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Biology

Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

doi: 10.3791/58832 Published: January 20, 2019

Summary

Demostrado aquí son protocolos para el aislamiento (1) recién endoteliales cerebrales intactos "tubos" y mediciones (2) simultáneas de calcio endotelial y la membrana potencial durante la hiperpolarización derivados del endotelio. Además, estos métodos permiten ajuste farmacológico de calcio de la célula endotelial y señalización eléctrica como variables experimentales individuales o interactivas.

Abstract

Arterias cerebrales y su respectiva microcirculación entregan oxígeno y nutrientes a la regulación del flujo cerebral por medio de sangre. Las células endoteliales de la línea el lumen de los vasos sanguíneos y cambios de mando en el diámetro vascular según sea necesario para satisfacer la demanda metabólica de las neuronas. Principales vías de señalización de endotelial dependientes de hiperpolarización del potencial de membrana (Vm) y el óxido nítrico normalmente funcionan en paralelo para mediar vasodilatación y consiguiente aumento de flujo sanguíneo. Aunque parte integrante de la coordinación de vasodilatación sobre varios milímetros de longitud vascular, componentes de hiperpolarización derivado de endotelio (EDH) han sido históricamente difíciles de medir. Estos componentes de EDH implica intracelular Ca2 + [Ca2 +] aumenta y la posterior activación de pequeñas e intermedias conductancia de Ca2 +-activado K+ (SKCa/IKCa) canales.

Aquí, presentamos una ilustración simplificada del aislamiento de fresco endotelio de arterias cerebrales de ratón; medidas simultáneas de endotelial [Ca2 +] y Vm con Fura-2 fotometría y electrodos agudos intracelulares, respectivamente; y una superfusion continua de soluciones de sal y agentes farmacológicos bajo condiciones fisiológicas (pH 7,4, 37 º C). Arterias cerebrales posteriores desde el círculo de Willis se quitan de la comunicación posterior y las arterias basilares. Digestión enzimática de segmentos arteriales cerebrales posteriores limpiados y posterior trituración facilita la eliminación de la adventicia, los nervios perivasculares y las células musculares lisas. Resultantes posteriores cerebrales arteriales endoteliales "tubos" entonces están asegurados bajo un microscopio y examinaron usando una cámara, tubo fotomultiplicador, y uno o dos electrómetros bajo superfusion continua. Colectivamente, este método puede medir simultáneamente cambios endoteliales [Ca2 +] y Vm en localizaciones celulares discretos, además de separarse de la EDH a través de uniones comunicantes hasta distancias de milímetros a lo largo de la intacta endotelio. Este método se espera que un análisis de alto rendimiento de las funciones endoteliales cerebrales subyacen mecanismos de regulación de flujo de sangre en el cerebro normal y enferma.

Introduction

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Flujo de sangre a través del cerebro está regulado por la coordinación de la vasodilatación cerebrales arterias y arteriolas en redes vasculares1. Células endoteliales que recubren cambios de comando resistencia cerebral arterias de diámetro vascular cuando sea necesario para satisfacer la demanda metabólica de las neuronas1,2,3. En particular, durante la hiperpolarización derivado de endotelio (conocido comúnmente como EDH), intracelular Ca2 + ([Ca2 +]) y señalización eléctrica en células endoteliales vasodilatación coordinar entre las células endoteliales y su alrededor de las células musculares lisas a través de uniones comunicantes para relajación arterial4. Iniciación fisiológica de EDH secuencialmente implica estimulación de Gq-junto a los receptores (GPCRs), un aumento de [Ca2 +]y la activación endotelial de pequeño y medio Ca2 +-activado K+ (SKCa/IKCa) canales para hyperpolarize la membrana endotelial cerebral potencial (Vm)5,6,7. Así, la íntima relación de endotelial [Ca2 +] y Vm es parte integral de regulación del flujo sanguíneo e indispensable para cardio - y cerebrovasculares función6,8. A lo largo de la literatura general, numerosos estudios han reportado la Asociación de la disfunción endotelial vascular con el desarrollo de enfermedades crónicas (p. ej., hipertensión, diabetes, insuficiencia cardíaca, enfermedad coronaria, insuficiencia renal crónica, enfermedad arterial periférica)9,10, indicando la importancia de estudiar la función endotelial en condiciones fisiológicas como patológicas.

Endotelio vascular es esencial para la producción de hiperpolarización, vasodilatación y perfusión del tejido y por lo tanto, la examinación de sus propiedades nativas de celulares es crucial. Como modelo de estudio general, preparación del modelo de tubo endotelial arterial de ratón ha sido publicado antes por músculo esquelético11,12,13de intestino, pulmón14y recientemente por el cerebro6. Estudios de simultánea [Ca2 +] y Vm medidas en particular se han publicado para músculo esquelético endotelio arterial15,16 , así como del endotelio de vasos linfáticos17. Además de los estudios primarios utilizando el enfoque de tubo endotelial, una revisión exhaustiva de sus ventajas y desventajas8 puede consultarse para determinar si esta herramienta experimental es apropiada para un estudio específico. En Resumen, una ventaja es que se conservan los componentes fisiológicos clave de la función endotelial de la célula (e.g., Ca2 + afluencia y liberación intracelular, hiperpolarización de Vm hasta el potencial de Nernst para K+ a través de /IK de SKCaCa activación y acoplamiento intercelular endotelial a través de uniones comunicantes) sin confundir factores tales como la entrada de nervios perivasculares, músculo liso canal voltaje-bloqueado función y contractilidad, circulación de la sangre y las influencias hormonales8. Por el contrario, enfoques de cultura celular utilizado introducen alteraciones significativas en la morfología18 y ion canal expresión19 de manera que puede ofuscar mucho las comparaciones con observaciones fisiológicas determinadas ex vivo o en vivo. Limitaciones incluyen la falta de integración con otros componentes esenciales para la regulación del flujo sanguíneo, como el músculo liso y flexibilidad restringida en un programa experimental, como este modelo es probado óptimamente dentro de 4 h de aislamiento de segmento vascular intacto del animal.

Construcción de un protocolo anterior vídeo por Socha y Segal12 y las últimas novedades experimentales en el provisional6,15,16, por este medio demostrar el aislamiento del endotelio fresco de las arterias cerebrales posteriores y mediciones simultáneas de endotelial [Ca2 +] y Vm con Fura-2 fotometría y electrodos agudos intracelulares, respectivamente. Además, este experimento implica superfusion continua de soluciones de sal y agentes farmacológicos durante condiciones fisiológicas (pH 7,4, 37 º C). Elegimos la arteria cerebral posterior, como rendimiento aislado endotelio con la integridad estructural (células juntadas a través de uniones comunicantes) y dimensiones suficientes (≥50 μm de ancho, longitud ≥300 μm) favorables para intra - e intercelular señalización a lo largo y entre células endoteliales. Además, estudios de la arteria cerebral posterior roedor substancialmente están representados en la literatura y abarcan análisis de fundamentales mecanismos de señalización endoteliales, vascular desarrollo/envejecimiento y patología20, 21 , 22. esta aplicación experimental se espera que un análisis de alto rendimiento de la función endotelial cerebral (y disfunción) y así permitirá avances significativos en la comprensión de la regulación del flujo de sangre a lo largo de envejecimiento y el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas.

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Protocol

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Antes de realizar los siguientes experimentos, asegurar que todo el cuidado animal y protocolos aprobados por la atención institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) y realizados de acuerdo con del Consejo Nacional de investigación ''guía para el cuidado y uso de Animales de laboratorio" (8th edición, 2011) y las directrices para llegar. La IACUC la Universidad de Loma Linda ha aprobado todos los protocolos utilizados para este manuscrito para ratones C57BL/6 machos y hembras (rango de edad: 3 a 30 meses).

1. equipos y materiales

Nota: Detalles de materiales necesarios para el protocolo pueden encontrarse en la Tabla de materiales, reactivosy manuales o sitios web asociado a los proveedores respectivos.

  1. Cámara de flujo
    1. Fije una cámara superfusion con fondo de vidrio cubreobjetos en una plataforma de aluminio anodizado. Asegure la plataforma con la cámara en un escenario de aluminio compacto.
    2. Establecer un micromanipulador en cada extremo de la plataforma en la etapa de aluminio para sujetar la pipeta de fijación.
      Nota: Como una opción práctica, utilice este aparato etapa transferibles con una unidad de la cámara de flujo para facilitar la transición del aislamiento del tubo endotelial al rendimiento de los experimentos.
  2. Microscopios
    1. Estereomicroscopio de uso (5 x rango de aumentos x 50) equipados con fuentes de luz óptica de fibra para los procedimientos de disección macro y micro.
    2. Para la preparación de tubos endoteliales, usar un microscopio invertido, dotado de fase contraste o diferencial de interferencia (DIC) de contraste compatible con objetivos (10 x, 20 x y 40 x) y una etapa de aluminio.
    3. Para aislar los tubos endoteliales de los vasos sanguíneos parcialmente digeridos, coloque un controlador de bomba de microjeringa adyacentes al aparato de preparación tubo endotelial.
    4. Para el aparato experimental, usar un microscopio invertido, dotado de objetivos estándar (4 x y 10 x) además de objetivos fluorescentes (20 x y 40 x, apertura numérica 0.75) y una etapa de aluminio manual en una tabla de aislamiento de vibración.
  3. Equipo de grabación intracelular
    1. Para grabar el Vm de las células endoteliales en tubos endoteliales aislados, conecte el electrómetro headstage compatible. Si es necesario, conecte un generador de funciones o estimulador el electrómetro para experimentos que requieren inyección de corriente.
    2. Conecte las salidas del amplificador a un sistema de adquisición de datos, monitores de referencia audible y un osciloscopio. Fije el electrodo de referencia (Ag/AgCl pellet) cerca de la salida de la cámara de flujo durante los experimentos.
    3. Utilizar un sistema fotométrico con componentes integrados de fluorescencia sistema interfaz, alta intensidad lámpara de arco y poder suministro, hyperswitch, tubo fotomultiplicador (o PMT) y la cámara para medir la [Ca2 +] en las células endoteliales.
    4. Utilice un controlador de temperatura con un calentador en línea para elevar y mantener una temperatura fisiológica (37 º C) durante todo el experimento.
    5. Utilizar una plataforma de seis depósito conectada a un controlador de la válvula con una válvula de control de flujo en línea para el control de la entrega de las respectivas soluciones al tubo endotelial asegurada en la cámara.
  4. Micropipetas y electrodos afilados
    Nota: Para la fabricación de pipetas para la trituración y la estabilización mecánica de tubos endoteliales aisladas, utilizar un extractor electrónico para tirar de las pipetas y micro-Fragua de última hora y fuego pulido.
    1. Para separar la adventicia, músculo liso y el tubo endotelial del segmento arterial parcialmente digerido, preparar trituración pipetas (cada uno con un diámetro interno de la punta de 80-120 μm) según corresponda, utilizando tubos capilares de vidrio de borosilicato y fuego pulir la punta.
    2. Para asegurar el tubo endotelial contra la parte inferior de la cámara superfusion, utilizar pipetas de fijación con un extremo embotado, esférico (calor-pulido, OD de 100 – 150 μm; preparado a partir de tubos de vidrio de borosilicato de pared delgada).
    3. Para grabar Vm de una célula endotelial, preparar electrodos afilados con una resistencia de punta de ~ 150 ± 30 MΩ de tubos capilares de vidrio utilizando un extractor electrónico.

2. preparación de soluciones y medicamentos

  1. Solución salina fisiológica (PSS)
    1. Para un experimento con preparaciones de la droga, prepare un mínimo de 1 L de utilizar PSS: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic (HEPES) de 10 mM y 10 mM de glucosa.
    2. Para preparar las soluciones necesarias para la disección, aislamiento de la arteria cerebral y la preparación del tubo endotelial, preparar PSS falta CaCl2 (cero Ca2 + PSS).
    3. Preparar todas las soluciones en ultrapura desionizada H2O, ajustar el pH a 7.4, esterilizar a través de un filtro (tamaño de poro de 0,22 μm) y asegurarse de que la osmolalidad de las soluciones es entre 290 y 300 mOsm.
      Nota: Soluciones pueden almacenarse a 4 ° C durante aproximadamente dos semanas.
  2. 10% de albúmina sérica bovina (BSA)
    1. Para preparar 10% BSA, disolver 1 g de polvo liofilizado en un vaso de precipitados de 10 mL cero Ca2 + PSS.
    2. Cubrir el vaso con la película de parafina y permitir un período de varias horas de pasar, con agitación lenta de la BSA disolver.
    3. Filtrar la solución final usando una jeringa de 10 mL más un filtro de 0,22 μm y hacer alícuotas de 1 mL para ser almacenado a-20 ° C.
  3. Solución de disección
    1. Para preparar 50 mL de solución de disección, Añadir 500 μl de BSA (10%) a 49,5 mL de cero Ca2 + PSS.
    2. Inmediatamente después de la preparación, la transferencia esta solución de disección en una placa de Petri para la disección arterial.
  4. Solución de disociación
    1. Para preparar 50 mL de solución de disociación, añadir 5 μl de CaCl2 (1 M) y 500 μl de BSA (10%) a 49,5 mL de cero Ca2 + PSS. Dejar la solución a temperatura ambiente (RT).
  5. Enzimas
    1. Para la digestión parcial de los segmentos arteriales, preparar 1 mL de solución de digestión con papaína 0,31 mg/mL, 0.5 mg/mL dithioerythritol, colagenasa de 0,75 mg/mL (mezcla de tipo H) y elastasa de 0,13 mg/mL.
      Nota: Actividades enzimáticas pueden variar; sin embargo, nuestros protocolos exitosos, actividades enzimáticas comercialmente suministrados han sido utilizadas como sigue: papaína ≥ 10 unidades/mg; colagenasa ≥1 unidades/mg, para volumen de sustrato N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala o FALGPA; y elastasa ≥ 5 unidades/mg.
  6. Preparación de Fura-2 y agentes farmacológicos
    1. Preparar stock concentración (1 mM) de Fura-2 tinte de AM en DMSO. Preparar una concentración de trabajo (10 μm) mediante la adición de 5 μl del stock a 495 μl de PSS para la carga.
    2. Preparar ≥50 mL de las concentraciones de los agentes farmacológicos (p. ej., ATP) de trabajo PSS según el caso.
  7. Realización de solución
    1. Preparar la realización de una solución 2 M de KCl, por disolución de KCl en desionizada H2O (7,455 g KCl en 50 mL de H2O).
    2. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa 0,22 μm antes de rellenar los electrodos afilados.
  8. Yoduro de propidio (0.1%)
    1. Disolver 10 mg de yoduro de propidio liofilizado 10 ml de 2 M de KCl.
    2. Mezclar bien y guardar a TA.

3. disección y aislamiento de la arteria Cerebral

Nota: Todos los procedimientos de disección requieren ampliación de muestra (hasta 50 x) a través de la iluminación proporcionada por fuentes de luz óptica de fibra y Estereomicroscopio. Para realizar procedimientos de disección para el aislamiento de las arterias y el cerebro, utilizar instrumentos de disección afilada. Instrumentos de microdisección para aislar y limpiar las arterias incluyen pinzas de punta fina afiladas y tijeras de Vannas estilo disección (hojas de 3 a 9.5 mm).

  1. Aislamiento de cerebro de ratón
    1. Anestesiar una C57BL/6 ratón (3-30 meses viejo, hombres o mujeres) a través de la inhalación de isoflurano (3% para 2 a 3 minutos) y luego decapitar el animal inmediatamente después de la inducción completa de la anestesia. Coloque la cabeza en un plato de Petri (diámetro 10 cm, profundidad 1.5 cm) que contienen frío (4 ° C) cero Ca2 + PSS bajo un estereomicroscopio.
    2. Visualización a través del microscopio, quitar la piel y el cabello sobre el cráneo y retire el exceso de sangre con frío cero Ca2 + PSS. Hacer una incisión usando sólo las puntas de las tijeras de disección estándar (por ejemplo, hoja de 24 mm), empezando por el hueso occipital y que se extiende hacia arriba a través del hueso nasal del cráneo.
    3. Abrir el cráneo con cuidado a lo largo de la incisión utilizando pinzas con punta gruesa y separado del tejido conectivo para aislar el cerebro con un círculo intacto de Willis.
      Nota: Alternativamente, pueden utilizarse Littauer pinzas de corte de hueso para abrir el cráneo y exponer el cerebro.
    4. Lave suavemente el cerebro aislado con frío cero Ca2 + PSS en un vaso de precipitados para eliminar sangre. Coloque el lado ventral del cerebro hacia arriba en un compartimiento que contenga solución de disección en frío para el aislamiento de las arterias cerebrales (figura 1A).
  2. Aislamiento de arterias cerebrales
    Nota: La arteria cerebral posterior ha sido seleccionada como modelo de estudio endoteliales cerebrovasculares representativo de este protocolo.
    1. Garantizar el cerebro aislado en la solución de la disección en frío con pernos de acero inoxidable (diámetro 0,2 mm, longitud ~ 11-12 mm) para ser insertado en un polímero de silicio carbón-infundido cubriendo la parte inferior (profundidad ≥ 50 cm) de una placa de Petri de vidrio.
    2. Para mantener una temperatura fría de PSS durante la disección, utilizar una cámara de disección enfriada por un sistema de refrigeración continua ciclismo una mezcla de 1:1 agua-etileno glicol. Alternativamente, puede realizarse la disección en hielo fresco.
    3. Quirúrgico, aislar las arterias cerebrales posteriores (~0.3 a segmentos de 0.5 cm, ninguna tensión axial) de la comunicación posterior y arterias basilares usando el microdissection instrumentos Vannas estilo tijeras y pinzas de punta fina afiladas (figura 1B ). Usar pernos de acero inoxidable (diámetro 0,1 mm, longitud ~ 13-14 mm) a aislaron seguro ambas arterias cerebrales posteriores en la solución de la disección en el plato de Petri (figura 1).
    4. Limpiar cuidadosamente las arterias cerebrales posteriores aisladas mediante la eliminación de tejido conectivo con afiladas pinzas de punta fina (figura 1). Cortar segmentos de arterias intactas (longitud 1-2 mm) para la digestión enzimática (figura 1, recuadro).

4. preparación de tubo endotelial y Superfusion

Nota: El tubo endotelial está preparado como se describió anteriormente12, con modificaciones para la arteria cerebral6.

  1. Preparar el aparato de trituración utilizando un microscopio equipado con objetivos (10 x, 20 x y 40 x), una cámara y una etapa de aluminio con una cámara y micromanipuladores. Asegure una microjeringa con un controlador de bomba junto a la etapa y la muestra (figura 2A).
  2. Totalmente relleno una trituración pipetear con aceite mineral y fijarlo sobre el émbolo de la jeringa de micro. Luego, con la jeringa de micro controlador de la bomba, retirar solución disociación dentro de la pipeta (~ 130 nl) en la parte superior el aceite mineral al tiempo que garantiza la ausencia de burbujas de aire en la pipeta.
  3. Lugar intactos segmentos arteriales en 1 mL de solución de disociación en un tubo de vidrio de 10 mL (figura 2B), que contiene papaína 0,31 mg/mL, 0.5 mg/mL dithioerythritol, colagenasa de 0,75 mg/mL y elastasa de 0,13 mg/mL. Incubar a 34 ° C por 10 – 12 min para una digestión parcial.
  4. Después de la digestión, reemplazar la solución de enzima con ~ 5 mL de solución fresca de disociación. Con una pipeta de 1 mL, transferir un segmento en una cámara que contiene la solución de disociación a TA.
  5. Coloque la pipeta en la solución de disociación en la cámara y colocarlo cerca de un extremo de la embarcación digerido. Establecer una tasa dentro del rango de 2 a 5 nL/s del controlador de bomba para trituración suave (figura 2, encarte).
  6. Mientras la visión a través de x 100 a 200 aumentos, retirar y extraer el segmento arterial para disociar las células de músculo liso produciendo un tubo endotelial. Si es necesario, cuidadosamente utilizar pinzas de punta fina para separar el tubo endotelial disociado de la adventicia y la lámina elástica interna. Confirmar que todas las células del músculo liso son disociadas y que las células endoteliales sólo permanecen como un intacto "tubo" (figura 2).
  7. Con micromanipuladores, Asegure cada extremo del tubo endotelial en la hoja de cubierta de vidrio de la cámara superfusion usando el vidrio de borosilicate fijación pipetas (Figura 2D).
  8. Lavado había disociado adventicia y las células musculares lisas de la cámara y reemplazar la solución de disociación con 2 mM de CaCl2 PSS. La transferencia de la plataforma móvil con seguro tubo endotelial en el microscopio del aparejo superfusion y experimental.
  9. Utilice 6 embalses de 50 mL limpio (Figura 3A) para la entrega continua de PSS y soluciones respectivas drogas durante el experimento, según corresponda. Utilice la válvula de control de flujo en línea para ajustar manualmente el caudal a lo largo como constante con flujo laminar mientras que empareja a la succión del vacío de flujo. Entregar PSS a la cámara (figura 3B) para la superfusion del tubo endotelial para ≥ 5 minutos antes de grabar los datos de fondo y carga de tinte.

5. carga tinte, lavado y temperatura

  1. Encender todos los componentes del sistema de fotometría para medir la [Ca2 +]. Utilizar el microscopio en la plataforma experimental (figura 3) que ve el tubo endotelial a 400 aumentos y enfoque en las células en la ventana fotométrica utilizando la suite de software de sistema de fotometría.
  2. Mida el diámetro del tubo endotelial y anote los valores de Autofluorescencia de fondo de acuerdo con 510 emisión nm durante la excitación alterna a 340 y 380 nm (≥ 10 Hz).
  3. Para medir la [Ca2 +]yo respuestas, carga el tubo endotelial con Fura-2 soy del tinte (concentración final de 10 μm) a temperatura ambiente y permiten ~ 30-40 min en ausencia de luz.
  4. Reiniciar superfusion del tubo endotelial con dulce PSS de ~ 30-40 minutos de lavado el exceso de colorante y permite intracelular Fura-2 estoy a esterificar. Durante el período de lavado, levante la temperatura gradualmente de RT a 37 ° C con un calentador en línea con el regulador de temperatura (Figura 3A) y mantener a 37 ° C durante todo el experimento.
    Nota: La transición incremental recomendada entre RT a 37 ° C conlleva tres pasos (por ejemplo, 5 ° C) con un tiempo de equilibrado de ≥5 min en cada paso.

6. medida simultánea de [Ca2 +]i y Vm

  1. Encienda todos los equipos y la suite de software de Electrómetro para medir Vm (ver figura 3, figura 4). Ajustar en consecuencia la tasa de adquisición de datos (≥ 10 Hz).
  2. Tire un afilado electrodo y rellene con 2 M de KCl. Estudios de intercelular de acoplamiento mediante transferencia del tinte, relleno los microelectrodos con yoduro de propidio 0.1% disuelto en 2 M de KCl.
  3. Fije el electrodo sobre un alambre de plata cubierto con cloruro en el soporte de pipeta adjunto a una etapa principal de Electrómetro con un micromanipulador. Utilizar el instrumental quirúrgico para brevemente, coloque la punta del electrodo en el PSS que fluye en la cámara mientras la visualización a través del objetivo de 4 x.
  4. Establecer el descanso Vm 0 como constante con baño conectado a tierra potencial. Coloque la punta del electrodo a poco más de una célula del tubo endotelial. Si lo desea, utiliza monitores de referencia audible electrómetros se relaciona a asociar tono sonido de posibles grabaciones.
  5. Aumentar la magnificación 400 x utilizando el objetivo 40 x y vuelva a colocar la punta del electrodo según sea necesario. Ajustar la ventana fotométrica mediante el software de fotometría para centrarse en las células endoteliales ~ 50 a 80.
  6. Suavemente Coloque el electrodo en una de las células del tubo endotelial utilizando el instrumental quirúrgico y esperar ≥ 2 min de reposo Vm a estabilizar. Del mismo modo, inserte un segundo electrodo en otra celda (distancia ≥100 μm) de la primera célula empalada con el primer electrodo.
  7. Una vez que reposo Vm es estable a los valores esperados (-30 a -40 mV)6, encienda el PMT en la interfaz de fluorescencia en ausencia de luz y comenzar la adquisición de intracelular [Ca2 +] por emocionante Fura-2 alternativamente (10 Hz) en 340 y 380 nm mientras que recoge la emisión de fluorescencia a 510 nm.
    Nota: Para probar el acoplamiento eléctrico intercelular, actual (± 0.5-3 nA, duración del pulso del ~ 20 s) se puede entregar a través de un Electrómetro "Sitio 1", y cambios de Vm se pueden grabar con otro Electrómetro como "sitio 2" (distancia ≥100 μm).
  8. Una vez que se establecen medidas simultáneas de Vm y [Ca2 +] , permiten ~ 5 min para la superfusion de tubo endotelial con PSS en un flujo laminar constante antes de la aplicación de medicamentos.
  9. Aplicar la droga (e.g., ATP) preparada en PSS la superfusion cámara con flujo constante. Después de ~ 3 minutos (o un período de tiempo apropiado para la cinética de la droga), lavado con PSS hasta Vm y F340/f380 relación regresan a sus condiciones de línea de base. Marque las grabaciones respectivas como temporal sincronizado a través de las suites de software fotómetro y Electrómetro durante cada transición de soluciones.
  10. Una vez hecho el experimento, retirar el electrodo de la celda usando el instrumental quirúrgico y aviso Vm ~ 0 mV como referencia por el electrodo del baño. Deje de respectivas grabaciones de Vm y [Ca2 +] y guardar los registros en el archivo de análisis de datos.

7. visualización de acoplamiento de célula a célula

  1. Para visualizar la celda a celda de acoplamiento a través de propidio, uso un 40 x o 60 x fluorescente objetivo con una apertura numérica relativamente alta (por ejemplo, 0.95) y filtro de rodamina con iluminación de estado sólida, una cámara de alta resolución (por ejemplo, 16- megapíxeles) y una suite de software de proyección de imagen.

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Representative Results

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La demostración esquemática del protocolo descrito anteriormente se muestra en las figuras adjuntas. Un cerebro de un ratón C57BL/6N macho adulto joven (5 meses) se muestra en la figura 1A. Arterias cerebrales posteriores están cuidadosamente aisladas del círculo de Willis, retira el tejido conectivo y cortar en segmentos (figura 1B-D). De segmentos arteriales parcialmente digeridos, el tubo endotelial intacto es producido y asegurado en la hoja de cubierta de vidrio utilizando pipetas de fijación. Estiramiento mecánico suave se aplica utilizando dos pipetas de fijación para aproximar la longitud en vivo sin tortuosidad de vasos. Esto se ha aclarado aún más en el manuscrito (figura 2A-D). Tubos endoteliales aislados de las arterias cerebrales posteriores son ~ 90 – 100 μm de anchura y ≥300 μm de longitud. El tubo se carga con Fura-2 AM seguido por lavado-hacia fuera con PSS. Medición simultánea de la [Ca2 +] y Vm en el tubo endotelial se realiza por fotometría de Ca2 + como sharp electrofisiología de electrodo (plataforma experimental se muestra en la figura 3 y figura 4).

Evaluación funcional del tubo endotelial se realiza aplicando un clásico agonista endotelial GPCR como ATP en la cámara de flujo bajo condiciones fisiológicas. Como se muestra en la figura 5, [Ca2 +] y Vm se registran simultáneamente en respuesta a la ATP (100 μm). Una hiperpolarización significativa de Vm (≥5 mV) ocurre concomitante con intracelular [Ca2 +] aumento, lo que indica que un aumento de [Ca2 +] activa SKCa/IK canales deCa y permite así el eflujo de K+ a través de la membrana plasmática para producir EDH. Evidencia de acoplamiento intercelular mediante inyección actual (± 0.5 a 3 nA, ~ 20 pulsos de s) que podrá encontrar en nuestro trabajo recientemente publicado (referencia6, figura 1). Tenga en cuenta que el yoduro de propidio tiene una masa de ~ 668 Da en referencia a segundos mensajeros conocido para pasar a través de uniones comunicantes como trifosfato de inositol (IP3, Da ~ 420), monofosfato de adenosina cíclico (campo, Da ~ 329).

Figure 1
Figura 1 : Aislamiento de la arteria cerebral cerebro. (A) cerebro aislada con arterias intactas (flecha blanca indica la arteria cerebral posterior) en la solución de dessection. Ve ampliada (B) de la arteria cerebral posterior (flecha blanca; ~ 3 x vs. Panel A). (C) aislado posteriores arterias cerebrales aseguradas con pernos de acero inoxidable en plato de muestra. (D) Posterior arterias cerebrales después de la extracción de los tejidos conectivos. El recuadro muestra el corte de los segmentos de las arterias; Barra de escala = 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Preparación del tubo endotelial cerebral. (A) equipo utilizado para la trituración de los segmentos arteriales parcialmente digeridos; un = micromanipulador, b = compartimiento para elaboración de tubo, c = etapa de aluminio, d = microjeringa, e = microscopio, f = microjeringa bomba el controlador. (B) segmentos arteriales (flechas blancas) en la solución de digestión enzimática. (C) tubos endoteliales elaborados por trituración; un = trituración, el b = tubo endotelial intacta. El recuadro muestra el proceso de trituración para eliminar adventicia y las células musculares lisas; Barra de escala = 100 μm. (D) un tubo endotelial intacto sobre el cubreobjetos de cristal con pipeta de fijación; un = alfileres, el b = tubo endotelial intacta con diámetro de ~ 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Equipo para superfusion y simultánea [Ca2 +] me y V m medidas de. (A) equipo para superfusion del tubo endotelial y el control de la temperatura, a = fuente de alimentación de la lámpara de arco de alta intensidad b = interfaz de sistema de fluorescencia, c = regulador de temperatura, d = 6-embalses del sistema superfusion, e = luz óptica de fibra fuentes, f = controlador de la válvula, g = hyperswitch de [Ca2 +] fotometría sistema. Aparato de cámara Superfusion (B); un y b = headstages c = electrodo de tierra, d = en línea calentador, e = tubería superfusion, f = g succión, vacío = cámara superfusion, h = etapa de aluminio sosteniendo la cámara. Plataforma Experimental (C) en una tabla de aislamiento de vibración; un adaptador de estructura = celular con cámara, b = c luz, microscopio = microscopio, d = etapa de aluminio e = instrumental quirúrgico para el control de headstage, f = tabla de aislamiento de la vibración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Equipo para la operación de electrofisiología y grabación de datos. un = osciloscopio, b = generador de función, c = línea base acústica monitor, d = filtro de ruido de 50/60 Hz, e y f = electrómetros, g = sistema de adquisición de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Simultáneo [Ca2 +] me y V m grabaciones. (A) imagen de contraste de interferencia diferencial (400 x) de un tubo endotelial arterial cerebral de ratón ajusta para experimento en ventana fotométrico usando un objetivo de 40 x. Un electrodo agudo se coloca en una celda, como se muestra en la parte superior de la imagen (flecha blanca). Rastros crudos (B) para la medición simultánea de F340/f380 relación (arriba) y Vm (parte inferior) en respuesta a la ATP (100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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A la luz de recientes desarrollos6,15,16,17demostramos ahora el método para aislar el endotelio arterial cerebral de ratón en preparación para la medición simultánea de [Ca2 +] i y V dem subyacentes EDH constantemente para ~ 2 h a 37 ° C. Aunque es técnicamente difícil, podemos medir células así de acoplamiento (véase la referencia6, figura 1). De esta manera, podemos medir discreta y realizado eventos de señalización al mismo tiempo. Para una cuenta de los desafíos generales mientras que aislar el endotelio arterial ratón consulte referencias11,12. Hacemos hincapié en los pasos críticos para aislar las arterias cerebrales de ratón, nuestras mediciones particulares de endotelial [Ca2 +] y Vm, sugerencias para la solución de problemas y consideraciones para métodos alternativos a la luz de experimental las fortalezas/debilidades a continuación.

La arteria cerebral posterior requiere aislamiento cuidadoso del círculo de Willis y tejido conectivo sin daño a músculo liso y células endoteliales. Instrumentos quirúrgicos (pinzas y tijeras) deben ser adecuados para procedimientos de disección de microcirculación de ratón mientras mantiene con limpiamos, aristas. Comparado con músculo esquelético12, hemos reducido el período de incubación enzimática por dos tercios y las concentraciones de papaína, colagenasa y dithioerythritol por la mitad mientras que agrega el uso de una concentración empíricamente optimizada de elastasa. Éxito consistente en el aislamiento de tubos endoteliales arteriales cerebrales, es importante para las enzimas de la orden en lotes (2 a 4 ampollas) de un proveedor altamente reputable con las prácticas de la fabricación constante de acuerdo con la frecuencia de uso y vida útil. Incluso con la posibilidad de variación en la actividad enzimática de una porción de la enzima a la siguiente, se recomienda mantener las concentraciones de la enzima al tiempo que optimiza el tiempo de digestión dentro de 10 a 12 minutos. Cabe señalar que ni el género ni la edad del animal (3 a 30 meses) ha sido una barrera importante a la preparación del endotelio aislada de las arterias cerebrales en nuestra experiencia. Por lo tanto, se recomienda que la composición de la enzima coctel y el tiempo de digestión de la enzima siguen siendo los mismos en estudios sobre edad y género.

Como destacado, precaución se requiere durante la trituración suave y aislamiento del endotelio adventicia y las células musculares lisas fusiformes con el fin de evitar daños a las células endoteliales12. Para la etapa de trituración, el viscoso aceite mineral sirve como un medio hidráulico entre el pistón de la jeringa de micro y PSS acuoso con el fin de retirar o expulsar segmentos de vasos bañados en PSS. Cabe señalar que si el segmento vascular entra en contacto con el aceite mineral, este paso debe repetirse con una pipeta limpia trituración secuencial rellenar de aceite mineral y PSS. Antes de un experimento, se recomienda que una longitud de aproximadamente lineal en vivo se restablece en el tubo endotelial a la medida de lo posible, por el que las células individuales asumen una morfología "plana", longitudinal (por ejemplo, diámetro ~ 5 μm, longitud ~ 100 μm; espesor ~0.5 μm)8. Sin embargo, no debe aplicarse tensión axial en la parte donde están tirando de las células en los bordes de la pieza de debajo de pipetas de fijación respectivos y así comprometer estabilidad mecánica para mediciones fiables celulares durante el experimento.

El fotométrico [Ca2 +] sistema utilizado en esta técnica de medición es adecuado para mediciones continuas de endotelial [Ca2 +]i usando la radiométrica tinte Fura-2. Protocolos individuales pueden durar típicamente ≥10 min sin fotoblanqueo significativa. Además, comúnmente utilizamos este enfoque para medir la [Ca2 +] porque es favorable a la oportuna pausa en movimiento frecuente de objetivos de microscopio según sea necesario para garantizar el sostenido electrodos para medidas dem V y adquisición de datos. Tenga en cuenta que este es un método fotométrico que solo captura global, un promedio de [Ca2 +]yo entre varias celdas. En general, para la [Ca2 +] mediciones, recomendamos fotometría para la caracterización inicial de las respuestas de la célula endotelial a agentes farmacológicos (por ejemplo, curso de, tiempo de fases pico y meseta) mientras que mantienen planes para proceder a cuantificar microdomain señalización de eventos utilizando microscopía confocal o multifotón estándar12,23.

El enfoque de electrofisiología electrodo agudo es favorable para grabaciones dem V integradas en preparaciones multicelulares fisiológicas. La medición de intracelular Vm es por lejos el más técnicamente difícil con numerosos pasos críticos que pueden facilitar o borrar el éxito de las medidas. En primer lugar, el experimentador debe determinar las condiciones del programa óptima en un tirador de cristal para constantemente fabricación electrodos afilados con una resistencia de punta de ~ 150 ± 30 MΩ. Mediante una prueba de rampa de calor del filamento de lectura como referencia, se recomienda que el experimentador determinar parámetros empírico, particularmente con respecto a la variación en el ajuste del "calor" mientras se maximiza el tiempo de extracción. Estabilidad mecánica, próximo de micromanipuladores, headstages, titulares de la pipeta y muestra es absolutamente crítica. Aparte de la obvia necesidad de una tabla de aislamiento de vibración, el experimentador deberá asegurarse de que todas las conexiones estén seguras y que el área de la etapa alrededor y por debajo de los manipuladores es limpio. Idealmente, los ruidos extraños deben reducirse en la medida en que la resolución de grabaciones de electrodo agudo es de 1 mV. En nuestra experiencia, la fuente más común del ruido es alambre de plata asegurada en el soporte de pipeta que necesita una capa suficiente de cloruro o reemplazo en conjunto. Si hay ruido común de 50/60 Hz, tecnología "hum silenciamiento" puede ser utilizada y viene estándar con un Electrómetro moderna. Si el ruido aparece totalmente inmanejable, compruebe si hay una fuga en el baño o desbordamiento donde PSS entrará en contacto con resistencias para el control de la temperatura. Si las complicaciones siguen siendo con la adquisición de una señal estable dem V, comprobar la integridad de cables eléctricos y conectores en t.

En conjunto, si el establecimiento de que un registro de electrodo agudo es fracasado, es comúnmente debido a un electrodo inadecuado, inestabilidad mecánica o mala salud celular. Alternativamente, el experimentador también puede desear considerar una configuración de la técnica de patch-clamp en células individuales, eléctricamente desacopladas donde puede obtenerse información sobre corrientes de células enteras y grabaciones de canal de iones individuales. Aunque frente a los desafíos generales de la utilización de un colorante fluorescente (heterogénea carga intracelular, , blanqueo, calibración, uso de ionóforos, resolución modesta detección), sensible a la tensión de colorantes tales como Di-8-ANEPPS son también disponible en el mercado.

Nuestra comprensión del endotelio en la regulación del flujo de sangre a y a través del cerebro es crucial con un rápido envejecimiento población humana y la creciente incidencia de enfermedades crónicas cardiovasculares y neurodegenerativas. Por lo tanto, proporcionamos un método para aislar el endotelio intacto de una vital arteria cerebral, que puede ser adaptada a otras estructuras vasculares en el cerebro. Además, mostramos un método útil para mediciones simultáneas de subyacente [Ca2 +] y Vm. Finalmente, utilizando dos electrodos intracelulares, célula a célula de acoplamiento a través de uniones comunicantes puede también ser evaluada. Con intervenciones farmacológicas y/o genéticas cuidadosamente planeadas, el protocolo actual razonablemente y cuantitativamente incluye estudio de la función endotelial cerebral en su forma nativa. Nuestra expectativa es que los experimentadores construir y adaptar esta información para avanzar en Neurociencia y biología vascular en general. En particular, sería satisfactorio ver luchas comunes de experimentales con mediciones eléctricas minimizadas en conjunto. Aunque este Protocolo no es un conjunto independiente de técnicas por cualquier medio, puede ser utilizado como un enfoque complementario para determinar precisamente cómo endoteliales determinantes biofísicas se traducen en cambios en la resistencia vascular y cómo ellos perfeccionar regulación del flujo de sangre en relación con las condiciones de salud enfermedad vs. .

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Disclosures

Los autores no declaran conflictos de interés.

Acknowledgments

Agradecemos a Charles Hewitt excelente asistencia técnica estableciendo equipos y suministros necesarios para los protocolos actuales. Agradecemos a los doctores Sean M. Wilson y Christopher G. Wilson, del centro de Biología Perinatal, LLU por facilitarnos un microscopio invertido adicional y un Electrómetro, respectivamente. Esta investigación ha sido apoyada por los institutos nacionales de salud beca R00-AG047198 (EJB) y nuevos fondos de puesta en marcha de Facultad Loma Linda escuela de medicina de la Universidad. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

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References

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Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto
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Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).More

Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

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