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Biology

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

doi: 10.3791/58832 Published: January 20, 2019

Summary

ここで説明は、(1) たてそのまま脳血管内皮「チューブ」と内皮細胞のカルシウムと膜内皮由来過分極電位 (2) 同時計測を隔離するためのプロトコルです。さらに、これらのメソッド内皮細胞カルシウムと個々 またはインタラクティブな実験変数として電気シグナリングの薬理学的チューニングを可能にします。

Abstract

脳動脈および彼らのそれぞれの微小循環血流調節を介して脳に酸素と栄養を提供します。神経細胞の代謝需要を満たすために必要に応じて血管内皮細胞の血管と血管径に変更するコマンドのルーメンを行します。過分極膜電位 (Vm) と窒素酸化物の主な内皮依存性シグナル経路は、通常血管拡張反応を仲介し、それにより血流を増加する並列で動作します。血管の長さ数ミリの血管拡張反応の調整には不可欠な内皮由来過分極 (EDH) のコンポーネントされている歴史的に測定することは困難。EDH のこれらのコンポーネントは細胞内 Ca2 + [Ca2 +]が増加との小規模でその後活性化を伴うし、中間コンダクタンス Ca2 +-K+を活性化 (SKCa/IKCa) チャンネル。

ここでは、提案するマウス脳動脈から新鮮な内皮細胞の分離の簡略図内皮 [Ca2 +]と Vmそれぞれ Fura 2 測光と細胞内の鋭い電極を使用しての同時測定塩水濃度および生理学的な条件 (pH 7.4 では、37 ° C) の下で薬剤の継続的なスパーフュー ジョン法。ウィリス動脈輪から後大脳動脈が削除されます, 通信と脳底動脈の無料。洗浄後大脳動脈セグメントとその後製粉の酵素の消化力は、外膜、血管周囲神経や平滑筋細胞の除去を促進します。結果後大脳動脈内皮「チューブ」は、顕微鏡下では、保護し、カメラ、光電子増倍管、連続スパーフュー ジョン法を受けながら、1 〜 2 electrometers を用いています。総称して、このメソッドことができますと同時に測定内皮 [Ca2 +]の変化に沿ってそのまま距離をミリ波までのギャップ結合を介した EDH の広がりに加え、離れた細胞場所で Vm血管内皮細胞。このメソッドは、高スループット分析の正常および病的脳血流調節機構の基礎となる脳の血管内皮機能をもたらすと予想されます。

Introduction

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脳全体の血流は、中大脳動脈と細動脈血管ネットワーク1で血管拡張反応の調整によって規制されています。血管内皮細胞は、脳の抵抗動脈ニューロン1,2,3の代謝需要を満たすために必要に応じて血管径に変更するコマンドをライニングします。(通称 EDH)、内皮由来過分極反応の中に特に、細胞内 Ca2 + ([Ca2 +]) 内皮細胞座標血管内皮細胞間の電気信号と、動脈弛緩4のギャップ結合を介した周囲の平滑筋細胞。EDH の生理開始は順次 Gqの刺激を伴います-受容体 (Gpcr) [Ca2 +]との内皮小中間 Ca2 +活性化の増加を結合-アクティブに K+(SKCa/IKCa) hyperpolarize 脳血管内皮膜電位 (Vm)5,6,7チャンネル。したがって、内皮 [Ca2 +]と Vmの親密な関係は血の流れの調節に不可欠な心臓・脳血管の機能68に欠かせない。広範な文献の中で多くの研究 (例えば、高血圧、糖尿病、心不全、冠動脈疾患、慢性腎不全、慢性疾患の整備に血管内皮機能障害の関連を報告しています。末梢動脈疾患)9,10、生理学的、病理学的条件の血管内皮機能を勉強の意義を示します。

血管内皮細胞が過分極、血管拡張、および組織灌流の生産に不可欠である、したがって、そのネイティブの細胞特性の検討は重要です。一般的な研究モデルとして骨格筋11,12, 腸13、肺14、および最近脳6前にマウスの動脈の内皮の管モデルの準備を公開されています。同時 [Ca2 +]と Vm測定の研究特に骨格筋動脈内皮15,16としてリンパ管の内皮細胞17公開されています。内皮の管アプローチを利用してプライマリの研究に加えてその長所と短所8の包括的な見直しは、この実験的なツールが特定の調査のために適切であるかどうかに相談ことができます。簡単に言えば、利点は、内皮細胞の機能の主要な生理学的なコンポーネントが保持されます (, Ca2 +流入や細胞内放出、ネルンストの潜在性 Vmの K+の過分極経由でSKCa/IKCa活性化とギャップ結合を介して血管内皮細胞間結合) 血管周囲神経入力、平滑筋の電位依存性チャネルの関数、収縮性などの要因が交絡なし血とホルモンの影響8の循環。対照的に、一般的に使用されるセル文化アプローチ導入形態18とイオン チャネル発現19大きく決定前のヴィヴォ生理学的観察との比較を隠ぺいする方法の重要な変化または生体内で。制限は、このモデルはそのまま血管セグメント分離の 4 h 以内テスト最適平滑筋など実験的スケジュールで制限された柔軟性、血流を規制するその他の重要なコンポーネントとの統合の欠如動物。

ここから新鮮な内皮細胞の分離を示す、Socha とシーガルの12および中間6,15,16, 実験的動向によって以前のビデオ議定書からの構築後大脳動脈と血管内皮 [Ca2 +]と Vmそれぞれ Fura 2 測光および細胞内の鋭い電極を使用しての同時測定。さらに、この実験は、生理学的な条件 (pH 7.4 では、37 ° C) の間に塩水濃度および薬理学的エージェントの連続的なスパーフュー ジョン法を伴います。それは構造健全性 (細胞のギャップ結合を介した結合) と十分な寸法 (幅: 50 μ m、長さ ≥ 300 μ m) さと内に沿ってとの間で、細胞間情報伝達および孤立した内皮細胞を得られるように選んだ後大脳動脈血管内皮細胞。また、齧歯動物の後大脳動脈の研究の文献で実質的に表され、基本的な内皮細胞シグナル伝達機構、血管開発/老化、そして病理学20,の試験を網羅21,22. この実験的脳血管内皮機能 (機能不全) の高スループット解析に期待し、全体の血液の流れの規制の理解する上で重要な進歩を可能にすることにより加齢と神経変性疾患の開発。

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Protocol

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次の実験を実施する前に、すべての動物の世話使用し、プロトコル施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認され、国家研究会議"ガイドと一致を実行をようにケアとの使用のため実験動物" (8th版、2011) のガイドラインが到着。Loma リンダ大学 IACUC は男性と女性の c57bl/6 マウスのこの原稿を使うすべてのプロトコルを承認した (年齢: 30 に 3 mo)。

1. 装置および材料

注:プロトコルに必要な材料の詳細は、表の材料試薬とマニュアルやそれぞれのベンダーに関連付けられているウェブサイトで見つけることが。

  1. 流れの部屋
    1. 陽極酸化アルミニウム プラットフォームにガラス coverslip 底の superfusion チャンバーを固定します。コンパクトなアルミ ステージに納めたプラットフォームを固定します。
    2. アルミ ステージ固定のピペットなどを保持するために、プラットフォームの各端にマイクロマニピュレーターを設定します。
      注:実用的なオプションとして内皮の管の分離から実験のパフォーマンスへの移行を容易にするために固定されて流れ商工会議所単位でこの譲渡ステージ装置を使用します。
  2. 顕微鏡
    1. 使用実体顕微鏡 (5 x 50 x 倍率範囲) はマクロおよびマイクロ郭清術用繊維ファイバー光源に装備。
    2. 内皮の管の準備、位相コントラストや微分干渉対照 (DIC) 互換性のある目標 (10 x、20 x、40 x) とアルミ ステージを搭載した倒立顕微鏡を使用します。
    3. 部分的に消化された血管から血管内皮の管を分離するには、内皮の管準備装置に隣接して, マイクロシリンジ ポンプのコント ローラーを配置します。
    4. 実験装置の蛍光目標 (20 x、40 x、開口 0.75) と除振台上マニュアル アルミ ステージに加えて標準的な目的 (4 x、10 x) を搭載した倒立顕微鏡を使用します。
  3. 細胞内記録装置
    1. 分離の内皮の管の内皮細胞の Vmを記録するため、電位計を互換性のあるパッチアンプ用アダプターに接続します。必要に応じて、関数発生器や刺激を電流注入を必要とする実験のため電位計に接続します。
    2. オシロ スコープ、音のベースライン モニター、データ集録システムにアンプ出力を接続します。実験中にフロー チャンバー出口付近参照電極 (銀/塩化銀ペレット) を保護します。
    3. フォト メトリック システムを使用し、蛍光システム インターフェイス、高強度アーク ランプと電源供給、hyperswitch、光電子増倍管 (PMT) の統合コンポーネントと [Ca2 +]内皮細胞を測定するカメラ。
    4. 上げるし、実験中の生理的温度 (37 ° C) を維持するインライン ヒーター搭載温度コント ローラーを使用します。
    5. 商工会議所に固定されて内皮の管にそれぞれのソリューションの配信を制御するのにインライン流量制御弁で弁のコント ローラーに接続されている 6 貯水池プラットフォームを使用します。
  4. マイクロ ピペットと鋭い電極
    注:製粉と分離の内皮の管の機械的な安定用ピペットを製造するため、ピペットと破壊のマイクロ鍛造を引っ張るため電子の引き手を使用し、ファイアポリッシュします。
    1. 部分的に消化動脈セグメントから外膜、平滑筋、血管内皮の管を分離、および trituration ピペット (それぞれ内部先端直径 80-120 μ m) に応じて、ホウケイ酸ガラス毛細管を使用してを準備しを火先端を磨きます。
    2. 末が鈍化、球形の固定ピペットを使用 superfusion 室の底面に対して血管内皮の管をセキュリティで保護する (熱研磨、100-150 μ m の OD 薄肉ホウケイ酸塩のガラス管から調製した)。
    3. 血管内皮細胞の Vmを記録する準備 〜 150 ± 30 の先端抵抗と鋭い電極電子の引き手を使用してガラス毛細管から MΩ。

2. ソリューションと薬の準備

  1. 生理的食塩水 (PSS)
    1. 医薬品製剤と 1 つの実験の準備の PSS を使用して 1 L の最小値: 140 mM の NaCl、KCl、2 mM CaCl2, 5 mM 1 mM MgCl2、10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic 酸 (HEPES) と 10 mM グルコース。
    2. 郭清の必要なソリューションを準備をするには、脳動脈の分離および内皮の管の準備は、CaCl2 (ゼロ Ca2 + PSS) に欠けている PSS を準備します。
    3. 超純水脱イオン H2O のすべてのソリューションを準備、pH 7.4 に調整、フィルター (0.22 μ m 孔サイズ)、を介してそれらを殺菌、290 と 300 mOsm 間ソリューションの浸透圧であることを確認します。
      注:ソリューションは、4 ° C で約 2 週間保存できます。
  2. 10% ウシ血清アルブミン (BSA)
    1. 10 %bsa を準備するには、凍結乾燥粉末の 1 g を 10 mL 0 Ca2 + PSS のビーカーに溶解します。
    2. パラフィン フィルムでビーカーをカバーでき、ゆっくり攪拌溶解する bsa を通過するいくつかの時間の期間。
    3. 10 mL の注射器に加え、0.22 μ m フィルターを使用して最終的な解決をフィルター処理し、-20 ° C で保存する 1 mL 因数
  3. 郭清のソリューション
    1. 解離液 50 mL を準備するには、49.5 mL ゼロ Ca2 + PSS に BSA (10%) の 500 μ L を追加します。
    2. 準備の後ですぐに動脈解離のシャーレにこの郭清ソリューションを転送します。
  4. 解離ソリューション
    1. 解離液 50 mL を準備するには、CaCl2 (1 M) の 5 μ L を追加し、49.5 mL ゼロ Ca2 + PSS に BSA (10%) を 500 μ l 添加します。室温 (RT) で座っているソリューションを許可します。
  5. 酵素
    1. 動脈セグメントの部分消化の 0.13 mg/mL エラスターゼ、コラゲナーゼ 0.75 mg/mL (H 型ブレンド)、0.5 mg/mL ジチオエリトリトール 0.31 mg/mL パパイン消化溶液の 1 mL を準備します。
      注:酵素活性は異なります。しかし、私たちの成功したプロトコルの市販酵素使用されている次のように: パパイン ≥10 単位/mg;コラゲナーゼ ≥ 1 単位/mg、N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala または FALGPA の基板回転;エラスターゼ ≥ 5 単位/mg。
  6. フラ 2 や薬理学的エージェントの準備
    1. フラ 2 のストック濃度 (1 mM) を準備 DMSO で午前染料。作業濃度 (10 μ M) を準備するには、読み込みの PSS の 495 μ L に株式の 5 μ L を追加します。
    2. 必要に応じて、PSS での薬理学的エージェント (ATP など) の濃度: 50 mL を準備します。
  7. 解決策の実施
    1. 導電準備ソリューション、2 M の KCl、KCl 脱イオン H2O (7.455 g KCl 50 mL H2O) を溶解することにより。
    2. 鋭い電極埋め戻し前に 0.22 μ m シリンジ フィルターを通してソリューションをフィルターします。
  8. Propidium ヨウ化 (0.1%)
    1. 凍結乾燥 propidium ヨウ化 2 M の KCl の 10 mL に 10 mg を溶解します。
    2. よく混合し、室温保存

3. 解剖と脳動脈の分離

注:郭清術のすべては、実体顕微鏡や光ファイバー光源によって提供される照明を介して試料の倍率 (50 倍) を必要とします。分離脳の動脈の解剖の手順を実行するには、削った解剖器具を使用します。分離し、動脈をきれいにレーザーマイクロダイ セクション ツールには、削った細い鉗子と Vannas スタイル解剖はさみ (3 に 9.5 mm ブレード) が含まれます。

  1. マウスの脳の分離
    1. イソフルラン (2-3 分間 3%) の吸入を介してC57BL/6 マウス (3-30 ヶ月古い; 男性または女性) を麻酔し、完全な麻酔導入直後の動物の首をはねます。ペトリ皿に頭を配置 (直径 10 cm、深さ 1.5 cm) Ca2 + PSS 顕微鏡の下でゼロの寒さ (4 ° C) を含みます。
    2. 顕微鏡を通して表示、頭蓋骨に肌や髪を削除し、寒さで過剰な血液を削除ゼロ Ca2 + PSS。ヒントを使用してのみ、標準的な解剖はさみ (例えば、24 mm 刃) の始まる後頭骨および頭蓋骨の鼻の骨をいたる切開を行います。
    3. そのままウィリス動脈輪と脳を分離する粗先端の鉗子と別の膠原病を使用する切開に沿って慎重に頭蓋骨を開きます。
      注:また、頭蓋骨を開き、脳を公開するリタウェルによって骨切り鉗子を使用できます。
    4. 優しく洗って冷たいと分離脳ゼロ Ca2 +血を削除するビーカーに PSS。脳動脈 (図 1 a) の隔離のための冷たい解剖ソリューションを含む商工会議所で上を向いて脳腹側を配置します。
  2. 脳動脈の分離
    注:後大脳動脈は、このプロトコルの代表的な脳血管内皮研究モデルとして選択されています。
    1. ステンレス製のピンを使用して冷たい解剖ソリューションで隔離された頭脳を保護 (直径 0.2 mm、長さ 〜 11-12 mm) 炭注入シリコン ポリマー コーティング ガラス シャーレの底 (深さ: 50 cm) に挿入されます。
    2. 解剖時に PSS のチルド温度を維持するために 1:1 の水エチレン ・ グリコールの混合物を継続的に循環冷却システムにより冷却解剖室を使用します。また、新鮮な氷の上郭清を実行できます。
    3. 手術後大脳動脈 (0.5 cm セグメントに ~0.3、ない引張) 後部の通信から、レーザーマイクロダイ セクション楽器 Vannas スタイルはさみと削った細い鉗子 (図 1 b を使用して脳底動脈を分離します。).ステンレス製のピンを使用して (直径 0.1 mm 〜 13-14 mm) 安全な両方分離ペトリ皿 (図 1) の郭清ソリューションで後大脳動脈。
    4. きれいに削った細い鉗子 (図 1) を使用して結合組織を削除することによって慎重に分離後大脳動脈。そのまま動脈をセグメントにカット (長さ 1-2 mm) (図 1; はめ込み) 酵素の消化力のため。

4. 血管内皮の管とスパーフュー ジョン法の準備

注:内皮の管は、12、大脳動脈6修正を前述のように用意しています。

  1. 目標 (10 x、20 x、40 x)、カメラ、および商工会議所とマニピュレーターを保持アルミ ステージを搭載した顕微鏡を用いた製粉装置を準備します。ステージと供試体 (図 2 a) に隣接してポンプ コント ローラーで変らずを固定します。
  2. 完全にバックフィル、製粉鉱油とピペットし、マイクロ注射器のピストンを固定します。次に、ピペットに解離ソリューションを撤回ポンプ コント ローラー、マイクロ シリンジの使用 (~ 130 nl) ピペット内の気泡の不在を確保しながら鉱物油の上に。
  3. 0.31 mg/mL パパイン、0.5 mg/mL ジチオエリトリトール、0.75 mg/mL コラゲナーゼとエラスターゼ 0.13 mg/mL を含む 10 mL ガラス管 (図 2 b) 解離液の 1 mL にそのまま動脈セグメントを配置します。部分消化のため 10-12 分の 34 ° C で孵化させなさい。
  4. 次の消化、酵素液を新鮮な解離液 〜 5 mL に置き換えます。1 mL ピペットを使用して、含む室温解離液室に 1 つのセグメントを転送します。
  5. 商工会議所解離溶液にピペットを置き、消化の容器の 1 つの端の近くに位置します。穏やかな製粉 (図 2; インセット) のポンプのコント ローラーに 2 に 5 nL/s の範囲内で速度を設定します。
  6. 100 倍、200 倍の倍率を表示、ながらを撤回、内皮の管を生産しながら平滑筋細胞を分離する動脈セグメントを取り出します。必要に応じて、慎重に血管内皮の管から解離外膜、内弾性板を分離するのに細い鉗子を使用します。すべての平滑筋細胞の解離し、だけ血管内皮細胞のままのままの「管」(図 2) ことを確認します。
  7. マニピュレーターを使用して、固定ピペット (図 2 D) ホウケイ酸ガラスを使用して superfusion の商工会議所のガラス製カバー スリップの内皮の管の両端を固定します。
  8. ウォッシュ アウトは、外膜と平滑筋細胞の商工会議所と置換 2 mm CaCl2 PSS 解離ソリューションに分離されます。Superfusion と実験装置の顕微鏡にセキュリティで保護された内皮チューブ モバイル プラットフォームに転送します。
  9. 必要に応じて、実験中に PSS とそれぞれ薬ソリューションの連続配信の 6 クリーン 50 mL 貯水池 (図 3 a) を使用します。真空吸引に供給の流れをマッチングしながら流との整合性など全体の流量を手動で設定するのにインライン流量制御弁を使用します。バック グラウンド データと染料のローディングを記録する前に室 (図 3 b) ≥ 5 分の内皮の管のスパーフュー ジョン法の PSS を提供します。

5. 色素負荷、ウォッシュ アウトと温度設定

  1. [Ca2 +]を測定する測光システムのすべてのコンポーネントをオンにします。(図 3) の実験のリグに顕微鏡を使用すると、測光システム ソフトウェア スイートを使用してフォト メトリック ウィンドウにおける細胞の 400 倍の倍率と焦点の内皮の管を表示できます。
  2. 内皮の管の直径を測定し、340 と 380 nm (≥10 Hz) 代替加振中 510 nm の発光とアコードでバック グラウンド蛍光値を記録します。
  3. [Ca2 +]の応答を測定する負荷内皮 Fura 2 管は常温 (10 μ M 最終濃度) を染めるよし、~ 30-40 を許可する光の不在の分。
  4. 新鮮な PSS ~ 30-40 の管の内皮のスパーフュー ジョン法を再起動ウォッシュ アウトする分過剰色素と細胞内を許可するフラ 2 は脱エステル化するつもり。ウォッシュ アウト期間中に 37 ° c 温度コント ローラー (図 3 a) を用いたインライン ヒーター、RT から徐々 に温度を上げるし、実験中の 37 ° C で維持します。
    メモ: RT 37 ° c 間、推奨される段階的な移行は、各ステップに ≥5 分の平衡化時間と 3 つのステップ (例えば、5 ° C) を伴います。

6. [Ca2 +]と Vmの計測

  1. 他装備と Vmの測定電位計ソフトウェア スイートを入れます (図 3図 4を参照)。データ集録レートを調整 (≥10 Hz)。
  2. 鋭い電極と 2 M の KCl のバックフィルを引き出します。細胞の研究を 0.1 %propidium ヨウ化 2 M の KCl の解散の電極をバックフィル色素振込カップリング。
  3. マイクロマニピュレーターで保護された電位計ヘッド ステージ、ピペット ホルダーの塩化物で被覆された銀線電極を固定します。4 x 目的を表示ながら商工会議所で流れる PSS に電極の先端を簡単に位置するのにマニピュレーターを使用します。
  4. 接地バスとの整合性など 0 潜在的な安静時 Vmに設定します。内皮の管の細胞にだけ電極の先端を置きます。必要な場合は、潜在的な録音に音のピッチを関連付ける音ベースライン モニター electrometers にリンクを使用します。
  5. 400 x 40 x 目的を使用して倍率を大きくし、必要に応じて再電極の先端を配置します。50 〜 80 に内皮細胞に焦点を当てる測光ソフトウェアを使用して、フォト メトリック ウィンドウを調整します。
  6. マニピュレーターを用いた血管内皮の管の細胞の 1 つに優しく電極、安定させるために安静時 Vm ≥2 分を待ちます。同様に、第 1 電極で串刺しの最初のセルから別のセル (距離 ≥100 μ m) で 2 つ目の電極を挿入します。
  7. その値で安定しているが休んで Vm (-40-30 mV)6ライトの不在の蛍光インターフェイスで PMT をオンにし、また細胞内 [Ca2 +]エキサイティングなフラ 2 での取得を開始 (10 Hz) で510 で蛍光性の放出を収集しながら 340 と 380 nm nm。
    注:現在、細胞間の電気的結合をテストする (± 0.5-3 nA、~ 20 のパルス持続時間)「現場 1」として、電位計を介して1 つを配布することと Vmの変化として別の電位計で記録できる"現場 2」(距離 ≥100 μ m)。
  8. Vmと [Ca2 +]の同時測定が確立されている医薬品のアプリケーションの前に一定の流率で、PSS 内皮チューブのスパーフュー ジョン法 〜 5 分を許可します。
  9. 一定流量を superfusion 室に PSS の準備薬 (例えば、ATP) を適用します。〜 3 分 (または薬物の動態の適切な期間) 後 Vmまで、PSS を洗って、F340/F380比を基準状態に返します。ソリューションの各遷移中光度計と電位計のソフトウェア スイートの間で一時的に同期としてそれぞれの録音をマークします。
  10. 実験が終わったら、マニピュレーターを使用してセルから電極を撤回し、Vmをお知らせ 〜 0 mV バス電極によって参照されます。Vmと [Ca2 +]のそれぞれの録音を停止し、データ解析用のファイルにレコードを保存します。

7. 細胞間結合の可視化

  1. Propidium ヨウ化を介して細胞間結合を視覚化するには、40 x、60 x 蛍光目的を使用比較的高開口数と (例えば、0.95)、ソリッドステート照明、高解像度のカメラ (例えば、16 - ローダミン フィルター設定画素)、イメージング ソフトウェア スイート。

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Representative Results

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上記で説明したプロトコルの概略のデモは、添付図に表示されます。若い成人男性 C57BL/6 n マウス (5 ヶ月) から分離された脳は、図 1 aに表示されます。後大脳動脈は、ウィリス輪、結合組織せずに削除し、(図 1 bの D) のセグメントにカットから慎重に分離されています。部分的に消化動脈セグメントからそのまま内皮チューブを生産し、固定ピペットを使用してガラス製カバー スリップ上の保護します。穏やかなメカニカル ストレッチは、血管蛇行せず体内長さを近似する 2 つの固定ピペットを使用して適用されます。原稿 (図 2 a-d) でこれはさらに解明されています。後大脳動脈由来内皮の管が 〜 90-100 μ m の長さの幅と ≥ 300 μ m。チューブを搭載 Fura 2 午前 PSS とウォッシュ アウトが続きます。[Ca2 +]と内皮の管で Vmの同時測定は鋭い電極電気生理学 (実験装置の図 3図 4に示すように) と同様、Ca2 +測光によって実行されます。

内皮の管の機能評価は、生理的条件下での流れ区域に ATP など古典の内皮 GPCR アゴニストを適用することによって実行されます。ATP への応答で [Ca2 +]と Vmが同時に記録されます図 5のように、(100 μ M)。Vm (≥5 mV) の重要な過分極反応が細胞内 [Ca2 +]の増加、[Ca2 +]の上昇が SKCa/IK をアクティブにことを示すと付随して発生するCaチャネルEDH を生成するプラズマ膜により K+流出と。電流注入を使用して細胞間結合の証拠 (± 0.5、3 nA、~ 20 のパルス) 私たちの最近出版された仕事 (参照6図 1) で見つけることができます。その propidium ヨウ化イノシトール三リン酸 (IP3, 420 〜 ダ) などのギャップ結合を介した環状アデノシン一リン酸 (キャンプ、329 〜 ダ) を渡すために知られている 2 番目の使徒に関して 〜 668 Da の質量を持って注意してください。

Figure 1
図 1: 大脳動脈の脳から分離します。(A) 脳そのまま動脈 (白い矢印の後大脳動脈) dessection ソリューションで分離されました。後部の大脳動脈 (白い矢印; ~ 3 x 対. (B) 拡大鏡を表示します。パネル A)。(C) 分離後大脳動脈試料皿にステンレス製のピンで固定します。(D) 後部結合組織の除去に続いて脳の動脈。はめ込み動脈; カット セグメントに示しますスケール バー = 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 脳血管内皮の管準備します。部分的に消化動脈セグメントの triturating 用の (A) 装置= マイクロマニピュレーター、b 管、c を準備するため商工会議所 = = アルミ ステージ、d = 変らず、e = 顕微鏡、f =, マイクロシリンジ ポンプ コント ローラー。(B) 動脈セグメント (白い矢印) 酵素の消化力のためのソリューション。(C) 内皮チューブによる製粉;製粉を = ピペット、b = そのまま血管内皮の管。インセットは、外膜と平滑筋細胞を削除する製粉プロセスを示しています。スケールバー = 100 μ m (D) そのまま内皮チューブ固定ピペット; とガラス製カバー スリップ上の保護。固定 = ピペット、b = 〜 100 μ m の直径そのままの内皮チューブこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: Superfusion と同時の機器 [Ca2 +]Vm測定。内皮の管および温度制御のスパーフュー ジョン法 (A) 装置、高輝度ランプ電源を = b 蛍光システム インタ フェース、c = = 温度コント ローラー、d = superfusion システムの貯蔵所の 6 e = 光ファイバー光ファイバーソース、f 弁コント ローラー = g = [Ca2 +]測光システムの hyperswitch。(B) スパーフュー ジョン法チャンバー装置;b = headstages, c = 接地電極、d = インライン ヒーター、電子 = superfusion チューブ f 真空吸引、g = = superfusion の商工会議所、h = チャンバーを保持してアルミ ステージ。(C) 振動アイソレーション テーブル上の実験プラットフォームカメラ = セル フレーミング アダプター b 顕微鏡光、c = = 顕微鏡、d = アルミ ステージ e パッチアンプ用アダプター コントロール用のマイクロマニピュレーターを = f = 除振台。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 電気生理学・ データ記録装置。= オシロ スコープ、b = 関数発生器、c = 音のベースライン モニター、d = 50/60 Hz ノイズ フィルター、e と f = electrometers、g データ集録システムを =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 同時 [Ca2 +]Vm録音します。(A) 微分干渉コントラスト画像 (400 x) マウス脳血管内皮細胞管の調整フォト メトリック ウィンドウ 40 × 対物を使用して実験。鋭い電極は、イメージ (白い矢印) の上部に示すように、セルに配置されます。(B) 生トレース F340/F380比 (上部) ・ Vm ATP への応答 (下) の同時計測 (100 μ M)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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最近の動向6,15,16,17、照らして今 [Ca2 +] の同時測定のための準備のマウス脳血管内皮細胞を分離する方法を示すiおよび Vm 37 ° C の ~ 2 h を一貫して EDH の基になります。技術的に困難な細胞間の結合も (参照6図 1 を参照) を測定できます。この方法では、離散と同時にイベントを通知実施を測定できます。マウスの血管内皮細胞を分離しながら直面する一般的な課題のアカウント参照11,12を参照してください。マウス脳動脈内皮 [Ca2 +]と Vm、トラブルシューティングのための提案と照の代替方法についての私たちの特定の計測を隔離するための重要なステップを重視して実験の強み/弱み以下。

後大脳動脈平滑筋および内皮細胞にウィリス動脈輪と損傷することがなく結合組織から慎重な分離が必要です。手術器具 (ピンセット ・はさみ) はマウス微小循環郭清術のきれいな、シャープなエッジを持つ維持に適してする必要があります。骨格筋12に関連して、我々 半減酵素潜伏期間 3 分の 2、パパイン、コラゲナーゼ、ジチオエリトリトールの濃度によって経験的最適化エラスターゼ濃度の使用を追加中。脳動脈内皮チューブを分離することで一貫した成功のため重要ですバッチ (2 に 4 バイアル) 順序酵素に使用と貯蔵性の周波数と一致一貫製造慣行に高い評判のベンダーから。次から 1 つ多く酵素の酵素活性の変動の可能性でも 10 を 12 分以内で消化の時間を最適化しながら酵素濃度が維持されることをお勧めします。性別も (3 ~ 30 か月) 動物の年齢いる大きな障壁分離内皮の準備に我々 の経験で脳の動脈からを注目に値するです。したがって、酵素カクテルと酵素の消化力の時間の構成年齢や性別上の研究で同じに残ることをお勧めします。

強調、注意必要です穏やかな製粉と外膜と平滑筋の紡錘形細胞から血管内皮細胞の分離の間に内皮細胞12への損傷を避けるために。製粉のステップのため高粘度の鉱物油をマイクロ シリンジのピストンと撤回、または PSS を浴びて船セグメントを取り出すために水溶液の PSS 間油圧媒体として提供しています。それは、という血管は、鉱物油を連絡先、このステップ繰り返す必要があります鉱物油と PSS のシーケンシャル バックフィルできれいな製粉ピペットを使用して注意してください。実験前に、はお勧め約線形体内の長さは可能な限り、内皮の管に復元することという個々 のセルは、「フラット」縦の形態 (例えば、直径 ~ 5 μ m; 長さ ~ 100 μ m 前提として厚さ ~0.5 μ m)8。ただし、引張が試料の端の細胞がそれぞれ固定ピペットとの間に信頼性の高い携帯電話測定機械的安定性により妥協の下にから離れて引っ張っている程度に適用されません、実験。

フォト メトリック [Ca2 +]この手法で使用されるシステムの測定は内皮 [Ca2 +]iレシオ メトリック Fura 2 染料を使用しての連続測定に適しています。個々 のプロトコルは通常重要な退色なし ≥10 分を持続できます。さらに、我々 一般的データ集録、顕微鏡対物レンズ Vm計測用鋭い電極を確保するため必要に応じての頻繁に動きでタイムリーな休止時間に影響を受けやすいので、[Ca2 +]を測定するためにこの方法を使用します。これだけをキャプチャするフォト メトリック アプローチは、グローバル、[Ca2 +]複数のセル間を平均に注意してください。一般に、[Ca2 +]の測定のためお勧めします薬剤 (例えばピークと高原の段階の時間コースをするなど) に対する内皮細胞応答の初期特性評価測光する計画を確保しながら標準共焦点または多光子顕微鏡12,23を使用してイベントをシグナル創製を量的に進みます。

多細胞の生理学的な準備に統合された Vm記録の従順の鋭い電極電気生理学アプローチです。細胞内の Vmの測定は、これまで最も技術的に挑戦的な多数の重要なステップを促進するか、または測定の成功を消し去ることでです。まず、実験者は一貫して 〜 150 ± 30 の先端抵抗と鋭い電極を製造するためガラスの引き手に最適なプログラムの条件を決定する必要があります MΩ。参考のため読んでフィラメントの熱ランプ テストを使用すると、実験者がパラメーターを経験的に決定し、プルの時間を最大化しながら「熱」の設定の変化に関して特にお勧め。マニピュレーター、headstages、ピペット ホルダー、試料の次に、機械的安定性が不可欠です。除振台の明白な必要性は別として、実験者の継ぎ手はすべてが安全であるとステージ エリア周辺とマニピュレーターの下が汚れていないことを確保する必要があります。理想的には、余分なノイズ減るべきである鋭い電極記録の分解能は 1 内に mV。我々 の経験でのノイズ発生源は銀線は完全に十分な塩化物の塗装や交換が必要なピペット ホルダーに固定です。一般的な 50/60 Hz のノイズが存在する場合、「ハム雑音を黙らせる」技術は使えますし、モダンな電位計を標準付属。ノイズは完全に手に負えないの表示されている場合は、PSS が温度制御用抵抗器との接触になるバスやオーバーフローでリークがあるかどうかを確認します。安定した Vm信号をつけて合併症が残っている場合は、電気コードや t 型コネクタの整合性をチェックします。

全体で、鋭い電極記録が成功を確立している場合、それは不適切な電極、力学的不安定性や悪い細胞の健康のため一般的。また、実験者は、セル全体の電流と単一イオン チャネル録音に関する情報を得ることが、個々 の電気的共役細胞のパッチ ・ クランプの技術の構成を検討すると思うことがあります。膜電位感受性色素など、ディ 8 ANEPPS も蛍光色素 (例えば,異種細胞内載荷、漂白、イオノフォア、ささやかな検出分解能を用いた校正) を使用しての一般的な課題に直面しが市販。

血液の流れの規制して脳全体の内皮の私達の理解は急速に高齢化で重要である人間の人口と心血管疾患や神経変性疾患の頻度が増しています。したがって、我々 は脳の他の血管の構造に適合させることが、重要な脳の動脈からそのまま血管内皮細胞を分離する方法を提供します。さらに、基になる [Ca2 +]と Vmの同時測定のための有用なアプローチを示します。最後に、デュアルの細胞内電極を使用すると、細胞間のギャップ結合を介した結合も評価できます。慎重に計画された薬理学的および/または遺伝的介入と現在のプロトコルは、合理的にかつ定量的脳血管内皮機能はネイティブ形式での研究を網羅します。我々 の期待は実験者がからビルドされ、血管生物学と神経科学を一般に事前にこの情報を適応します。特に、全体で最小化電気計測に関わる一般的な実験的闘争を参照してくださいに満足ででしょう。このプロトコルは、スタンドアロン一連のテクニックの任意の手段によってではなく、それを使用できる決定する補完的なアプローチとして、正確にどのように内皮細胞生物物理決定要因は、血管抵抗とどのように彼らは調節を微調整変更に変換血流健康対.病の代表的な条件を基準にしています。

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Disclosures

著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgments

現在のプロトコルに必要な用品を確立している間優秀なテクニカル サポートありがとうチャールズ ・ ヒューイット。我々 はそれぞれ追加の倒立顕微鏡と電位計、私たちを提供するため夫妻ショーン ・ m ・ ウィルソンと LLU 周産期生物学センターからのクリストファー ・ g. ウィルソンをありがとうございます。この研究は、国立衛生研究グラント R00 AG047198 (EJB) そして Loma リンダ大学医学部新学部設立基金によってサポートされています。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

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References

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細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測
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Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

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