Summary

Одновременного измерения внутриклеточного кальция и мембранный потенциал в свеже изолированных и нетронутыми мыши мозгового эндотелия

Published: January 20, 2019
doi:

Summary

Протоколы изоляции (1) свеже нетронутыми церебральный эндотелиальных «трубы» и (2) одновременных измерений эндотелиальной кальция и мембранного потенциала во время эндотелий производные гиперполяризации продемонстрировали здесь. Кроме того эти методы позволяют для фармакологической тюнинг эндотелиальных клеток кальция и электрической сигнализации как индивидуальных или интерактивные экспериментальные переменные.

Abstract

Церебральных артерий и их соответствующих микроциркуляции доставить кислород и питательные вещества в мозг через регулирование стока крови. Эндотелиальные клетки линии просвета кровеносных сосудов и изменения в сосудистой диаметр команд, необходимых для удовлетворения спроса метаболизма нейронов. Первичной эндотелия зависимые сигнальные пути гиперполяризации мембранного потенциала (Vm) и оксида азота обычно работают параллельно с посредником вазодилатацию и тем самым увеличить поток крови. Хотя неотъемлемой частью координации вазодилатация на несколько миллиметров сосудистой длины, компоненты эндотелий производные гиперполяризации (EDH) были исторически, трудно измерить. Эти компоненты EDH влекут за собой внутриклеточных Ca2 + [Ca2 +]я увеличивается и последующей активации малых – и средней проводимости Ca2 +-активированный K+ (SKCa/IKCa) каналы.

Здесь мы представляем упрощенная схема изоляции свежие эндотелий от мыши церебральных артерий; одновременное измерение эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно; и непрерывного superfusion солевых растворов и фармакологических агентов в физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Задней мозговой артерии от круг Уиллис удаляются без задней общения и базилярной артерии. Ферментативный пищеварения уборка задней церебральной артериальной сегментов и последующие Тритурация облегчает удаление адвентиции, периваскулярной нервов и гладких мышечных клеток. Результате задняя церебральной артериальной эндотелиальной «трубы» затем закреплены под микроскопом и изучены с помощью камеры, фотоэлектронный умножитель трубки, и одного-двух электрометры под непрерывной superfusion. Коллективно этот метод может одновременно измерять изменения в эндотелиальных [Ca2 +]я и Vm в дискретных сотовой местах, помимо распространения EDH через разрыв соединения до миллиметра расстояния вдоль нетронутыми эндотелий. Ожидается, что этот метод высок объём анализ церебральный эндотелиальных функций, лежащих в основе механизмов регулирования потока крови в мозге, нормального и больными.

Introduction

Поток крови в мозг регулируется координации вазодилатация среди церебральных артерий и артериол в сосудистой сети1. Эндотелиальных клеток, выстилающих мозгового сопротивление артерий команды изменения сосудов диаметром по мере необходимости для удовлетворения спроса метаболизма нейронов1,2,3. В частности, во время эндотелий производные гиперполяризации (широко известный как EDH) внутриклеточный Ca2 + ([Ca2 +]я) и электрической сигнализации в эндотелиальных клеток координат вазодилатация среди эндотелиальных клеток и их окружающие гладкомышечные клетки через разрыв соединения для расслабления артериальной4. Физиологического возбуждения EDH последовательно влечет за собой стимуляции Gq-сочетании рецепторов (GPCR), увеличение [Ca2 +]яи активации эндотелиальной малого и среднего Ca2 +-активированный K+ (SKCa/IKCa) каналы для hyperpolarize церебральный эндотелиальных мембранный потенциал (Vm)5,6,7. Таким образом интимные отношения эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm является неотъемлемой частью регулирование потока крови и незаменимым для кардио – и цереброваскулярные функции6,8. На протяжении более широких литературы многочисленные исследования сообщили ассоциации сосудистых эндотелиальной дисфункции с развития хронических заболеваний (например, гипертония, диабет, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, хронической почечной недостаточности, заболевания периферических артерий)9,10, указав значение изучения функции эндотелия в как физиологические, так и патологических условиях.

Эндотелия является неотъемлемой частью производства гиперполяризации, вазодилатацию и перфузии тканей и таким образом, изучение его родной сотовой свойств имеет решающее значение. Как модель общего исследования подготовка модели мыши артериальной эндотелиальной трубка была опубликована до скелетных мышц11,12,13кишки, легких14и недавно для мозга6. В частности исследования одновременных [Ca2 +]я и Vm измерений были опубликованы для скелетной мускулатуры артериальных эндотелия15,16 , а также лимфатический сосуд эндотелия17. Помимо первичного исследования с использованием эндотелиальной трубки подход всеобъемлющий обзор его преимущества и недостатки8 можно ознакомиться для определения, если это экспериментальный инструмент подходит для конкретного исследования. Короче говоря, преимуществом является то, что сохраняются основные физиологические компоненты функции эндотелиальных клеток (например,, Ca2 + приток и внутриклеточных релиз, гиперполяризации Vm до Нернста потенциал для K+ через SKCa/IKCa активации и эндотелиальных межклеточные соединения через разрыв соединения) без привходящих факторов, таких как периваскулярной нерва ввода, гладких мышц напряжения закрытого канала функции и сократительную способность, циркуляция крови и гормональных влияний8. В отличие от широко используемых ячеек культуры подходов ввести значительные изменения в морфологии18 и ионного канала выражение19 в манере, которая значительно может запутывать сравнений физиологических наблюдений определяется ex vivo или в естественных условиях. Ограничения включают в себя отсутствие интеграции с другими важными компонентами для регулирования потока крови, таких как гладких мышц и ограничения гибкости в экспериментальный график, как эта модель оптимально протестирован в течение 4 ч нетронутыми сосудистой сегмент изоляции от животного.

Строительство от предыдущих видео-протокол автором Соча и Сегал12 и последние экспериментальные разработки в промежуточный6,,1516, мы настоящим продемонстрировать изоляции свежие эндотелий от задней мозговой артерии и одновременного измерения эндотелиальной [Ca2 +]я и Vm с помощью фура-2 фотометрии и внутриклеточных резкое электродов, соответственно. Кроме того этот эксперимент предполагает непрерывное superfusion солевых растворов и фармакологических агентов при физиологических условиях (рН 7,4, 37 ° C). Мы выбрали задней мозговой артерии, как он дает изолированных эндотелия с структурной целостности (клеток, Соединенных через разрыв соединения) и достаточные размеры (ширина ≥50 мкм, длина ≥300 мкм) поддаются интра – и межклеточной сигнализации вдоль и среди эндотелиальные клетки. Кроме того исследования грызунов задней мозговой артерии существенно представлены в литературе и охватывать изучение фундаментальных эндотелиальной сигнальных механизмов, развития сосудистой/старения и патологии20, 21 , 22. это экспериментальное приложение ожидается высок объём анализ мозговой функции эндотелия (и дисфункции) и тем самым позволит обеспечить значительный прогресс в понимании регулирования потока крови на протяжении старение и развитие нейродегенеративных заболеваний.

Protocol

До проведения следующих экспериментов, обеспечить использование всех животных ухода и протоколы одобрен институциональный уход за животными и использовать Комитет (IACUC) и осуществляется в соответствии с Национальным Советом исследований »руководство для ухода и использования Л…

Representative Results

Схематические демонстрации протокола, описанные выше показан на вложенные фигуры. Мозг, изолированных от молодых взрослых мужчины C57BL/6Н мышь (5 месяцев) показан на рисунке 1A. Задней мозговой артерии, тщательно изолированы от круг Уиллис, удалены без сое…

Discussion

В свете недавних событий6,,1516,17мы теперь продемонстрировать метод, чтобы изолировать мыши церебральной артериальной эндотелия в подготовке для одновременного измерения [Ca2 +] i и Vm лежащие в основе EDH …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Чарльз Хьюитт за отличную техническую помощь при создании оборудования и предметов снабжения, необходимых для текущей протоколов. Мы благодарим Drs. Шон м. Уилсон и Кристофер г. Вильсон, от ЛСУ центр перинатальной биологии, за предоставление нам с дополнительным инвертированным микроскопом и электрометр, соответственно. Это исследование был поддержан национальными институтами здравоохранения грант R00-AG047198 (EJB) и лома Линда медицинской школы университета новый факультет начальных средств. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Materials

Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer’s disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).

Play Video

Cite This Article
Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

View Video