Протоколы изоляции (1) свеже нетронутыми церебральный эндотелиальных «трубы» и (2) одновременных измерений эндотелиальной кальция и мембранного потенциала во время эндотелий производные гиперполяризации продемонстрировали здесь. Кроме того эти методы позволяют для фармакологической тюнинг эндотелиальных клеток кальция и электрической сигнализации как индивидуальных или интерактивные экспериментальные переменные.
Церебральных артерий и их соответствующих микроциркуляции доставить кислород и питательные вещества в мозг через регулирование стока крови. Эндотелиальные клетки линии просвета кровеносных сосудов и изменения в сосудистой диаметр команд, необходимых для удовлетворения спроса метаболизма нейронов. Первичной эндотелия зависимые сигнальные пути гиперполяризации мембранного потенциала (Vm) и оксида азота обычно работают параллельно с посредником вазодилатацию и тем самым увеличить поток крови. Хотя неотъемлемой частью координации вазодилатация на несколько миллиметров сосудистой длины, компоненты эндотелий производные гиперполяризации (EDH) были исторически, трудно измерить. Эти компоненты EDH влекут за собой внутриклеточных Ca2 + [Ca2 +]я увеличивается и последующей активации малых – и средней проводимости Ca2 +-активированный K+ (SKCa/IKCa) каналы.
Здесь мы представляем упрощенная схема изоляции свежие эндотелий от мыши церебральных артерий; одновременное измерение эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно; и непрерывного superfusion солевых растворов и фармакологических агентов в физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Задней мозговой артерии от круг Уиллис удаляются без задней общения и базилярной артерии. Ферментативный пищеварения уборка задней церебральной артериальной сегментов и последующие Тритурация облегчает удаление адвентиции, периваскулярной нервов и гладких мышечных клеток. Результате задняя церебральной артериальной эндотелиальной «трубы» затем закреплены под микроскопом и изучены с помощью камеры, фотоэлектронный умножитель трубки, и одного-двух электрометры под непрерывной superfusion. Коллективно этот метод может одновременно измерять изменения в эндотелиальных [Ca2 +]я и Vm в дискретных сотовой местах, помимо распространения EDH через разрыв соединения до миллиметра расстояния вдоль нетронутыми эндотелий. Ожидается, что этот метод высок объём анализ церебральный эндотелиальных функций, лежащих в основе механизмов регулирования потока крови в мозге, нормального и больными.
Поток крови в мозг регулируется координации вазодилатация среди церебральных артерий и артериол в сосудистой сети1. Эндотелиальных клеток, выстилающих мозгового сопротивление артерий команды изменения сосудов диаметром по мере необходимости для удовлетворения спроса метаболизма нейронов1,2,3. В частности, во время эндотелий производные гиперполяризации (широко известный как EDH) внутриклеточный Ca2 + ([Ca2 +]я) и электрической сигнализации в эндотелиальных клеток координат вазодилатация среди эндотелиальных клеток и их окружающие гладкомышечные клетки через разрыв соединения для расслабления артериальной4. Физиологического возбуждения EDH последовательно влечет за собой стимуляции Gq-сочетании рецепторов (GPCR), увеличение [Ca2 +]яи активации эндотелиальной малого и среднего Ca2 +-активированный K+ (SKCa/IKCa) каналы для hyperpolarize церебральный эндотелиальных мембранный потенциал (Vm)5,6,7. Таким образом интимные отношения эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm является неотъемлемой частью регулирование потока крови и незаменимым для кардио – и цереброваскулярные функции6,8. На протяжении более широких литературы многочисленные исследования сообщили ассоциации сосудистых эндотелиальной дисфункции с развития хронических заболеваний (например, гипертония, диабет, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, хронической почечной недостаточности, заболевания периферических артерий)9,10, указав значение изучения функции эндотелия в как физиологические, так и патологических условиях.
Эндотелия является неотъемлемой частью производства гиперполяризации, вазодилатацию и перфузии тканей и таким образом, изучение его родной сотовой свойств имеет решающее значение. Как модель общего исследования подготовка модели мыши артериальной эндотелиальной трубка была опубликована до скелетных мышц11,12,13кишки, легких14и недавно для мозга6. В частности исследования одновременных [Ca2 +]я и Vm измерений были опубликованы для скелетной мускулатуры артериальных эндотелия15,16 , а также лимфатический сосуд эндотелия17. Помимо первичного исследования с использованием эндотелиальной трубки подход всеобъемлющий обзор его преимущества и недостатки8 можно ознакомиться для определения, если это экспериментальный инструмент подходит для конкретного исследования. Короче говоря, преимуществом является то, что сохраняются основные физиологические компоненты функции эндотелиальных клеток (например,, Ca2 + приток и внутриклеточных релиз, гиперполяризации Vm до Нернста потенциал для K+ через SKCa/IKCa активации и эндотелиальных межклеточные соединения через разрыв соединения) без привходящих факторов, таких как периваскулярной нерва ввода, гладких мышц напряжения закрытого канала функции и сократительную способность, циркуляция крови и гормональных влияний8. В отличие от широко используемых ячеек культуры подходов ввести значительные изменения в морфологии18 и ионного канала выражение19 в манере, которая значительно может запутывать сравнений физиологических наблюдений определяется ex vivo или в естественных условиях. Ограничения включают в себя отсутствие интеграции с другими важными компонентами для регулирования потока крови, таких как гладких мышц и ограничения гибкости в экспериментальный график, как эта модель оптимально протестирован в течение 4 ч нетронутыми сосудистой сегмент изоляции от животного.
Строительство от предыдущих видео-протокол автором Соча и Сегал12 и последние экспериментальные разработки в промежуточный6,,1516, мы настоящим продемонстрировать изоляции свежие эндотелий от задней мозговой артерии и одновременного измерения эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно. Кроме того этот эксперимент предполагает непрерывное superfusion солевых растворов и фармакологических агентов при физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Мы выбрали задней мозговой артерии, как он дает изолированных эндотелия с структурной целостности (клеток, Соединенных через разрыв соединения) и достаточные размеры (ширина ≥50 мкм, длина ≥300 мкм) поддаются интра – и межклеточной сигнализации вдоль и среди эндотелиальные клетки. Кроме того исследования грызунов задней мозговой артерии существенно представлены в литературе и охватывать изучение фундаментальных эндотелиальной сигнальных механизмов, развития сосудистой/старения и патологии20, 21 , 22. это экспериментальное приложение ожидается высок объём анализ мозговой функции эндотелия (и дисфункции) и тем самым позволит обеспечить значительный прогресс в понимании регулирования потока крови на протяжении старение и развитие нейродегенеративных заболеваний.
В свете недавних событий6,,1516,17мы теперь продемонстрировать метод, чтобы изолировать мыши церебральной артериальной эндотелия в подготовке для одновременного измерения [Ca2 +] i и Vm лежащие в основе EDH …
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Чарльз Хьюитт за отличную техническую помощь при создании оборудования и предметов снабжения, необходимых для текущей протоколов. Мы благодарим Drs. Шон м. Уилсон и Кристофер г. Вильсон, от ЛСУ центр перинатальной биологии, за предоставление нам с дополнительным инвертированным микроскопом и электрометр, соответственно. Это исследование был поддержан национальными институтами здравоохранения грант R00-AG047198 (EJB) и лома Линда медицинской школы университета новый факультет начальных средств. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
MgCl2 | Sigma | M2670 | |
CaCl2 | Sigma | 223506 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
KCl | Sigma | P9541 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Elastase | Sigma | E7885 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
DMSO | Sigma | D8418 | |
Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |