vasculaire fait partie intégrante de la production de l’Hyperpolarisation, vasodilatation et perfusion tissulaire et l’examen de ses propriétés cellulaires natives est donc cruciale. Comme un modèle d’étude générale, préparation du modèle souris tube endothélium artériel a été publiée avant pour le muscle squelettique11,12,13de tube digestif, poumon14et, récemment, pour le cerveau6. Études de simultanée [Ca2 +]i et Vm mesures en particulier ont été publiées pour le muscle squelettique endothélium artériel15,16 comme vaisseau lymphatique endothélium17. En plus des études primaires utilisant l’approche le tube endothéliale, un examen approfondi de ses avantages et ses inconvénients8 peut être consulté pour déterminer si cet outil expérimental est approprié pour une étude spécifique. En bref, un avantage est que les composantes physiologiques clés de la fonction des cellules endothéliales sont retenus (p. ex., influx de Ca2 + , et intracellulaire, l’Hyperpolarisation des Vm atteignant le potentiel de Nernst pour K+ par l’intermédiaire SKCa/IKCa activation et endothéliales couplage intercellulaire via les jonctions lacunaires) sans confusionnelles comme entrée de nerfs périvasculaires, fonction de muscle lisse les canaux voltage-dépendants et la contractilité, circulation du sang et les influences hormonales8. En revanche, approches de la culture cellulaire couramment utilisés introduisent des changements significatifs dans la morphologie18 et ion channel expression19 d’une manière qui peut obscurcir grandement les comparaisons avec les observations physiologiques déterminées ex vivo ou in vivo. Limitations incluent un manque d’intégration avec d’autres composants essentiels de régulation de la circulation sanguine, telles que les muscles lisses et une flexibilité limitée dans une planification expérimentale, que ce modèle est testé idéalement moins de 4 h d’isolement segment vasculaire intact de l’animal.

Construction d’un protocole vidéo précédent écrit par Socha et Segal12 et récents développements expérimentaux dans le provisoire6,15,16, nous démontrons par les présentes l’isolement de l’endothélium frais de les artères cérébrales postérieures et des mesures simultanées d’endothéliales [Ca2 +]i et Vm par photométrie Fura-2 et électrodes pointus intracellulaires, respectivement. En outre, cette expérience comporte superfusion continue de solutions salines et agents pharmacologiques dans des conditions physiologiques (pH 7,4, 37 ° C). Nous avons choisi l’artère cérébrale postérieure, car il donne endothélium isolé avec l’intégrité structurale (cellules couplés à travers les jonctions lacunaires) et dimensions suffisantes (largeur ≥ 50 µm, longueur ≥300 µm) se prête pour intra - et intercellulaires de signalisation le long et parmi cellules endothéliales. En outre, les études de l’artère cérébrale postérieure rongeur sont largement représentées dans la littérature et englobent l’examen des mécanismes de signalisation endothéliales fondamentales, développement/vieillissement vasculaire et pathologie20, 21 , 22. cette application expérimentale devrait donner une analyse de haut-débit de la fonction endothéliale cérébrale (et dysfonctionnement) et permettra ainsi des progrès importants dans la compréhension de la régulation du débit sanguin dans l’ensemble vieillissement et le développement de maladies neuro-dégénératives.

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Protocol

Avant d’effectuer les expériences suivantes, s’assurer que tous les soins des animaux utilisent et protocoles sont approuvées par l’animalerie institutionnels et utiliser Comité (IACUC) et interprétés en accord avec le Conseil National de recherches " "Guide pour le soin et l’utilisation de Les animaux de laboratoire" " (8ème édition, 2011) et les directives de l’arrivée. L’IACUC de l’Université de Loma Linda a approuvé tous les protocoles utilisés pour ce manuscrit pour souris C57BL/6 mâles et femelles (tranche d’âge : 3 à 30 mo).

1. matériel et matériaux

Remarque : Détails du matériel requis pour le protocole se trouvent dans la Table des matières, les réactifset les manuels ou les sites Web liés avec les fournisseurs respectifs.

  1. Chambre à flux
    1. Fixez une chambre superfusion avec un fond de lamelle de verre dans une plate-forme en aluminium anodisé. Sécuriser la plate-forme avec chambre en une scène compact en aluminium.
    2. Définissez un micromanipulateur à chaque extrémité de la plate-forme sur la scène de l’aluminium pour la tenue de la pipette épinglage.
      Remarque : Comme une option pratique, utiliser cet appareil stade transférable avec une unité de chambre de flux sécurisée afin de faciliter la transition de l’isolement du tube endothélial aux performances des expériences.
  2. Microscopes
    1. Utilisation stéréomicroscopes (5 x à 50 plage de grossissement x) équipé de sources de lumière fibre optique pour les procédures de macro - et micro-dissection.
    2. Pour la préparation des tubes endothéliales, utiliser un microscope inversé équipé phase contraste ou différentiel interférences contraste (DIC) compatibles objectifs (10 x, 20 x et 40 x) et un stade d’aluminium.
    3. Pour isoler les tubes endothéliales de vaisseaux partiellement digérées, placer un contrôleur de pompe microseringue adjacent à l’appareil de préparation de tube endothéliale.
    4. Pour l’appareil expérimental, utiliser un microscope inversé équipé d’objectifs standards (4 x et 10 x) en plus des objectifs fluorescents (20 x et 40 x, ouverture numérique 0,75) et une étape manuelle en aluminium sur une table d’isolement de vibration.
  3. Matériel d’enregistrement intracellulaire
    1. Pour enregistrer le Vm des cellules endothéliales en tubes endothéliales isolées, connectez l’électromètre pour le préamplificateur compatible. Si nécessaire, connecter un générateur de fonctions ou stimulateur à l’électromètre pour expériences nécessitant une injection de courant.
    2. Connecter les sorties de l’amplificateur à un système d’acquisition de données, les moniteurs de référence sonore et un oscilloscope. Fixer l’électrode de référence (Ag/AgCl pellet) près de la sortie de chambre de flux au cours d’expériences.
    3. Utiliser un système photométrique avec composants intégrés de fluorescence système interface, haute intensité lampe à arc et la puissance d’alimentation, hyperswitch, tube photomultiplicateur (ou PMT) et la caméra à mesurer [Ca2 +]i dans les cellules endothéliales.
    4. Utiliser un contrôleur de température équipé électrique inline pour augmenter et maintenir une température physiologique (37 ° C) tout au long de l’expérience.
    5. Utiliser une plateforme de six-réservoir connectée à un contrôleur de vanne avec un régulateur de débit en ligne pour contrôler la distribution de solutions respectives au tube endothélial attaché dans la chambre.
  4. Micropipettes et électrodes pointus
    Remarque : Pour fabriquer des pipettes pour la trituration et la stabilisation mécanique des tubes endothéliales isolés, utiliser un extracteur électronique pour tirer les pipettes et un micro-forge pour briser et feu de polissage.
    1. Pour séparer l’adventice, muscle lisse et le tube endothélial du segment artériel partiellement digéré, trituration pipettes (chacun avec un diamètre interne de 80 à 120 µm) le cas échéant, à l’aide de tubes capillaires en verre borosilicaté, de préparer et de feu polir le bout.
    2. Pour fixer le tube endothélial contre le fond de la chambre superfusion, utilisez épinglage pipettes avec une fin mitigée, sphérique (chaleur-poli, OD de 100 – 150 µm ; préparé à partir de tubes en verre de borosilicate de mince-mur).
    3. Pour enregistrer le Vm d’une cellule endothéliale, préparer des électrodes pointus avec une résistance à la pointe de ~ 150 ± 30 MΩ de tubes capillaires de verre à l’aide d’un extracteur électronique.

2. préparation des Solutions et des médicaments

  1. Solution saline physiologique (PSS)
    1. Pour une expérience avec les préparations médicamenteuses, préparer un minimum de 1 L de l’utilisation de PSS : 140 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl2, 5 mM 1 mM MgCl2, 10 mM de l’acide N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic (HEPES) et 10 mM de glucose.
    2. Pour préparer les solutions requises pour la dissection, isolement de l’artère cérébrale et la préparation du tube endothéliale, préparer des PSS manque CaCl2 (zéro Ca2 + PSS).
    3. Préparer toutes les solutions en ultrapure désionisée H2O, ajuster le pH à 7.4, les stériliser à travers un filtre (taille des pores 0,22 µm) et s’assurer que l’osmolalité des solutions est entre 290 et 300 mOsm.
      Remarque : Des solutions peuvent être stockées à 4 ° C pendant environ deux semaines.
  2. 10 % d’albumine sérique bovine (BSA)
    1. Pour préparer les 10 % de BSA, dissoudre 1 g de la poudre lyophilisée dans un bécher de 10 mL zéro Ca2 + PSS.
    2. Couvrir le bécher avec le film de paraffine et accorder un délai de plusieurs heures à passer, sous agitation lente pour le BSA à dissoudre.
    3. Filtrer la solution finale à l’aide d’une seringue de 10 mL ainsi qu’un filtre de 0,22 µm et faire des parties aliquotes 1 mL doivent être conservés à-20 ° C.
  3. Solution de dissection
    1. Pour préparer 50 mL de solution de dissection, ajouter 500 µL de BSA (10 %) à 49,5 mL de zéro Ca2 + PSS.
    2. Immédiatement après la préparation, transvaser cette solution de dissection dans une boîte de pétri pour dissection artérielle.
  4. Solution de dissociation
    1. Pour préparer 50 mL de solution de dissociation, ajouter 5 µL de CaCl2 (1 M) et 500 µL de BSA (10 %) à 49,5 mL de zéro Ca2 + PSS. Laissez la solution reposer à température ambiante (RT).
  5. Enzymes
    1. Pour une digestion partielle des segments artériels, préparer 1 mL de solution de digestion avec la papaïne 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioérythritol, collagénase de 0,75 mg/mL (mélange de Type H) et l’élastase 0,13 mg/mL.
      Remarque : L’activité enzymatique peut varier ; Cependant, pour nos protocoles réussies, activités enzymatiques fourni dans le commerce ont servi comme suit : papaïne ≥ 10 unités/mg ; collagénase ≥ 1 unités/mg, N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala ou FALGPA chiffre de substrat ; et l’élastase ≥ 5 unités/mg.
  6. Préparation de Fura-2 et les Agents pharmacologiques
    1. Préparer le stock concentration (1 mM) de Fura-2 teinture AM dans le DMSO. Préparer une travail concentration (10 µM) en ajoutant 5 µL de stock à 495 µL de PSS pour le chargement.
    2. Préparer ≥ 50 mL de travailler des concentrations d’agents pharmacologiques (par exemple, ATP) de PSS selon le cas.
  7. Réalisation de Solution
    1. Préparer la réalisation d’une solution 2 M KCl, en dissolvant le KCl en désionisée H2O (7,455 g KCl 50 mL H2O).
    2. Filtrer la solution avec une seringue-filtre de 0,22 µm avant de remblayer les électrodes pointus.
  8. Iodure de Propidium (0,1 %)
    1. Dissoudre 10 mg d’iodure de propidium lyophilisée dans 10 mL de KCl à 2 M.
    2. Bien mélanger et conserver à température ambiante.

3. dissection et l’isolement de l’artère cérébrale

Remarque : Toutes les procédures de dissection obliger grossissement spécimen (jusqu'à 50 x) via stéréomicroscopes et éclairage fournis par des sources lumineuses à fibre optique. Pour exécuter les procédures de dissection pour l’isolement du cerveau et des artères, utiliser des instruments de dissection aiguisé. Outils de microdissection d’isoler et de nettoyer les artères incluent aiguisé à pointe fine pince et ciseaux de Vannas style dissection (lames de 3 à 9. 5 mm).

  1. Isolement du cerveau de souris
    1. Anesthésier une C57BL/6 souris (3 à 30 mois vieux, hommes ou femmes) par inhalation d’isoflurane (3 % pour les 2-3 min), puis décapiter l’animal immédiatement après l’induction de l’anesthésie complète. Placez la tête dans une boîte de pétri (diamètre 10 cm, profondeur 1.5 cm) contenant froid (4 ° C) zéro Ca2 + PSS sous un stéréomicroscope.
    2. Regarde un au microscope, enlever la peau et les cheveux sur le crâne et enlever excessive de sang froid zéro Ca2 + PSS. Faites une incision en utilisant seulement le bout des ciseaux de dissection standard (p. ex., lame de 24 mm), à partir de l’OS occipital et s’étendant vers le haut à travers l’OS nasal du crâne.
    3. Ouvrir le crâne soigneusement le long de l’incision à l’aide de forceps à pointe de grossier et séparés du tissu conjonctif d’isoler le cerveau avec un cercle de Willis intact.
      Remarque : Par ailleurs, pince coupe osseuse Littauer peut être utilisé pour ouvrir le crâne et exposer le cerveau.
    4. Laver délicatement le cerveau isolé de froid zéro Ca2 + PSS dans un bécher pour enlever le sang. Placez le côté ventral de cerveau vers le haut dans une chambre contenant une solution froide de dissection pour l’isolement des artères cérébrales (Figure 1 a).
  2. Isolement des artères cérébrales
    Remarque : L’artère cérébrale postérieure a été sélectionné comme un modèle d’étude endothéliale vasculaire cérébrale représentative de ce protocole.
    1. Sécuriser le cerveau isolé dans une solution froide de dissection à l’aide de goupilles en acier inoxydable (diamètre 0. 2 mm, longueur environ 11-12 mm) à insérer dans un polymère charcoal infusé silicium enduit de fond d’un verre de pétri (profondeur ≥ 50 cm).
    2. Pour maintenir une température réfrigérée du PSS au cours de la dissection, utiliser une chambre de dissection refroidie par un système réfrigérant cyclisme en permanence un mélange de 1:1 eau-éthylène glycol. Par ailleurs, la dissection peut être effectuée sur glace fraîche.
    3. Isoler chirurgicalement l’artères cérébrales postérieures (~0.3 aux segments de 0,5 cm, aucune traction axiale) du communiquer postérieur et les artères basilaires à l’aide de ciseaux de style Vannas microdissection instruments et aiguisée à pointe fine pince (Figure 1 b ). Utilisez des broches en acier inoxydable (diamètre de 0,1 mm, longueur environ 13-14 mm) pour sûr tous deux isolement des artères cérébrales postérieures dans la solution de dissection dans la boîte de pétri (Figure 1).
    4. Nettoyer soigneusement les artères cérébrales postérieures isolées en enlevant du tissu conjonctif avec une pincette de pointu affûté (Figure 1). Couper les artères intactes en segments (longueur 1 à 2 mm) pour la digestion enzymatique (Figure 1; en médaillon).

4. préparation du Tube endothéliale et Superfusion

Remarque : Le tube endothélial est préparé comme décrit plus haut12, sous réserve de modifications de l' artère cérébrale6.

  1. Préparez l’appareil de trituration à l’aide d’un microscope équipé d’objectifs (10 x, 20 x et 40 x), une caméra et un stade d’aluminium tenant une chambre et des micromanipulateurs. Fixer une microseringue avec un régulateur de pompe à côté de la scène et l’échantillon (Figure 2 a).
  2. Complètement remblayer une trituration pipette d’huile minérale et fixez-le sur le piston de la seringue à injection. Puis, à l’aide de la seringue à injection avec régulateur de la pompe, retirer la solution de dissociation dans la pipette (~ 130 nl) sur le dessus de l’huile minérale, tout en s’assurant de l’absence de bulles d’air dans la pipette.
  3. Placer les segments artériels intacts dans 1 mL de solution de dissociation dans un tube de verre de 10 mL (Figure 2 b), contenant de la papaïne 0,31 mg/mL, 0,5 mg/mL dithioérythritol, collagénase de 0,75 mg/mL et élastase 0,13 mg/mL. Incuber à 34 ° C pendant 10 à 12 min pour la digestion partielle.
  4. Après la digestion, remplacez la solution enzymatique avec environ 5 mL de solution de dissociation fraîches. À l’aide d’une pipette 1 mL, transférer un segment dans une chambre contenant la solution de dissociation à température ambiante.
  5. Placez la pipette dans la solution de dissociation dans la chambre et placez-la à proximité d’une des extrémités du navire digérée. Fixer un taux dans la fourchette de 2 à 5 nL/s sur le contrôleur de pompe pour la trituration douce (Figure 2; en médaillon).
  6. Tout en regardant à travers 100 x de grossissement x 200, retirer et éjecter le segment artériel pour dissocier les cellules musculaires lisses tout en produisant un tube endothélial. Si nécessaire, utilisez soigneusement à pointe fine pince pour séparer le tube endothélial adventice dissociée et limitante élastique interne. Confirmer que toutes les cellules musculaires lisses sont dissociées et que les cellules endothéliales seulement restent comme un « tube » intact (Figure 2).
  7. À l’aide de micromanipulateurs, fixez chaque extrémité du tube endothélial sur la lamelle de verre de la chambre superfusion à l’aide de verre borosilicaté épinglage pipettes (Figure 2D).
  8. De wash-out dissocié adventice et cellules musculaires lisses de la chambre et de remplacer la solution de dissociation avec 2 mM CaCl2 PSS. Le transfert de la plate-forme mobile avec garanti endothélial tube sur le microscope de rig superfusion et expérimentale.
  9. Utilisez 6 réservoirs propre 50 mL (Figure 3 a) de débit continu du PSS et solutions respectives pharmaceutique pendant l’expérience, le cas échéant. Le régulateur de débit en ligne permet de régler manuellement le débit dans l’ensemble comme compatible avec les hottes à flux laminaire tout en faisant correspondre les flux d’alimentation sur l’aspiration sous vide. Livrer les PSS pour la chambre (Figure 3 b) pour la surfusion du tube endothélial pour ≥ 5 min avant d’enregistrer les données de base et colorant chargement.

5. colorant charge, Wash-Out et les réglages de température

  1. Allumez tous les composants du système de mesure [Ca2 +]j’aiphotométrie. Utiliser le microscope sur la plate-forme expérimentale (Figure 3) pour visionner le tube endothélial à un grossissement de x 400 et de se concentrer sur les cellules dans la fenêtre photométrique en utilisant la suite logicielle de photométrie système.
  2. Mesurer le diamètre du tube endothélial et d’enregistrer des valeurs de fond autofluorescence en accord avec 510 550nm, émission au cours de l’excitation alternative à 340 et 380 nm (≥ 10 Hz).
  3. Pour mesurer [Ca2 +]j’ai les réponses, charge le tube endothélial avec Fura-2 me teindre (concentration finale de 10 µM) à ta et laisser environ 30 à 40 min en l’absence de lumière.
  4. Redémarrez superfusion du tube endothéliale avec frais PSS pour ~ 30-40 min de wash-out colorant en excès et laissez intracellulaire Fura-2 AM à estérifier hors. Au cours de la période, augmentez la température progressivement de RT à 37 ° C, en utilisant le régulateur de température (Figure 3 a) avec un appareil de chauffage en ligne, puis maintenir à 37 ° C tout au long de l’expérience.
    NOTE : La transition progressive recommandée entre RT à 37 ° C comporte trois étapes (p. ex., 5 ° C) avec un temps d’équilibrage ≥ 5 min à chaque étape.

6. mesure simultanée de [Ca2 +]i et Vm

  1. Mettez tous les autres matériels et la suite logicielle électromètre pour mesurer Vm (voir Figure 3, Figure 4). Ajuster en conséquence les taux d’acquisition de données (≥ 10 Hz).
  2. Tirez une électrode pointu et remblayer avec 2 M KCl. Pour l’étude des intercellulaires couplage via le transfert de teinture, remblayage des Microélectrodes avec l’iodure de propidium 0,1 % dissous dans 2 M KCl.
  3. Fixer les électrodes sur un fil d’argent recouvert de chlorure dans le porte-pipette attaché à un stade de tête électromètre sécurisé avec un micromanipulateur. Utilisez le micromanipulateur pour brièvement positionner la pointe de l’électrode dans le SSP qui coule dans la chambre tout en regardant à travers l’objectif 4 x.
  4. Le repos Vm 0 comme compatible avec la mise à la terre bain valeur potentielle. Positionner la pointe de l’électrode un peu plus d’une cellule du tube endothéliale. Si vous le souhaitez, utiliser les moniteurs de référence sonore liés à électromètres à associer son pitch éventuels enregistrements.
  5. Augmenter le grossissement 400 x en utilisant l’objectif 40 x et re-positionner la pointe de l’électrode au besoin. Ajuster la fenêtre photométrique en utilisant le logiciel photométrie de se concentrer sur les cellules endothéliales ~ 50 à 80.
  6. Doucement, placer l’électrode dans une des cellules du tube endothélial utilisant le micromanipulateur et attendre moins 2 min pour le repos de Vm stabiliser. De même, insérez une seconde électrode dans une autre cellule (distance ≥100 µm) de la première cellule empalée avec première électrode.
  7. Une fois que Vm de repos est stable à ses valeurs attendues (-30 à -40 mV)6, tournez sur la PMT sur l’interface de fluorescence en l’absence de lumière et commencent acquisition d’intracellulaire [Ca2 +]i par passionnant Fura-2 en alternance (10 Hz) à 340 et 380 nm, tout en collectant des émission de fluorescence à 510 nm.
    Remarque : Pour tester le couplage électrique intercellulaire, actuel (± 0,5-3 nA, durée d’impulsion de ~ 20 s) peuvent être livrés via un électromètre comme « Site 1 », et modifications de Vm peuvent être enregistrées avec un autre électromètre comme « Site 2"(distance ≥100 µm).
  8. Une fois que des mesures simultanées de Vm et [Ca2 +]j’ai sont établis, laisser ~ 5 min pour superfusion endothéliales tube avec PSS à un débit constant laminaire avant application de médicaments.
  9. Appliquer le médicament (p. ex., ATP) préparé en PSS à la chambre superfusion avec le débit constant. Après environ 3 min (ou une période de temps appropriée pour la cinétique du médicament), lavage avec PSS jusqu'à Vm et le F/f340380 ratio retournent à leur état initial. Tracez enregistrements respectifs comme dans le temps synchronisé à travers les suites logicielles photomètre et électromètre pendant chaque période de transition de solutions.
  10. Une fois l’expérience est terminée, retirer les électrodes de la cellule en utilisant le micromanipulateur et notez Vm ~ 0 mV tel que référencé par l’électrode de bain. Arrêter les enregistrements respectifs de Vm et [Ca2 +]j’ai et enregistrer les documents au dossier d’analyse des données.

7. visualisation du couplage de la cellule-cellule

  1. Pour visualiser le couplage de la cellule-cellule via l’iodure de propidium, utiliser un x 40 ou 60 x, objectif fluorescent avec une ouverture numérique relativement élevée (p. ex., 0.95) et filtre rhodamine sertie d’éclairage à semi-conducteurs, une caméra à haute résolution (p. ex. 16- millions de pixels) et une suite de logiciels d’imagerie.

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Representative Results

La démonstration schématique du protocole décrit ci-dessus est indiquée dans les figures ci-jointe. Un cerveau isolé de l’adulte jeune souris C57BL/6N mâle (5 mois) est montré dans la Figure 1 a. Les artères cérébrales postérieures sont soigneusement isolés depuis le cercle de Willis, enlevé sans tissu conjonctif et coupées en segments (Figure 1 b-D). De segments artériels partiellement digérées, le tube endothélial intact est produit et sécurisé sur la lamelle de verre à l’aide de pipettes épinglage. Doux étirement mécanique est appliquée à l’aide de deux pipettes de brochage pour approximer la longueur linéaire d’in vivo sans tortuosité de navire. Cela a été précisé dans le manuscrit (Figure 2 a-D). Endothéliales tubes isolés des artères cérébrales postérieures sont ~ 90 – 100 µm de largeur et ≥300 µm de longueur. Le tube est chargé avec Fura-2 suis suivie de wash-out avec PSS. Mesure simultanée de [Ca2 +]i et Vm dans le tube endothélial est effectuée par photométrie de Ca2 + ainsi que forte d’électrophysiologie de l’électrode (plate-forme expérimentale illustré à la Figure 3 et Figure 4).

Évaluation fonctionnelle du tube endothéliale est réalisée par un agoniste GPCR endothélial classique tels que l’ATP dans la chambre de flux dans des conditions physiologiques. Comme illustré à la Figure 5, [Ca2 +]i et Vm sont enregistrés simultanément en réponse à l’ATP (100 µM). Une Hyperpolarisation significative de Vm (≥ 5 mV) produit simultanément avec une intracellulaire [Ca2 +]j’ai augmentation, ce qui indique que [Ca2 +]j’ai une élévation active SKCa/IK canauxCa et permet ainsi à efflux de K+ à travers la membrane de plasma pour produire l’EDH. Preuve du couplage intercellulaire à l’aide d’injection de courant (± 0,5 à 3 nA, ~ 20 s Pulse) se trouvent dans nos travaux récemment publiés (référence6, Figure 1). Notez que l’iodure de propidium a une masse de Da ~ 668 en ce qui concerne les seconds messagers connu pour passant par jonctions tels que de l’inositol trisphosphate (IP3, ~ 420 Da), adénosine monophosphate cyclique (AMPc, Da ~ 329).

Figure 1
Figure 1 : Isolement de l’artère cérébrale du cerveau de. (A) cerveau isolé avec des artères intactes (flèche blanche indique l’artère cérébrale postérieure) dans une solution dessection. (B) Magnified découvre de l’artère cérébrale postérieure (flèche blanche ; ~ 3 x vs. Groupe A). (C) isolée postérieures artères cérébrales fixés avec des épingles en acier inoxydable dans plat de spécimen. (D) postérieur des artères cérébrales, après le retrait des tissus conjonctifs. Encart montre des segments coupés des artères ; Echelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Préparation du tube endothélium cérébral. (A) équipement utilisé pour qui triturent les segments artériels partiellement digérés ; un = micromanipulateur, b = chambre de préparation de tube, c = stade aluminium, d = microseringue, e = microscope, f = régulateur de pompe microseringue. (B) segments artériels (flèches blanches) en solution pour la digestion enzymatique. (C) les tubes endothéliales préparées par la trituration ; un = trituration pipette, b = tube endothélial intacte. Encart montre le processus de trituration pour enlever l’adventice et cellules musculaires lisses ; Echelle = 100 µm. (D) un tube endothélial intact fixé sur la lamelle de verre avec pipette épinglage. un = épinglage pipette, b = tube endothéliale intacte de diamètre de ~ 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Matériel pour superfusion et simultanée [Ca2 +] J’ai et V m mesures. (A) équipement superfusion du tube endothéliale et contrôle de la température, un = haute intensité d’alimentation de lampe à ARC, b = interface de système de fluorescence, c = contrôleur de température, d = six réservoirs du système superfusion, e = lumière à fibre optique sources, f = contrôleur de vanne, g = hyperswitch [Ca2 +]j’ai photométrie système. Appareils à chambre Superfusion (B) ; un et b = headstages, c = électrode de masse, d = inline réchauffeur, e = superfusion tubulure, f = vide d’aspiration, g = chambre superfusion, h = stade aluminium tenant la chambre. Plate-forme expérimentale (C) sur une table d’isolement de vibration ; un adaptateur de cadrage = cellulaire avec appareil photo, b = microscope léger, c = microscope, d = phase d’aluminium, e = micromanipulateur pour contrôle de préamplificateur, f = table d’isolement de vibration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Matériel d’exploitation d’électrophysiologie et enregistrement des données. un = oscilloscope, b = générateur de fonctions, c = moniteur de référence sonore, d = filtre de bruit 50/60 Hz, e et f = électromètres, g = système d’acquisition de données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Simultanée [Ca2 +] J’ai et V m enregistrements. (A) image de contraste d’interférence différentielle (400 x) d’un tube endothélium artériel cérébral de souris ajustée pour expérience de fenêtre photométrique en utilisant un objectif 40 x. Une électrode de sharp est placée dans une cellule comme indiqué en haut de l’image (flèche blanche). (B) des traces brutes pour la mesure simultanée du ratio F340/f380 (en haut) et Vm (en bas) en réponse à l’ATP (100 µM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

À la lumière des récents développements6,15,16,17, nous démontrons maintenant la méthode pour isoler l’endothélium artériel cérébral de souris en préparation pour la mesure simultanée de la [Ca2 +] i et Vm sous-jacent EDH régulièrement pendant environ 2 h à 37 ° C. Bien que techniquement difficile, nous pouvons mesurer la cellule-cellule d’accouplement ainsi (voir référence6, Figure 1). De cette manière, nous pouvons mesurer discrète et menée simultanément des événements de signalisation. Pour un compte des défis généraux tout en isolant l’endothélium artériel de souris, consultez références11,12. Nous tenons à souligner les étapes cruciales pour isoler les artères cérébrales de souris, nos mesures particulières endothéliales [Ca2 +]i et Vm, suggestions pour le dépannage et des considérations pour des méthodes alternatives à la lumière de Experimental forces/faiblesses ci-dessous.

L’artère cérébrale postérieure exige l’isolation minutieuse du cercle de Willis et de tissu conjonctif sans dommage pour le muscle lisse et les cellules endothéliales. Instruments chirurgicaux (pinces et ciseaux) devraient être adaptés pour les procédures de dissection souris microcirculation tout en étant maintenus avec des bords propres et nettes. Par rapport au muscle squelettique12, nous avons réduit la période d’incubation enzymatique par deux-tiers et les concentrations de papaïne, collagénase et dithioérythritol par moitié lors de l’ajout des utilisation concentration empiriquement optimisée de l’élastase. Pour réussite conforme à isoler les tubes endothélium artériels cérébrales, il est important d’enzymes ordre par lots (2 à 4 flacons) auprès d’un vendeur très réputé aux pratiques de fabrication conforme en accord avec la fréquence d’utilisation et de conservation. Même avec le risque de variation de l’activité enzymatique d’un lot de l’enzyme à l’autre, il est suggéré que les concentrations de l’enzyme soit maintenu tout en optimisant le temps de digestion au sein de 10 à 12 min. Il est à noter que ni le sexe ni l’âge de l’animal (3 à 30 mois) a été un obstacle important à la préparation de l’endothélium isolé depuis les artères cérébrales dans notre expérience. Ainsi, il est recommandé que la composition de l’enzyme cocktail et le temps de digestion enzymatique reste le même dans les études sur l’âge et le sexe.

Comme l’a souligné, attention est nécessaire au cours de la trituration douce et l’isolement de l’endothélium de l’adventice et de cellules fusiformes de muscle lisse pour ne pas endommager les cellules endothéliales12. Pour l’étape de la trituration, l’huile minérale visqueuse sert de milieu hydraulique entre le piston de la seringue à injection et le PSS aqueux pour dégager ou éjecter des segments vasculaires baignées de PSS. Il est à noter que si le segment de vaisseau entre en contact avec l’huile minérale, cette étape doit être répétée en utilisant une pipette propre trituration avec remblayage séquentielle d’huile minérale et PSS. Avant une expérience, il est recommandé qu’une longueur approximativement linéaire in vivo soit restitué à la tube endothélial dans la mesure du possible, auquel cas les cellules individuelles supposent une morphologie « à plat », longitudinale (p. ex., diamètre ~ 5 µm, longueur ~ 100 µm ; épaisseur ~0.5 µm)8. Cependant, traction axiale ne devrait pas s’appliquer dans la mesure où des cellules sur les bords de l’échantillon sont retirent loin de dessous pipettes épinglage respectives et ainsi compromettre une stabilité mécanique pour des mesures fiables et cellulaires au cours de la Faites des essais.

La photométrie [Ca2 +]j’ai système utilisé dans cette technique de mesure est adapté aux mesures en continu des endothéliales [Ca2 +]i utilisant le ratiométrique colorant Fura-2. Les protocoles individuels peuvent durer typiquement ≥ 10 min sans important photobleaching. En outre, nous utilisons couramment cette approche pour mesurer [Ca2 +]i parce qu’il se prête à des pauses en temps opportun dans l’acquisition de données et de fréquents mouvements des objectifs de microscope si nécessaire pour garantir des électrodes pointus pour les mesures dem V. Notez que c’est une approche photométrique qui capture seulement globale, en moyenne [Ca2 +]j’ai parmi plusieurs cellules. En général, [Ca2 +]je mesure, nous recommandons de photométrie pour la caractérisation initiale des réponses des cellules endothéliales aux agents pharmacologiques (par exemple, déroulement des phases de crête et de plateau) tout en assurant des plans visant à Passez à doser Microdomaine signalisation des événements à l’aide de la microscopie confocale ou multiphoton standard12,23.

L’approche d’électrophysiologie électrode pointus se prête pour des enregistrements dem V intégrés dans des préparations multicellulaires physiologiques. La mesure d’intracellulaire Vm est de loin le plus techniquement difficile avec nombreuses étapes critiques qui peuvent faciliter ou oblitérer le succès des mesures. Tout d’abord, l’expérimentateur doit déterminer les conditions du programme optimal sur un extracteur de verre de fabrication toujours forte d’électrodes avec une résistance à la pointe de ~ 150 ± 30 MΩ. À l’aide d’un essai de rampe filament thermique lecture comme une référence, il est recommandé que l’expérimentateur paramètres empiriquement déterminer, en particulier en ce qui concerne la variation dans le cadre de la « chaleur » tout en optimisant le temps de la traction. Ensuite, mécanique stabilité des micromanipulateurs, headstages, détenteurs de pipette et spécimen est absolument essentielle. En dehors de la nécessité évidente d’une table d’isolement de vibration, l’expérimentateur devra s’assurer que tous les raccords sont bien serrées et que l’espace scénique autour et en dessous les manipulateurs est propre. Idéalement, les bruits devraient être réduits dans la mesure où la résolution des enregistrements d’électrode forte se situe à 1 mV. Dans notre expérience, la source la plus courante du bruit est fil d’argent obtenu dans le porte-pipette qui est tout à fait besoin d’un revêtement suffisamment de chlorure ou de remplacement. Si commun bruit 50/60 Hz est présent, technologie « hum silencieux » peut être utilisée et est livré en standard avec un électromètre modern. Si le bruit semble complètement ingérable, vérifier s’il y a une fuite dans la baignoire ou le débordement où PSS entrera en contact avec les résistances pour contrôler la température. Si les complications restent à l’acquisition d’un signal stable dem V, vérifier l’intégrité des câbles électriques et connecteurs en t.

Au total, si l'on établit qu'un enregistrement électrode sharp est infructueux, il est généralement due à une électrode inapproprié, instabilité mécanique ou mauvaise santé cellulaire. Par ailleurs, l’expérimentateur pouvez également vouloir envisager une configuration de la technique de patch clamp sur des cellules individuelles, électriquement dételés où les informations sur les courants de germes entiers et enregistrements de canaux ioniques isolés peuvent être obtenues. Bien que confronté à des défis généraux d’utilisation d’un colorant fluorescent (par exemple, de chargement intracellulaire hétérogène, blanchissement, étalonnage à l’aide d’ionophores, résolution de détection modeste), sensibles au voltage colorants tels que Di-8-ANEPPS sont également disponible dans le commerce.

Notre compréhension de l’endothélium dans la régulation du débit sanguin et tout au long du cerveau est indispensable avec un vieillissement rapide de la population humaine et de l’incidence croissante des maladies chroniques, maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Ainsi, nous fournissons une méthode pour isoler l’endothélium intact d’une artère cérébrale vitale, qui peut être adaptée à d’autres structures vasculaires dans le cerveau. En outre, nous montrons une approche utile pour la mesure simultanée du sous-jacent [Ca2 +]i et Vm. Enfin, à l’aide de deux électrodes intracellulaires, couplage à travers les jonctions cellule-à-cellule peut également être évaluée. Interventions pharmacologiques et/ou génétiques soigneusement planifiées, le protocole actuel raisonnablement et quantitativement couvre l’étude de la fonction endothéliale cérébrale dans sa forme native. Notre espoir est qu’expérimentateurs construira d’et adapter ces informations afin de faire progresser la biologie vasculaire et neurosciences en général. En particulier, il serait satisfaisant de voir des luttes communes expérimentaux impliqués avec des mesures électriques minimisés au total. Bien que ce protocole n’est pas un ensemble autonome de techniques par tous les moyens, il peut être utilisé comme une approche complémentaire afin de déterminer avec précision comment endothéliales déterminants biophysiques traduisent en changements résistance vasculaire et comment ils affiner règlement du débit sanguin par rapport à des conditions représentatives de la maladie de santé vs. .

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Acknowledgments

Nous remercions Charles Hewitt excellente assistance technique lors de l’établissement des équipements et des fournitures nécessaires pour les protocoles actuels. Nous remercions les Drs Sean M. Wilson et Christopher G. Wilson, depuis le centre de dégroupage pour biologie périnatale, pour nous avoir fourni un microscope inversé supplémentaire et l’électromètre, respectivement. Cette recherche a été soutenue par les National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) et de nouveaux fonds de démarrage de faculté faculté de médecine de l’Université de Loma Linda. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

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References

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Biologie numéro 143 microcirculation cérébrale Hyperpolarisation endothéliale G-récepteurs couplés aux protéines Ca2 +-activation canaux K+ Fura-2 photométrie Microélectrodes intracellulaires couplage intercellulaire
Mesure simultanée de Calcium intracellulaire et le potentiel de Membrane dans l’endothélium cérébral de souris fraîchement isolées et intacte
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Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

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