Demonstrert her er protokoller for (1) ferske isolere intakt cerebral endothelial “rør” og (2) samtidig måling av endothelial kalsium og membran potensial under endotelet-avledet hyperpolarization. Videre tillater disse metodene farmakologiske tuning av endothelial celle kalsium og elektriske signalene som individuelle eller interaktive eksperimentelle variabler.
Cerebral arterier og deres respektive mikrosirkulasjonen levere oksygen og næringsstoffer til hjernen via blod flyte regulering. Endotelceller linje lumen blodkar og kommandoen endringer i vaskulær diameter for å møte de metabolske behovet av neurons. Primære endothelial-avhengige signalveier av hyperpolarization membran potensial (Vm) og nitrogenoksid vanligvis operere parallelt å megle vasodilatasjon og dermed øke blodstrøm. Selv om integrert å koordinere vasodilatasjon over flere millimeter vaskulær lengde, har komponenter i endotelet-avledet hyperpolarization (EDH) vært historisk vanskelig å måle. Disse komponentene av EDH innebærer intracellulær Ca2 + [Ca2 +]jeg øker og påfølgende aktivering av små – og middels konduktans Ca2 +-aktivert K+ (SKCa/IKCa) kanaler.
Her presenterer vi en forenklet illustrasjon av isolering av fersk endotelet fra musen cerebral arterier; samtidig måling av endothelial [Ca2 +]jeg og Vm med Fura-2 fotometri og intracellulær skarpe elektroder, henholdsvis; og en kontinuerlig superfusion salt løsninger og farmakologiske agenter under fysiologiske forhold (pH 7.4, 37 ° C). Bakre hjerne arterier fra sirkel av Willis fjernes uten den bakre kommunikasjon og basilar arteriene. Enzymatisk fordøyelsen av renset bakre hjerne arteriell segmenter og påfølgende føden forenkler fjerning av adventitia, perivascular nerver og glatt muskelceller. Resulterende bakre hjerne arteriell endothelial “rør” er deretter festes under et mikroskop og undersøkt ved hjelp av et kamera, photomultiplier rør, og en til to electrometers under kontinuerlig superfusion. Kollektivt kan denne metoden samtidig måle endringer i endothelial [Ca2 +]jeg og Vm diskret mobilnettet steder, i tillegg til spredning av EDH gjennom gapet veikryss til millimeter avstander langs den intakt endotelet. Denne metoden er forventet å gi en høy gjennomstrømming analyse av cerebral endothelial funksjonene underliggende mekanismene av blod flyte i normal og syke hjernen.
Blodstrøm gjennom hjernen er regulert av samordning av vasodilatasjon blant cerebral arterier og arterioler i vaskulære nettverk1. Endotelceller fôr cerebral motstand arterier kommandoen endringer i vaskulær diameter som trengs for å oppfylle metabolske neurons1,2,3. Spesielt i endotelet-avledet hyperpolarization (kjent som EDH), intracellulær Ca2 + ([Ca2 +]jeg) og elektriske signalene i endotelceller koordinere vasodilatasjon blant endotelceller og deres rundt glatte muskelcellene gjennom gapet veikryss for arteriell avslapning4. Fysiologiske initiering av EDH sekvensielt innebærer stimulering av Gq-kombinert reseptorer (GPCRs), en økning i [Ca2 +]jeg, og aktivering av endothelial små og middels Ca2 +-aktivert K+ (SKCa/IKCa) kanaler hyperpolarize cerebral endothelial membran potensial (Vm)5,6,7. Dermed er intime forholdet mellom endothelial [Ca2 +]jeg og Vm integrert i blodet flyt regulering og uunnværlig til kondisjons- og cerebrovascular funksjon6,8. Gjennom bredere litteratur, har flere studier rapportert foreningen av vaskulær endotelial dysfunksjon med utviklingen av kroniske sykdommer (f.eks hypertensjon, diabetes, hjertesvikt, koronarsykdom, kroniske nyre-svikt, perifer karsykdom)9,10, angir betydningen av studere endothelial funksjon i fysiologiske samt patologiske forhold.
Vaskulære endotelet er integrert produksjon av hyperpolarization, vasodilatasjon og vevsperfusjon og dermed undersøkelse av innfødte mobilnettet egenskapene er avgjørende. Som en generell studie er utarbeidelsen av musen arteriell endothelial røret modellen publisert før Skjelettmuskel11,12, gut13, lunge14, og nylig for hjernen6. Studier samtidig [Ca2 +]jeg og Vm målinger er spesielt publisert for Skjelettmuskel arteriell endotelet15,16 samt lymfatisk fartøy endotelet17. I tillegg til primære studier utnytte endothelial tube tilnærming, kan en omfattende gjennomgang av sine fordeler og ulemper8 bli konsultert om eksperimentell verktøyet er passende for en bestemt studie. I korte trekk en fordel er at fysiologiske hovedkomponentene i endothelial celle funksjon beholdes (, Ca2 + tilstrømningen og intracellulær utgivelse, hyperpolarization Vm opp til han potensialet for K+ via SKCa/IKCa aktivering og endothelial intercellulære kobling via gapet veikryss) uten confounding faktorer som perivascular nerve inndata, glatt muskel spenning-gated kanal funksjon og contractility, blodsirkulasjonen, og hormonelle påvirkninger8. I kontrast, brukte celle kultur tilnærminger introdusere betydelige endringer i morfologi18 og ion kanal uttrykk19 på en måte som kan sterkt Beskytt sammenligninger fysiologiske observasjoner fastslått ex vivo eller i vivo. Begrensninger omfatter mangel på integrasjon med andre viktige komponenter for å regulere blodstrøm, som glatt muskel og begrenset fleksibilitet i en eksperimentell tidsplan, som denne modellen er optimalt testet innenfor 4 h intakt vaskulær segmentet isolasjon fra dyret.
Fra en tidligere video protokoll forfattet av Socha og Segal12 og eksperimentelle bruer i midlertidige6,15,16, viser vi herved isolering av fersk endotelet fra bakre hjerne arterier og samtidig måling av endothelial [Ca2 +]jeg og Vm med Fura-2 fotometri og intracellulær skarpe elektroder, henholdsvis. I tillegg innebærer dette eksperimentet kontinuerlig superfusion salt løsninger og farmakologiske agenter i fysiologiske forhold (pH 7.4, 37 ° C). Vi valgte den bakre arterien cerebri, som det gir isolert endotelet med den strukturelle integriteten (celler koblet gjennom gapet veikryss) og tilstrekkelig størrelse (bredde ≥50 µm, lengde ≥300 µm) mottakelig for intra- og intercellulære signalering langs og blant endotelceller. I tillegg studier av gnager bakre hjerne arterien er vesentlig representert i litteratur og omfatter undersøkelse av grunnleggende endothelial signalnettverk mekanismer, vaskulære utvikling/aldring og patologi20, 21 , 22. eksperimentelle programmet forventes å gi en høy gjennomstrømming analyse av cerebral endothelial funksjon (og dysfunksjon) og vil dermed gi betydelige fremskritt i forståelsen av blod flyte gjennom aldring og utvikling av nevrodegenerative sykdommer.
I lys av nyere utviklingen6,15,16,17viser vi nå metoden for å isolere musen cerebral arteriell endotelet i forberedelse til samtidig måling av [Ca2 +] jeg og Vm underliggende EDH konsekvent for ~ 2 h på 37 ° C. Selv om teknisk vanskelig, kan vi måle celle-til-celle kopling også (se referanse6figur 1). På denne måten kan vi måle …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Charles Hewitt for utmerket kundestøtte ved opprettelse av utstyr og rekvisita som trengs for gjeldende protokollene. Vi takker Dr. Sean M. Wilson og Christopher G. Wilson, fra LLUB senter for Perinatal biologi, for å gi oss med en ekstra invertert mikroskop og electrometer, henholdsvis. Denne forskningen har blitt støttet av National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) og Loma Linda University School of Medicine nye fakultetet oppstart midler. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
MgCl2 | Sigma | M2670 | |
CaCl2 | Sigma | 223506 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Elastase | Sigma | E7885 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
DMSO | Sigma | D8418 | |
Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |